Este estudo foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China para Jovens Acadêmicos (52207254 e 82301657) e pelo Fundo de Ciência de Pós-doutorado da China (2022M711833).

O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais aprovou todos os experimentos com animais e os estudos foram conduzidos de acordo com as normas pertinentes de bem-estar animal.
1. Preparação dos animais
<ol><li>Animais<ol><li>Informações sobre alojamento: Ratos Sprague-Dawley machos domésticos (10-14 dias pós-natal, P10-P14) em um ambiente específico livre de patógenos. NOTA: As condições da sala foram mantidas em 20 °C ± 2 °C, umidade: 50%-60%, com um ciclo claro/escuro de 12 horas. Os animais tinham livre acesso a comida e água.</li>
		<li>Rotular os neurônios motores retrogradamente: Injetar Fluoro-Gold (FG) no músculo tibial anterior e gastrocnêmio bilateral (2% em solução salina estéril, 50 μL por músculo) para marcar retrogradamente os neurônios motores 2 dias antes do sacrifício.</li>
	</ol></li>
	<li>Soluções<ol><li>Preparar solução de corte: Misture 120 mM de cloreto de colina, 2,6 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 1,25 mM NaH 2 PO4, 0,5 mM CaCl 2, 7 mM MgCl2, 1,3 mM ácido ascórbico, 15 mM glicose. Pré-borbulhar a solução com 95% de O 2 e 5% de CO2 (ajustar para pH 7,4 com KOH) por 30 min antes da dissecção e fatiamento. Arrefecer a solução com gelo picado.</li>
		<li>Preparar líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF): Misturar 126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4; 1,3 mM MgCl 2, 2,4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 e 10 mM glicose. Pré-borbulhar a solução com 95% de O 2 e 5% de CO2 por 30 min antes da incubação.</li>
		<li>Preparar solução intracelular: Misturar 126 mM K-Gluconato, 2 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM Na 2 ATP, 0,4 mM Na2GTP, 10 mM K-Fosfocreatina e 0,5% Neurobiotina (pH 7,25 e 305 mOsm/Kg). Arrefecer a solução com gelo picado.</li>
		<li>Prepare o gel de agarose de baixo derretimento: Dissolva 4 g de agarose em 100 mL de solução de corte e use um rotor de agitação magnética para dissolvê-lo completamente. A 30 minutos antes de incorporar, aqueça a agarose de baixo ponto de fusão no forno de micro-ondas com alta potência por 1 min e, em seguida, transfira-a para um banho-maria de 39 °C para manter o estado líquido.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do instrumento<ol><li>Colocar gelo triturado na bandeja de perfusão (Figura 1A suplementar) 10 minutos antes da perfusão. Coloque a bandeja anatômica (Figura 1B Suplementar) e a bandeja de corte (Figura 1C Suplementar) com uma faixa de água a -80 °C com antecedência.</li>
		<li>Colocar a câmara de incubação com tela de nylon no forno a 45 °C durante a noite com antecedência.</li>
		<li>Use agarose de baixo ponto de fusão para pré-fabricar uma inclinação de 35° e uma plataforma de 2 mm de espessura (Figura 1D suplementar). Após a solidificação do gel, coloque-os no centro de uma placa de Petri de 35 mm para apoiar a medula espinhal nos próximos procedimentos.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfusão intracárdica<ol><li>Anestesiar os ratos com tribromoetanol a 2,5% (160 μL/10 g) por injeção intraperitoneal. Certifique-se de que os ratos estão totalmente anestesiados, verificando a falta de resposta a estímulos externos, como uma leve pitada do dedo do pé.</li>
		<li>Confirmada a anestesia adequada, colocar os ratos em decúbito dorsal e imobilizá-los na placa de Petri preenchida com sílica gel.</li>
