Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para detectar focos induzidos por radiação de proteínas de reparação por manchas de imunofluorescência em linhas de células cancerígenas de cólon humano após a irradiação com o feixe misturado de nêutrons. A imagem de imunofluorescência é um método sensível e fornece evidências visuais para o aparecimento de proteínas da via de reparo em focos em resposta a agentes nocivos do DNA, como radiação ionizante. O feixe misto de nêutrons é usado na terapia de captura de nêutrons de boro, BNCT, e a resposta de dano de DNA induzida por radiação não foi totalmente estabelecida.
Nosso protocolo também pode ser útil para a análise de efeitos biológicos no nível celular devido à radiação por outros feixes de alta-LET, como prótons usando terapia de feixe de prótons ou íons de carbono usando terapia de háro. Após a irradiação, remova o meio das células anexadas e lave-as uma vez com 2,5 mililitros de PBS. Em seguida, fixar as células com um mililitro de 70% de etanol por 10 minutos.
Para permeabiliizar as células, remova o etanol e lave-as com 2,5 mililitros de PBS. Adicione suavemente um mililitro de 2% Triton X-100 em PBS para cobrir as tampas e incubar as células por cinco minutos em temperatura ambiente. Lave as células três vezes com PBS e bloqueie a permeabilização com um mililitro de 2%BSA diluído em PBS.
Em seguida, incubar as células por um mínimo de 30 minutos com o 2%BSA. Para colorir as células, adicione a quantidade adequada de anticorpo primário diluído em PBS com BSA, conforme recomendado no manuscrito do texto. Em seguida, cubra a placa de Petri e coloque-a em uma caixa de plástico com lignina hidratada para manter a umidade.
Incuba-o por 30 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, realize três lavagens com PBS e adicione a quantidade adequada de anticorpo secundário. Devolva o prato para a caixa de plástico com lignina hidratada, e incuba-o por pelo menos 30 minutos a 37 graus Celsius.
Em seguida, repita as lavagens com PBS e adicione 100 microliters de DAPI diluídos a uma concentração final de um micrograma por mililitro para neutralizar os núcleos. Incubar as células por um máximo de dois minutos em temperatura ambiente, e repetir as lavagens com PBS. Após a última lavagem, retire o PBS e coloque delicadamente uma mancha de cobertura em cima do meio de montagem, evitando a formação de bolhas de ar.
Sele as bordas da tampa com esmalte e deixe o meio de montagem endurecer antes de realizar microscopia de fluorescência. Os focos gama-H2AX, que são marcadores padrão para quebras duplas de DNA, foram detectados em células cancerígenas de cólon misturadas por nêutrons, irradiadas por feixes e não irradiadas. Os focos aparecem como pontos fluorescentes distintos.
Observou-se maior diâmetro de focos gama-H2AX nas células irradiadas. Além disso, uma única faixa de uma partícula alfa de alta-LET foi detectada cruzando os núcleos. A microscopia de imunofluorescência foi usada para detectar proteínas representativas de reparação Rad52 e quinase proteica dependente de DNA.
Um alto valor médio do diâmetro de focos de proteínas dependentes do DNA foi medido em quebras de DNA após a irradiação em comparação com as células de controle. Quebras de DNA agrupadas duplamente encalhadas foram observadas em células irradiadas como mais complexas, maiores e agrupadas com maior intensidade. O estágio mais importante da coloração da imunofluorescência é a fixação das células e a permeabilização da membrana celular.
Essas etapas são necessárias para permitir que os anticorpos penetrem facilmente nessas células e proteínas de reparação intracelulares. Este procedimento fornece informações sobre a ativação de cada via de reparo em um nível celular. Os resultados devem então ser confirmados em nível molecular usando um ensaio, como PCR em tempo real.
Essa técnica permite que os pesquisadores explorem a resposta de dano de DNA induzida por radiação, que não foi totalmente determinada no caso de diferentes feixes usando terapias anticancerígenas.
