Este protocolo funciona com amostras de corações humanos e animais, mesmo após horas de tempo de transporte. Até 200 miócitos por miligrama podem ser isolados de fatias de tecido cortadas por vibratome. A análise eletrofisiológica, estrutural e bioquímica dos cardiomiócitos ajuda a descobrir e entender melhor, mecanismos de doenças cardíacas.
Depois de encher um prato de cultura tecidual de 100 milímetros, com 20 mililitros de solução de corte frio, coloque a amostra de tecido no prato de cultura. Mantenha o prato de cultura em um prato resfriado a 4 graus Celsius. Tenha em mente que amostras de tecido vivo de animais e especialmente humanos são potencialmente infecciosas.
Use tesoura ou bisturi, para remover o excesso de tecido fibroso e gordura epicárida, da amostra. Para o processamento ideal de vibratome de amostras de tecido maiores, use o bisturi para cortar cubos de oito milímetros do tecido. Para amostras menores de biópsias, isso não é necessário.
Pode-se identificar o epicárdio pela camada de gordura epicárida. Depois de remover o excesso de gordura, coloque o bloco de tecido, no prato, com o epicardium virado para baixo. Para se preparar para a incorporação de tecidos, ferva 400 miligramas de ponto de fusão baixo em dez mililitros de solução de corte.
Encha uma seringa de dez mililitros com o gel de agarose dissolvido quente. Sele a seringa e coloque-a em um banho de água de 37 graus Celsius por pelo menos 15 minutos, para permitir que a agarose se equilibre. Usando fórceps, mova a amostra de corte para um prato limpo de cultura de tecido de 35 milímetros, com o epicardium voltado para baixo.
Em seguida, remova o excesso de fluido do espécime, com um cotonete estéril. Proteja o espécime contra o movimento, segurando-o com fórceps. E esvaziar a seringa de agarose sobre ele, certificando-se de imergir completamente o espécime.
Imediatamente colocou o prato no gelo e deixe a agarose solidificar por 10 minutos. Monte uma lâmina de barbear nãousada no suporte da lâmina do vibratome. Se possível, calibrar o vibratome, ajustando a deflexão Z da lâmina.
Use um bisturi para extirpar um bloco de tecido de ágarose que se encaixe no porta-espécimes do vibratome. Para garantir a estabilidade, certifique-se de que o tecido ainda está suficientemente imerso em agarose. Com margens de agarose, de pelo menos oito milímetros.
Aplique uma fina camada de cola cianoacrilato no suporte da amostra. E pressione suavemente o bloco de tecido agarose, no suporte. Construa um banho de vibratome, com solução de corte.
Em seguida, encha o tanque de resfriamento externo do vibratome com gelo esmagado, para manter uma temperatura de quatro a seis graus Celsius, durante todo o processo de corte. Coloque o porta-amostras, contendo o bloco de tecido agarose, no banho de vibratome. Usando as configurações de vibratome descritas no manuscrito, gere 300 fatias de espessura de microliter.
É crucial criar seções em epicárdio paralelo porque é assim que as fibras de cardiomiócitos são alinhadas na parede ventricular. Caso contrário, haverá muito dano. Use um microscópio de luz padrão, para verificar o alinhamento dos cardiomiócitos e das fatias de tecido.
Para evitar danificar o tecido, segure a agarose, em vez do tecido em si. As fibras de cardiomiócitos devem ser uniformemente alinhadas e os miócitos, não devem ser contraídos. Coloque uma placa de calor no agitador de laboratório e aqueça-a a 37 graus Celsius.
Inicie o agitador de laboratório a 65 RPM. Dissolva a proteína em dois mililitros de solução um. E dissolver a colagem, em dois mililitros de solução um.
Mas não misture a proteinase e a colagemnase. Adicione cloreto de cálcio à solução de colagenase, para uma concentração final, de cinco micromolar. Incubar ambas as soluções a 37 graus Celsius.
Use fórceps para transferir uma fatia de tecido para um prato limpo de cultura de tecido de 60 milímetros. Com cinco milímetros de solução de corte pré-refrigerado. Mantendo o prato no gelo ou uma placa fria, remova cuidadosamente a agarose do tecido, usando uma lâmina ou fórceps.
Para realizar a lavagem inicial das fatias de tecido, coloque um prato limpo de cultura de tecido de 35 milímetros na lâmina de calor. E preenchê-lo, com dois milímetros de solução pré-aquecida um. Transfira uma ou duas fatias de tecido para o prato preparado.
Em seguida, use uma pipeta de um milímetro, para as etapas de lavagem. Depois de lavar as fatias, retire a solução um do prato e adicione dois mililitros da solução proteinase. Incubar as fatias por 12 minutos na lâmina de fogo, com o agitador a 65 RPM.