		<li>Cortar uma incisão longitudinal de 5 mm na pele caudalmente ao processo xifoide e, em seguida, expandir completamente o espaço subcutâneo. Cortar uma incisão cutânea longitudinal de 2 cm ao longo da linha média ventral para expor completamente a parede torácica externa, começando com a incisão acima mencionada e terminando com o topo do tórax.</li>
		<li>Use uma pinça dentada para levantar o xifoide (Figura 2A Suplementar) e, em seguida, use uma tesoura fina para cortar o diafragma. Cortar o esterno em ambos os lados do processo xifoide para abrir o tórax e expor o coração (Figura 2B suplementar). OBS: Cuidado para preservar os vasos torácicos internos de ambos os lados; caso contrário, pode causar sangramento maciço.</li>
		<li>Use pinça desdentada para levantar o ventrículo esquerdo. Inserir uma agulha 22G no ápice do ventrículo esquerdo ao longo do eixo longitudinal do ventrículo esquerdo (Figura 2C suplementar). Enquanto isso, observe a pulsação rítmica do sangue no tubo de perfusão, ou a agulha pode perfurar o ventrículo direito, o que pode levar a um efeito de perfusão pobre. OBS: Pinça dentada não deve ser usada; caso contrário, pode causar vazamento de sangue extra do local de retenção da pinça.</li>
		<li>Use uma tesoura fina para cortar o átrio direito (Figura 2C suplementar) e, em seguida, injete manualmente 100 mL de líquido de perfusão gelado a uma taxa de cerca de 2 mL/s em 1 minuto. NOTA: Quando o fígado e as patas dos ratos ficam pálidos e não há sangue saindo do átrio direito, uma boa perfusão pode ser obtida.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissecção medular (Figura 1)<ol><li>Coloque o rato em decúbito ventral e corte a coluna vertebral na espinha ilíaca anterossuperior (cerca do nível vertebral de L4) e no ponto de deslocamento da curvatura da coluna torácica (aproximadamente ao nível vertebral de T6), respectivamente (Figura 1A). Em seguida, coloque imediatamente a coluna isolada na solução de perfusão gelada oxigenada para lavar o sangue residual e o tecido adiposo; Esse procedimento é benéfico para manter o campo operatório limpo nos procedimentos subsequentes. NOTA: Os músculos paraespinhais devem ser reservados, o que é propício para a posterior fixação da coluna vertebral usando um pino de inseto.</li>
		<li>Transfira imediatamente a coluna isolada para a bandeja anatômica (Figura 1B) com o dorso para cima e a extremidade rostral próxima ao operador. Preencher a moldeira anatômica com 50 mL de solução de corte continuamente oxigenada e gelada (Figura 1B).</li>
		<li>Use quatro pinos de insetos para fixar a coluna penetrando nos músculos paraespinhais (Figura 1B).</li>
		<li>Ao microscópio de dissecção, cortar os pedículos vertebrais de ambos os lados da extremidade rostral com a microtesoura, que pode ser denominada "laminectomia" (Figura 1C). Preste atenção para não danificar a medula espinhal. Enquanto isso, use a pinça microdentada para levantar o corpo vertebral cortado.</li>
		<li>Após a laminectomia, não separe a medula espinhal do canal espinhal imediatamente. Em vez disso, use uma microtesoura para cortar a dura-máter ao longo da linha média dorsal, o que é propício para a captação de nutrientes entre as células e ACSF oxigenada (Figura 1D). NOTA: Nunca rasgue a dura-máter. Só é permitido o corte da dura-máter por microtesoura; caso contrário, a raiz nervosa e o parênquima espinhal serão seriamente danificados!</li>
		<li>Levantar a parte rostral da medula espinhal e, em seguida, cortar cuidadosamente a raiz nervosa com cerca de 1 mm reservado (Figura 1E). Após separar a medula espinhal do canal vertebral, utilizar 2 pinos de insetos para fixar a medula espinhal com o lado ventral para cima (Figura 1F).</li>
