Este é o primeiro protocolo para geração de cistos biliares, fornecendo uma análise sistemática que permite a avaliação da formação de cisto, eficiência e tamanho ao longo do tempo. Este método permite a avaliação quantitativa da formação de cisto epitelial, e permite avaliar esse processo em função do tipo de células epiteliais ou hidrogel. Uma vez que as opções terapêuticas para distúrbios biliares são limitadas, este protocolo abre as portas para a padronização de estudos medicamentosos, identificação de alvos terapêuticos normais e compreensão de mecanismos de doença.
O método simples permite que questões importantes sobre os mecanismos de novas informações dentro do campo de bioengenharia de estruturas tubulares sejam abordadas. Antes de iniciar um experimento, descongele uma solução de hidrogel apropriada a quatro graus Celsius e pontas de pipeta pré-frias e um deslizamento de câmara de oito poços a menos 20 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, coloque o hidrogel e um escorregador de oito câmaras de poços no gelo e adicione o volume apropriado de hidrogel ao frio normal de cholangiocito de rato completo para obter 500 microliters de solução de 40% de hidrogel.
Em seguida, use as pontas de pipeta fria para adicionar 50 microliters de solução de hidrogel ao centro de cada poço do escorregador da câmara e use uma ponta de pipeta para espalhar a solução sobre toda a superfície do fundo do poço o mais uniformemente possível sem bolhas. Para preparar as células para o experimento, enquanto o hidrogel está polimerizando, lave as células de uma cultura de collangiocito de rato normal 70% confluente com PBS pré-aquecido e incuba as células com cinco mililitros de PBS pré-aquecidos frescos por 20 minutos na incubadora de cultura celular. No final da incubação, substitua o PBS por um mililitro de Trypsin-EDTA pré-aquecido e devolva o frasco à incubadora de cultura celular por cinco a 10 minutos.
Quando as células se separarem, neutralize a reação com quatro mililitros de meio de colangiocito de rato normal pré-aquecido e transfira as células para um tubo de 15 mililitros para centrifugação. Em seguida, suspenda novamente a pelota em cinco mililitros de meio pré-aquecido e filtre as células através de um coador de 40 mícrons em um tubo de 50 mililitros para contar. Para gerar cistos, adicione o volume adequado de hidrogel ao meio de collangiocyte normal completo a frio para obter 1.600 microliters de uma solução de 80% de hidrogel no gelo e diluir as células a cinco vezes 10 a 5 células por mililitro de concentração média de collangiocito de rato normal frio em 1.600 microlitras de médio.
Misture imediatamente as soluções celulares e células hidrogel e adicione 400 microliters de células a cada poço do slide de câmara revestido de hidrogel, tomando cuidado para evitar bolhas. Para garantir a aquisição de resultados reprodutíveis e significativos, certifique-se de manusear o hidrogel cuidadosamente e misturar completamente a solução inicial de hidrogênio celular para obter uma solução homogênea. Quando todas as células tiverem sido semeadas, coloque o slide na incubadora de cultura celular.
Após dois dias na cultura, remova 250 microliters do meio de um canto de cada poço, tomando cuidado para não limpar o hidrogel, e substituir lentamente o supernanato descartado por 250 microliters de meio de cultura fresca. Para imagens de cisto, no dia apropriado da cultura, selecione o objetivo de 10 X em um microscópio de contraste de fase equipado com software de aquisição de imagem, ligue a lâmpada branca e selecione a opção de imagem brightfield. Selecione play para ligar a câmera e foque em um campo de cistos.
Defina o tempo de exposição e abra a janela da pasta de captura automática para permitir a salvação automática das imagens. Abra a janela da série Z de captura, reinicie a posição padrão e use o parafuso Z para definir as planícies superior e inferior da pilha Z, ajustando a etapa Z dependendo do objetivo e do nível de resolução. Em seguida, clique em executar agora para iniciar a aquisição.
Depois de imagens, abra a pilha Z em Fiji. Para duplicar a pilha, clique na imagem, duplicada e duplicada pilha. Para criar uma projeção de intensidade mínima a partir da pilha duplicada, sob o menu de imagem, selecione pilhas e projeto Z.
Selecione a intensidade mínima para o tipo de projeção e clique bem. Para subtrair o fundo da projeção, sob o menu do processo, selecione o fundo subtraído e selecione 500 pixels de raio de bola rolando e fundo de luz para tornar os cistos mais contrastados do que o fundo. Para medir o diâmetro aproximado do cisto, amplie o cisto direcionado, selecione a ferramenta de linha reta e pressione o botão T no teclado.
Desenhe uma linha através do diâmetro de cada cisto na projeção final. A próxima região de interesse criada para cada cisto será adicionada ao gestor da região de interesse. Quando todos os cistos tiverem sido contados, clique na janela Z-stack para selecioná-lo e clique em mostrar tudo para ver os cistos contados.
Mova o cursor ao longo da pilha Z para verificar se todos os cistos foram contados em cada imagem, adicionando novos cistos à região do gerente de interesse, conforme necessário. Quando todos os cistos tiverem sido contados, selecione a região de interesse definida e clique mais e salve para salvar os dados. Para determinar o tamanho de cada cisto, com as regiões de interesses ainda selecionadas, clique em medir.
Uma janela listando cada cisto e seu tamanho estimado aparecerá. Em seguida, salve os dados no formato CSV. Como demonstrado, o registro do número de cistos e seus respectivos tamanhos ao longo do tempo permite a análise da evolução da formação e crescimento de cistos.
A viabilidade da população celular inicial e dos cistos de 10 dias de idade podem ser avaliadas por coloração viva/morta. As células mortas representam menos de 3% da população celular no dia 10 e estão localizadas principalmente fora do cisto como células isoladas ou como parte de pequenos agregados, embora alguns detritos celulares necrosados sejam observados dentro de alguns cistos grandes. A incubação com diacetato fluoresceína e Hoechst permite a avaliação da formação e secreção de Fluoresceína do basal ao espaço luminal apical.
Notavelmente, a secreção de Fluoresceína é inibida pelo pré-tratamento com um inibidor resistente a vários medicamentos, indicando que o acúmulo de fluoresceína fluorescente dentro do lúmen é devido à secreção através do transportador resistente a vários medicamentos e não ao vazamento do espaço intercelular. A coloração para a expressão de E-cadherin revela que os cholangiocitos de ratos normais mantêm seu fenótipo epitelial no hidrogel por pelo menos 10 dias. Ao preparar os cistos para avaliação da imunofluorescência, manter a albumina de soro bovino em 0,1% ou menos durante a saturação é fundamental para manter a integridade do cisto, pois concentrações mais elevadas resultam em retração de cisto e colapso do lúmen.
Hidrogel durante a noite, descongelamento, ponta de pipeta e gravação de slides de câmara, trabalhando no gelo e espalhando a mistura de hidrogel celular homogêneo uniformemente no escorregador de câmara cultivado são todos fundamentais para o sucesso experimental. Este método pode ser usado para gerar cistos de outras células epiteliais ou hidrogéis, permitindo comparações para melhor compreensão da polarização epitelial. Este método quantitativo pode ser usado para testar os efeitos de drogas ou mutações genéticas na função biliar e organogênese.
