Este protocolo utiliza gravações intracelulares de motoneurons espinhais, para investigar diretamente a influência da estimulação de corrente direta trans-espinhal na função das redes espinhais. A maior vantagem dessa técnica é que ela permite que gravações intracelulares sejam realizadas em sistema nervoso totalmente maduro. Facilitando a tradução das observações experimentais para aplicações práticas.
Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, um rato Wistar macho anestesizado de seis meses de idade, use um microscópio dissecando e uma lâmina número 21, para fazer uma incisão longitudinal da pele do esterno para o queixo. E use dissecção contundente para expor a veia jugular certa. Coloque duas ligaduras 4-0 abaixo da seção da veia sem pontos de ramificação.
E faça um nó solto na extremidade proximal do segmento da veia. E um nó solto na extremidade distal do segmento. Fixar a veia proximal ao coração, e ligar a extremidade distal da veia.
Use uma tesoura de íris para fazer uma incisão entre o grampo e a ligadura distal. E, segurando um retalho da veia, introduza um cateter pré-preenchido ao ponto onde a veia é bloqueada pelo grampo. Em seguida, remova o grampo e empurre o cateter vários milímetros para dentro da veia.
Para uma colocação de tubo traqueal, use fórceps contundentes para separar as duas glândulas mandibulares que cobrem os músculos esternonióides. E separar os músculos esternohióides na linha média, para expor a traqueia. Coloque três ligaduras de 4-0 abaixo da traqueia, e faça dois nós abaixo do ponto de inserção do tubo traqueal e um nó acima.
Em seguida, insira um tubo traqueal na traqueia abaixo da terceira cartilagem traqueal. E fixe o tubo no lugar com as ligaduras pré-preparadas. Para dissecar os nervos do membro traseiro, use uma lâmina número 21 para fazer um corte longitudinal no lado posterior do membro traseiro esquerdo, do tendão de Aquiles até o quadril.
E use uma tesoura para fazer um corte entre as regiões anterior e posterior da fossa popliteal, na parte de trás da articulação do joelho. Corte duas cabeças do bíceps femoris, para expor o nervo ciático. E separar a cabeça lateral da cabeça medial do músculo gastrocnemius, para expor o nervo tibial e seus ramos.
Em seguida, use o número 55 fórceps, para dissecar cuidadosamente o gastrocnemius medial e os nervos gastrocnemius laterais e soleus. Desconectando-os dos tecidos circundantes, mantendo sua conexão com os respectivos músculos. Para realizar a laminectomia, use uma lâmina número 21 para fazer uma incisão longitudinal do sacro até as vértebras torácicas.
E identificar a vértebra Th13, como um segmento torácico mais baixo com uma inserção da costela. Em seguida, use rongeurs finos para remover os processos espinhosos e laminae das vértebras de Th13 para as vértebras L2, para expor os segmentos lombares da medula espinhal. Para fixar a coluna vertebral, coloque o rato em uma estrutura feita sob medida em uma almofada de aquecimento Celsius de 37 graus, conectada a um sistema de aquecimento de loop fechado.
E use os retalhos da pele para formar uma piscina profunda sobre a medula espinhal exposta. Coloque grampos metálicos abaixo dos processos transversais th12, e nos processos espinhosos L3, e encha a piscina com 37 graus Celsius de óleo mineral. Use os retalhos da pele para fazer uma piscina profunda de óleo mineral sobre os nervos tibial, gastrocnemius medial e gastrocnemius lateral e soleus.
E coloque os nervos em fios de prata bipolar estimulando eletrodos. Em seguida, conecte os eletrodos a um estimulador de pulso quadrado usando canais de estimulação separados para cada nervo. Para uma colocação de eletrodos de superfície, sob o microscópio dissecando, coloque um eletrodo de bola de prata no lado esquerdo caudal da medula espinhal exposta.
Com um eletrodo de referência inserido nos músculos das costas. E conecte ambos os eletrodos ao amplificador DC diferencial. Use um estimulador de corrente constante para estimular o gastrocnemius medial e os nervos gastrocnemius laterais e soleus, com pulsos quadrados de uma duração de 0,1 milissegundo repetida em uma frequência de três hertz e observar os voleios aferentes.