		<li>Utilizar uma microtesoura para cortar a dura-máter ao longo da linha média ventral (Figura 1F). Cortar as raízes nervosas redundantes com cerca de 1 mm reservado. NOTA: O nervo é muito mais tenaz do que a medula espinhal. Se a raiz nervosa reservada for muito longa (>1 mm), o vibratome não pode cortar a raiz nervosa, o que pode levar a uma ruptura grave no parênquima espinhal.</li>
		<li>Utilizar uma microtesoura para separar o alargamento lombar até um comprimento de 6-7 mm (Figura 1G).</li>
	</ol></li>
	<li>Incorporação na agarose de baixo derretimento<ol><li>Colocar o alargamento lombar na inclinação de 35° (Figura 1H) com a face dorsal para cima e a extremidade caudal para baixo. Use um papel de filtro absorvente para remover água abundante na superfície do tecido (Figura 1H).</li>
		<li>Despeje lentamente o gel de agarose derretido na placa de Petri contendo o aumento lombar (Figura 1I). NOTA: Não despeje muito rápido, ou bolhas se acumularão no gel.</li>
		<li>Coloque a placa de Petri acima na mistura de água gelada para resfriar o gel o mais rápido possível, o que é propício para manter a atividade das células.</li>
		<li>Aparar o gel em um cubo de 15 mm x 10 mm x 10 mm e montá-lo no disco da amostra com supercola (Figura 1J).</li>
	</ol></li>
	<li>Cortar<ol><li>Coloque o disco da amostra na bandeja de corte pré-congelada e, em seguida, despeje a solução de corte gelada (Figura 1K). Borbulhar continuamente com 95% CO 2 e 5% O2 na bandeja de corte.</li>
		<li>Defina os parâmetros do vibratom: espessura: 350 μm; velocidade: 0,14-0,16 mm/s, amplitude: 1,0 mm e frequência de vibração: 85 Hz.</li>
		<li>Colha 2-3 fatias adequadas por animal. Registre 1-2 neurônios motores FG+ saudáveis por fatia, com uma faixa de 5-6 células por animal.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubação<ol><li>Use uma pinça deslizante para prender um corte (Figura 1L) e colocá-lo na câmara de incubação preenchida com ACSF continuamente oxigenada. Colocar a câmara de incubação em banho-maria a 32 °C durante 30 minutos e, em seguida, continuar a incubá-la à temperatura ambiente (TR) durante mais 30 minutos antes do registo. NOTA: Os procedimentos acima, desde a anestesia até a obtenção do primeiro corte, devem ser concluídos dentro de 20-30 min para manter a viabilidade das células tanto quanto possível. Os neurônios motores em cada fatia podem manter sua viabilidade por aproximadamente 6-7 h.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Gravação de patch clamp com SCS (Figura 2)
<ol><li>Preparações<ol><li>Perfundir a câmara de gravação com ACSF continuamente borbulhada a uma taxa de cerca de 1-2 mL/min. Ajuste a vazão individualmente através do painel de controle da bomba peristáltica.</li>
		<li>Coloque uma fatia na câmara de gravação. Use o fio de platina em forma de U com fios de nylon para estabilizar firmemente a fatia no lugar.</li>
		<li>Use um microscópio de contraste de interferência diferencial infravermelho (IR-DIC) para observar o corte. Sob a lente objetiva 4x, confirme se o comprimento da raiz dorsal é de cerca de 1 mm. Encontre a área onde a raiz dorsal entra no parênquima e, em seguida, mova o campo de visão central para esta área.</li>
		<li>Conecte o gerador de pulsos com eletrodos feitos sob medida (Figura 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>Configuração do SCS<ol><li>Colocar o ânodo do SCS próximo à linha média dorsal através do sistema de micromanipulação (Figura 2B).</li>
		<li>Colocar o cátodo do SCS próximo à zona de entrada da raiz dorsal (DREZ) através do sistema de micromanipulação (Figura 2B).</li>