Lave as fatias de tecido mais duas vezes, com dois mililitros de solução pré-aquecida. Em seguida, remova a solução um do prato e adicione dois mililitros de solução de colagenase. Incubar as fatias por pelo menos 30 minutos na lâmina de fogo, com agitação a 65 RPM.
Após 15 minutos de incubação, verifique se há miócitos individuais gratuitos, examinando o prato sob um microscópio leve. Continue verificando a cada cinco minutos, até que os miócitos individuais sejam visíveis. Em seguida, alt digestão lavando as fatias duas vezes, com dois mililitros de solução pré-aquecida dois.
E reabastecer o prato, com dois mililitros de solução dois. Puxe cuidadosamente as fibras da fatia de tecido, usando fórceps finos. Continue trabalhando com cuidado, para evitar danificar os cardiomiócitos.
E pipeta várias vezes, com um único uso além de sua pipeta. Em seguida, confirme que os cardiomiócitos em forma de vara se separaram, examinando o prato, sob um microscópio leve. Coloque o prato de volta na placa de calor a 37 graus Celsius e agitar tremendo.
Adicionando soluções de cloreto de cloreto de cálcio de 10 milimiliar e 100 mililitros, aumente lentamente a concentração de cálcio da suspensão do tecido de cinco micromolar para 1,5 mililitro. Quando o aumento do cálcio estiver completo, use fórceps para remover quaisquer pedaços de tecido não digerido restantes. Primeiro, pare a agitação da suspensão.
Em seguida, usando uma pipeta de 1000 microliter, remova lentamente 1/3 da solução, do topo da suspensão. Evite aspiração dos cardiomiócitos. Em seguida, adicione 700 microliters de solução três, às células.
Após 10 minutos de agitação, repita estes passos de lavagem. Transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. E permitir que os cardiomiócitos sedimentem à temperatura ambiente, por um mínimo de 10 minutos e um máximo de 30 minutos.
Remova completamente o supernatante. E resuspenque a pelota em solução de tiraro ou no tampão de experimentação desejado. Usando um microscópio leve, verifique a qualidade da célula.
30 a 50% dos cardiomiócitos devem ser moldados por vara, lisos sem blebs de membrana. E exibição, estrias cruzadas claras. Para verificar a eficiência do isolamento, o protocolo foi aplicado ao miocárdio de rato.
E comparado com o isolamento via perfusão coronária e isolamento, de pequenos pedaços de tecido. Observou-se menor proporção de células em forma de haste ao utilizar o protocolo e, após o isolamento, por perfusão. Mas o número total ainda era alto.
Em contraste, o isolamento de pedaços de tecido, rendeu menos células em forma de vara. Citometria de fluxo, foi utilizada para comparar os resultados quantitativamente. O isolamento dos cardiomiócitos de fatias de tecido não atinge o rendimento obtido pela perfusão coronária.
Mas fornece, rendimentos significativamente maiores do que o isolamento do miócito, de pedaços de tecido. Em seguida, o protocolo foi aplicado ao miocárdio humano. Isolamento das fatias do miocárdio, rendeu números de Hyde e uma grande proporção de miócitos humanos em forma de vara.
E apenas uma pequena proporção de cardiomiócitos arredondados. O isolamento das fatias do miocárdio resultou em um número notavelmente maior de miócitos em forma de vara, do que o isolamento de pedaços de tecido. A quantificação fotométrica confirmou uma viabilidade de miocíte substancialmente maior após o isolamento das fatias do miocárdio.
As células humanas, isoladas com o protocolo descrito, podem ser submetidas à análise estrutural. A coloração de actinina alfa revelou um padrão de linha Z normal denso e um comprimento médio de sarcomere de 1,92 micrômetros, em cardiomiócitos de repouso. As manchas de LTCC e RyR mostraram que o aglomerado claro é co-localizado perto da membrana celular e dos túbulos T.
Os cardiomiócitos isolados eram excitáveis e poderiam ser utilizados para estudos sobre eletrofisiologia celular ou acoplamento de contração de excitação. A forma e duração potenciais de ação estavam na faixa relatada por outros, para cardiomiócitos ventriculares, de corações humanos em falência. Os transitórios de cálcio gravados pela linha vocal de Khan, mostraram um claro upstroke após a estimulação.
E, uma relação sinal aceitável para ruído. O encurtamento do cardiomiócito por contração pode ser visto a partir da deflexão da borda celular inferior. Devido ao alto número de cardiomiócitos isoladores obtidos por este protocolo, a cultura celular é possível.
Isso pode permitir transferência de genes, testes farmacológicos e engenharia tecidual de cardiomiócitos humanos. Uma aplicação importante, é a verificação de achados, a partir de modelos animais em células humanas. Insuficiência cardíaca é uma síndrome clínica com opções terapêuticas muito limitadas.
Técnicas aprimoradas de isolamento cardiomiócito ajudarão a identificar alvos celulares para diagnóstico e terapias futuras.
