Este método pode ajudar no estudo do desenvolvimento cerebelar humano precoce e como ele pode ser alterado em distúrbios neuropsiquiátricos. A principal vantagem deste método é gerar células cerebelares humanas precoces em desenvolvimento em uma estrutura de camada 2D sem executar etapas complicadas. Também é rentável.
Fazer pipetas de tração pode ser complicado no início, mas com a prática e o tempo, fica mais fácil puxar as pipetas de uma maneira que será mais fácil de trabalhar. Comece a preparação experimental puxando uma pipeta Pasteur de 22,9 centímetros aproximadamente dois centímetros abaixo do pescoço, acima do queimador de bunsen para criar duas pipetas de vidro. O lado mais fino será aproximadamente quatro centímetros mais curto que o outro.
Dobre as pontas do lado puxado na chama para criar um R liso, em seguida, coloque as pipetas puxadas em mangas de autoclave e esterilize-as em uma autoclave. No dia zero, adicione um mililitro de meio de diferenciação cerebelar suplementado com 10 micromolares Y-27632 e SB-431542 a cada poço de uma placa de fixação ultrabaixa de seis poços, ou ULA, e coloque-a na incubadora até que as colônias levantadas estejam prontas para serem adicionadas aos poços. Limpe as células diferenciadas usando uma pipeta de vidro puxada.
Aspirar o meio e adicionar um milímetro de solução de passagem de iPSC para cada prato de 35 milímetros. Após três minutos de incubação a 37 graus Celsius, aspirar o meio e adicionar dois milímetros de meio de diferenciação cerebelar suplementado com 10 micromolares Y-27632 e SB-431542 Sob ampliação de 4x de um microscópio invertido de luz transmitida, levante as colônias usando a borda dobrada da pipeta de vidro puxada. Uma vez que cada colônia é levantada, transfira suavemente todas as colônias para um poço da placa ULA de seis poços usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros.
Repita este processo para cada placa iPSC e incube as células a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%. No segundo dia, adicione FGF2 a cada poço para ajustar uma concentração final de 50 nanogramas por mililitro. No sétimo dia, mude um terço do meio aspirando um mililitro de meio gasto e substituindo-o por um mililitro de meio de diferenciação cerebelar fresco.
Incubar os corpos embrionários por sete dias. No dia 14, gire a placa para reunir todos os corpos embrionários no centro da placa. Em seguida, incline a placa e aspirar todo o meio gasto usando um pipetter de 1000 microlitros da borda.
À medida que a quantidade média diminui, coloque lentamente a placa plana e continue a aspirar, deixando meio suficiente para evitar retirar os corpos embrionários. Em seguida, adicione três mililitros de meio de diferenciação cerebelar fresco suplementado com 10 micromolares Y-27632. Em seguida, transfira os corpos embrionários usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros para um prato revestido de laminina poli-L-ornitina.
No dia 15, aspirar o meio e substituí-lo por meio de diferenciação cerebelar fresco. No dia zero, as colônias de iPSC foram limpas e levantadas em meio de diferenciação cerebelar contendo SB-431542 e Y-27632 e colocadas em placas de fixação ultra-baixas para geração de corpos embrionários. A adição de FGF2 no segundo dia e uma mudança de 1/3 de meio no sétimo dia resultaram em corpos embrionários mostrando aumento no 14º dia.
As células começaram a migrar para fora dos corpos embrionários ao longo da superfície revestida no 15º dia. A mudança completa do meio para o meio de maturação cerebelar a partir do 21º dia resultou em uma monocamada de células com morfologia e complexidade neuronais até o 35º dia. A análise da expressão gênica no dia 35 revelou que as células expressam marcadores progenitores cerebelares precoces, como progenitores glutamatérgicos, ATOH1, progenitores GABAérgicos, PTF1 alfa e os marcadores de células progenitoras de Purkinje KIRREL2 e SKOR2.
Além disso, a expressão do marcador labial rômbico OTX2 e principalmente do neurônio anterior específico SIX3 também foram observados. A marcação imunofluorescente das células colhidas no 35º dia mostrou coloração positiva para os marcadores cerebelo EN2 e PTF1 alfa, o marcador neuronal beta tubulina III e o marcador de proliferação KI67. A coloração nuclear com 4'6-diamidino-2-fenilindol, ou DAPI, mostrou núcleos celulares.
Para uma diferenciação bem-sucedida, é crucial começar com colônias de iPSC saudáveis e indiferenciadas e usar reagentes que sejam o mais recém-reconstituídos possível.