	</ol></li>
	<li>Segmentação e geração de imagens de células<ol><li>Use IR-DIC com uma lente objetiva de 10x encontrar aproximadamente a região dorsolateral da coluna motora, onde a maioria dos neurônios motores estão localizados. Em seguida, mova o campo de visão central para esta área.</li>
		<li>Mude para uma lente objetiva de 60x para encontrar um neurônio saudável com uma superfície lisa e brilhante e núcleos invisíveis (Figura 2C,F).</li>
		<li>Diminua ligeiramente a intensidade do infravermelho e ligue a fonte de luz de fluorescência. Alternar o filtro de luz para o filtro de excitação ultravioleta de banda larga (Figura 2D,G), para selecionar um neurônio motor FG-positivo (FG+) apropriado (Figura 2E,H).</li>
		<li>Use eletrodos de sucção para aplicar estimulação do limiar motor de 1x na raiz dorsal. Se um potencial de ação evocado é detectado nos neurônios motores (Figura 3 Suplementar), confirma-se que a atividade da raiz dorsal está intacta. Caso contrário, essa fatia deve ser descartada.</li>
	</ol></li>
	<li>Gravação de patch-clamp<ol><li>Encha a micropipeta com a solução intracelular e insira-a no suporte do eléctrodo. Use o sistema de micromanipulação para abaixar a pipeta para o banho de ACSF. A resistência da pipeta varia de 5-8 MΩ.</li>
		<li>Aplique uma pequena quantidade de pressão positiva na pipeta para soprar a poeira e os detritos celulares.<ol><li>Abaixe o eletrodo para se aproximar da célula. Quando a pipeta toca a superfície do neurônio FG+, um pequeno recuo da membrana torna-se visível ao nível da ponta. Solte a pressão positiva.</li>
			<li>Em seguida, aplique uma pequena quantidade de pressão negativa na pipeta usando uma seringa. Isso cria uma pequena quantidade de sucção que puxa a membrana celular em contato com a pipeta de vidro. Sempre preste atenção à resistência total na interface do software até que o valor da resistência aumente para gigaohms (>1 GΩ). Em seguida, o gigaseal é formado.</li>
		</ol></li>
		<li>Aperte o potencial de membrana a -70 mV e, em seguida, pressione o botão de compensação rápida de capacitância na interface de software do amplificador. Aplique suavemente uma pressão negativa transitória para romper a membrana celular e, em seguida, pressione o botão de compensação de capacitância lenta na interface de software do amplificador. Neste ponto, uma boa configuração de célula inteira é obtida.</li>
		<li>Alterne para o modo de fixação de corrente clicando no botão IC na interface do software e registre o potencial de membrana de repouso (RMP).</li>
		<li>Aplicar o SCS por 1-2 s com amplitude de 1-10 mA, enquanto a largura e a frequência de pulso são fixadas em 210 μs e 40 Hz, respectivamente. Determinar o limiar motor aumentando lentamente a amplitude de estimulação até que a primeira PA seja observada.</li>
		<li>Distinguir neurônios motores de disparo retardado e imediato usando uma injeção de corrente despolarizante de 5 s ao redor da reobase no modo de pinça de corrente10,11,12. Neurônios motores de disparo imediato: A baixa reobase pode induzir disparos imediatos e repetitivos com frequência de disparo estável; Neurônios motores de disparo tardios: A reobase alta pode induzir um início tardio para disparos repetitivos com uma taxa de disparo acelerada (Figura 3).</li>
		<li>Quando o SCS estiver desligado, continue a registrar o potencial de membrana para capturar os APs disparando espontaneamente.</li>
		<li>Execute gravações de clamp de voltagem para corrente pós-sináptica excitatória (EPSC) quando o SCS estiver ligado e desligado. O parâmetro de estimulação é 1x limiar motor, 210 μs, 2 Hz.</li>
	</ol></li>
</ol>