No final da simulação, mova o eletrodo superficial rostrally, e repita a estimulação para identificar os segmentos espinhais em que as amplitudes das voleios são as mais altas para cada nervo. Depois de determinar a localização do voleio máximo, entregue um bloqueador neuromuscular por via intravenosa para paralisar o rato. Enquanto um assistente conecta o tubo traqueal a um ventilador externo em linha com um nominador de tampa compatível com roedores.
Para abrir o dura e pia mater, use o número 55 fórceps para levantar suavemente a dura mater, e cortar o tecido caudally do segmento L5, rostrally até o segmento L4. Em seguida, use um par de fórceps ultra finos de 5SF, para fazer um pequeno patch na pia, cobrindo a coluna dorsal entre os vasos sanguíneos. Exatamente ao nível do voleio máximo diferente do gastrocnemius medial e gastrocnemius lateral e nervo soleus.
Para colocar os eletrodos de estimulação de corrente direta trans-espinhal, coloque uma esponja salina encharcada no lado dorsal das vértebras de Th12. E use uma boa manipulação para pressionar a esponja com um eletrodo de estimulação de corrente trans-espinhal ativa. Em seguida, monte um microeletrodo combinado personalizado, no micro manipulador, permitindo um movimento de piso de um a dois mícticos e calibração estereotaxica.
E dirija uma ponta de micropipette em um patch selecionado na pia, em um ângulo lateral medial de 15 a 20 graus. Para registrar a membrana de motoneuron e propriedades de disparo, no modo ponte do amplificador intracelular, estimular os respectivos ramos nervosos para identificar o motoneuron com base na aparência tudo ou nada, do potencial de ação antidrômica. No modo de fixação atual descontínua do amplificador intracelular com um modo de taxa de comutação atual de quatro a oito quilohertz, use um pulso de corrente intracelular de 0,5 milissegundos, para evocar um potencial de ação ortodôntica, no motoneuron.
Para calcular a resistência à entrada da célula, estimule um motoneuron, com 40 pulsos curtos de 100 milissegundos de hiperpolarização de uma corrente de nanograma. Para determinar o valor real da base como a amplitude mínima da corrente despolarizadora necessária para provocar um único pico, estimule um motoneuron com pulsos de onda quadrada de 50 milissegundos em amplitudes crescentes. Em seguida, injete pulsos de onda quadrada de 500 milissegundos de corrente despolarizadora, aumentando as amplitudes.
Em 0,1 a dois passos nano amp, para evocar descargas rítmicas de motoneurons. Para uma estimulação de corrente direta trans-espinhal, inicie os procedimentos de polarização por aplicação trans-espinhal de corrente direta, mantendo uma penetração estável do motoneuron. Aqui, um típico potencial de ação ortotrópica, evocado pela estimulação intracelular que atende a todos os critérios de inclusão de dados é mostrado.
Nesta análise, uma resposta celular a um pulso de corrente hiperpolarizadora de 100 milissegundos de um nanograma. A partir do qual a resistência de entrada de pico e platô de um motoneuron, pode ser determinada a partir da deflexão de tensão, pode ser observada. Este traço de tensão expandida de um pico básico real, exibe um limiar de tensão claramente marcado do pico.
Indicando o nível de despolarização da membrana em que os canais de sódio fechados de tensão são ativados para iniciar o potencial de ação. Estes gráficos fornecem exemplos de traços de tensão intracelular. De dois motoneurons, estimulados intracelularmente com pulsos quadrados de 500 milissegundos de corrente despolarizadora.
Antes, durante e depois de uma aplicação de estimulação de corrente direta trans-espinhal. A estimulação de corrente trans-espinhal anodal foi encontrada para atuar em direção a uma maior excitabilidade do motoneuron e maiores frequências de disparo rítmico. Enquanto a estimulação de corrente trans-espinhal cathodal, atuou para disparar a inibição.
Além disso, os efeitos de ambos os tipos de estimulação trans-espinhal direta da corrente, superaram o período de polarização. Dados imprecisos podem ser adquiridos, se os critérios de inclusão de dados forem comprometidos devido à penetração celular imperfeita. Falha em compensar a resistência e a capacitância da microeletrísmo ou uma instabilidade medular.
É imperativo que nenhum dano seja causado à medula espinhal durante a dissecção, pois a lesão pode resultar em choque espinhal, impossibilitando novas gravações. É possível colher amostras de tecido para análises químicas histológicas ou imunocitológicas. Por exemplo, a medição da expressão c-fos pode ser usada como um proxy da atividade neuronal.