Compreendendo as respostas do neurônio motor à estimulação da medula espinhal

<ol>
	<li>Rowald, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+spinal+cord+neuromodulation+rapidly+restores+trunk+and+leg+motor+functions+after+complete+paralysis.">Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis.</a> Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).</li><li>Kathe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurons+that+restore+walking+after+paralysis.">The neurons that restore walking after paralysis.</a> Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).</li><li>Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. 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S., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+excitation+between+motoneurones+propagates+across+segments+and+is+purely+glutamatergic.">Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic.</a> PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).</li><li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+intrinsic+hyperexcitability+does+not+contribute+to+motoneuron+degeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Elife. 3, 04046 (2014).</li><li>Tahir, R. A., Pabaney, A. 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(70), e4312 (2012).</li><li>Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonhomogeneous+volume+conduction+effects+affecting+needle+electromyography:+an+analytical+and+simulation+study.">Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study.</a> Physiological Measurement. 42 (11), (2021).</li><li>Barra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidural+electrical+stimulation+of+the+cervical+dorsal+roots+restores+voluntary+upper+limb+control+in+paralyzed+monkeys.">Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys.</a> Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).</li><li>Powell, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidural+stimulation+of+the+cervical+spinal+cord+for+post-stroke+upper-limb+paresis.">Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis.</a> Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).</li><li>Wenger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+neuromodulation+therapies+engaging+muscle+synergies+improve+motor+control+after+spinal+cord+injury.">Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury.</a> Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).</li><li>&#214;zyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+longitudinal+lumbar+spinal+cord+preparations+to+study+sensory+and+recurrent+motor+microcircuits+of+juvenile+mice.">In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice.</a> Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).</li><li>Moraud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+the+neuromodulation+of+spinal+circuits+for+correcting+gait+and+balance+deficits+after+spinal+cord+injury.">Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury.</a> Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).</li><li>Capogrosso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+model+for+epidural+electrical+stimulation+of+spinal+sensorimotor+circuits.">A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits.</a> Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).</li></ol>

A informação do movimento modulada pela SCS é finalmente convergente para os neurônios motores. Portanto, tomar os neurônios motores como alvo da pesquisa pode simplificar o desenho do estudo e revelar o mecanismo de neuromodulação da SCS mais diretamente. Para registrar simultaneamente diversas características de estímulos e respostas celulares, um patch-clamp é um bom método para estudar as características eletrofisiológicas em escala unicelular. No entanto, ainda existem algumas dificuldades, incluindo co...

A estimulação da medula espinhal (ECS) pode efetivamente restaurar a função locomotora após a lesão medular (LME). Andreas Rowald e col. relataram que a ECS possibilita a função locomotora e do tronco dos membros inferiores em um único dia1. Explorar o mecanismo biológico da SCS para recuperação locomotora é um campo de pesquisa crítico e de tendência para o desenvolvimento de uma estratégia SCS mais precisa. Por exemplo, a equipe de Grégoire Courtine demonstrou que o interneurônio excitatório Vsx2 e os neurônios Hoxa10 na medula espinhal são os neurônios-chave para responder à SCS, e a neuromodulação célula-específica é viável para restaurar a capacidade de andar do rato após a LME2. No entanto, poucos estudos enfocam o mecanismo elétrico da SCS em escala unicelular. Embora seja bem conhecido que o estímulo de corrente contínua supralimiar pode eliciar os potenciais de ação (PAs) no experimento clássico com lulas 3,4,5, ainda não está claro como a estimulação elétrica alternada pulsada, como a ECS, afeta a geração do sinal motor.
Dada a complexidade dos circuitos neurais intraespinhais, a seleção apropriada para a população celular é importante para investigar o mecanismo elétrico da SCS. Embora o ECS restaure a função motora ativando a via proprioceptiva6, os neurônios motores são a unidade final para executar o comando motor, derivado da integração da entrada aferente de informações proprioceptivas7. Portanto, estudar diretamente as características elétricas dos neurônios motores com SCS pode nos ajudar a entender a lógica subjacente da modulação motora espinhal.
Como sabemos, patch-clamp é o método padrão-ouro para registro eletrofisiológico celular com resolução espaço-temporal extremamentealta8. Portanto, este estudo descreve um método que utiliza um patch clamp para estudar as respostas elétricas dos neurônios motores à SCS. Comparado com o patch-clamp9 do cérebro, o patch-clamp da medula espinhal é mais difícil devido aos seguintes motivos: (1) A medula espinhal é protegida pelo canal vertebral com volume minúsculo, o que requer micromanipulação muito fina e manutenção rigorosa do gelo para obter melhor viabilidade celular. (2) Como a medula espinhal é muito fina para ser fixada na bandeja de corte, ela deve ser imersa em agarose de baixo ponto de fusão e aparada após a solidificação.
Assim, este método fornece detalhes técnicos na dissecção da medula espinhal e na manutenção da viabilidade celular ao mesmo tempo, de modo a estudar suavemente o mecanismo elétrico da SCS em neurônios motores e evitar tentativas e erros desnecessários.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slide tweezers</td>
			<td>VETUS</td>
			<td>36A-SA</td>
			<td>Clip a slice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>S12006-10</td>
			<td>Cut the diaphragm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Light Source</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>U-HGLGPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gold</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>Label the motor neuron</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infrared CCD camera</td>
			<td>Dage-MTI</td>
			<td>IR-1000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument&#160;</td>
			<td>MP-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>P1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-scissors&#160;</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>wa1020</td>
			<td>Laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope for anatomy</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>SZX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope for ecletrophysiology</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-toothed tweezers</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F11008-09</td>
			<td>Lift the cut vertebral body</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V900182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens for ecletrophysiology</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>LUMPLFLN60XW</td>
			<td>working distance 2 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer&#160;</td>
			<td>Advanced&#160;</td>
			<td>FISKE 210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier&#160;</td>
			<td>Axon&#160;</td>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp digitizer</td>
			<td>Axon&#160;</td>
			<td>Digidata 1550B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter&#160;</td>
			<td>Mettler Toledo&#160;</td>
			<td>FE28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Anchor</td>
			<td>Multichannel system</td>
			<td>SHD-27H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinal cord stimulatior</td>
			<td>PINS</td>
			<td>T901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothed tweezer</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F13030-10</td>
			<td>Lift the xiphoid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide band ultraviolet excitation filter</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>U-MF2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the ex vivo preparation of spinal cord slice for the whole-cell patch-clamp recording in motor neurons during spinal cord stimulation

A estimulação da medula espinhal (ECS) pode efetivamente restaurar a função locomotora após a lesão medular (LME). Como os neurônios motores são a unidade final para executar comportamentos sensório-motores, estudar diretamente as respostas elétricas dos neurônios motores com SCS pode nos ajudar a entender a lógica subjacente da modulação motora espinhal. Para registrar simultaneamente diversas características de estímulos e respostas celulares, um patch-clamp é um bom método para estudar as características eletrofisiológicas em escala unicelular. No entanto, ainda existem algumas dificuldades complexas para atingir esse objetivo, incluindo a manutenção da viabilidade celular, a separação rápida da medula espinhal da estrutura óssea e o uso do SCS para induzir com sucesso potenciais de ação. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado usando patch-clamp para estudar as respostas elétricas dos neurônios motores à SCS com alta resolução espaço-temporal, o que pode ajudar o pesquisador a melhorar suas habilidades em separar a medula espinhal e manter a viabilidade celular, ao mesmo tempo em que estuda suavemente o mecanismo elétrico da SCS no neurônio motor e evitar tentativas e erros desnecessários.

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Andreas Rowald et al. reported that SCS enables lower limb locomotor and trunk function within a single day1. Exploring the biological mechanism of SCS for locomotor recovery is a critical and trending research field for developing a more precise SCS strategy. For example, Gr&#233;goire Courtine&#39;s team demonstrated that excitatory Vsx2 interneuron and Hoxa10 neurons in the spinal cord are the key neurons to response to SCS, and cell-specific neuromodulation is feasible to restore the rat walking ability after SCI2. However, few studies focus on the electrical mechanism of SCS at a single-cell scale. Although it is well-known that the suprathreshold direct current stimulus can elicit the action potentials (APs) in the classic squid experiment3,4,5, how the pulsed alternating electrical stimulation, such as SCS, affects the motor signal generation is still unclear.
Given the complexity of intraspinal neural circuits, appropriate selection for cell population is important for investigating the electrical mechanism of SCS. Although SCS restores motor function by activating the proprioceptive pathway6, the motor neurons are the final unit to execute the motor command, derived from integrating proprioception information afferent input7. Therefore, directly studying the electrical characteristics of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation.
As we know, patch-clamp is the golden-standard method for cellularly electrophysiological recording with extremely high spatiotemporal resolution8. Therefore, this study describes a method using a patch clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS. Compared with the brain patch-clamp9, the spinal cord patch-clamp is more difficult due to the following reasons: (1) The spinal cord is protected by the vertebral canal with tiny volume, which requires very fine micromanipulation and rigorous ice-cold maintenance to obtain better cell viability. (2) Because the spinal cord is too slender to be secured on the cutting tray, it should be immersed in low-melting point agarose and trimmed after solidification.
Hence, this method provides technical details in dissecting the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time so as to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neurons and avoid unnecessary trials and mistakes.

Autor em destaque: Avançando a estimulação da medula espinhal - explorando as respostas celulares dos neurônios motores por meio da eletrofisiologia do patch-clamp 

A Preparação Ex Vivo do Corte da Medula Espinhal para o Registro de Patch-Clamp de Células Inteiras em Neurônios Motores Durante a Estimulação da Medula Espinhal

Spinal cord stimulation can help patients resolve most motion functions after injury. Most neurons are to execute sensory mode behaviors. Studying the electric response of most neurons can aid in understanding the underlying logic of spinal load neuromodulation.A patch clamp is the golden standard method for cellular electrophysiological recordings with the extremely high spatial temporal resolution. Therefore, this study describes a method using a patch clamp to simultaneously record the aortas stimulus characteristics and cellular responses of motor neurons at a single-cell scale. Compared with the brain patch clamp, the spinal cord patch clamp is more difficult, because the spinal cord is well protected by the vertebral canal with tiny volume.Therefore, this protocol provides technical details in quickly micro dissecting the spinal cord and reverse maintenance to obtain better cell viability. Patch clamp allows a unique understanding of the synaptic transmissions and the understanding of action potentials, coding pattern activities by the spinal cord stimulation.

Graças à rigorosa manutenção a baixa temperatura durante a operação fina (Figura 1 Suplementar, Figura 2 Suplementar e Figura 1), a viabilidade celular foi boa o suficiente para realizar registros eletrofisiológicos subsequentes. Para simular ao máximo o cenário clínico, utilizamos a micromanipulação para posicionar o cátodo e o ânodo do SCS próximos à linha média dorsal e ao EDRED, respectivamente (Figura 2), o que poderia inic...

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Este protocolo descreve um método que utiliza um patch-clamp para estudar as respostas elétricas dos neurônios motores à estimulação da medula espinhal (SCS) com alta resolução espaço-temporal, o que pode ajudar os pesquisadores a melhorar suas habilidades em separar a medula espinhal e manter a viabilidade celular simultaneamente.

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...

A estimulação da medula espinhal pode ajudar os pacientes a resolver a maioria das funções de movimento após a lesão. A maioria dos neurônios deve executar comportamentos de modo sensorial. Estudar a resposta elétrica da maioria dos neurônios pode ajudar na compreensão da lógica subjacente da neuromodulação da carga espinhal.A pinça de remendo é o método padrão-ouro para registros eletrofisiológicos celulares com altíssima resolução espaço-temporal. Portanto, este estudo descreve um método que utiliza um patch clamp para registrar simultaneamente as características do estímulo da aorta e as respostas celulares dos neurônios motores em escala unicelular. Em comparação com a pinça do remendo cerebral, a pinça do remendo da medula espinhal é mais difícil, porque a medula espinhal é bem protegida pelo canal vertebral com volume minúsculo.Portanto, este protocolo fornece detalhes técnicos na microdissecação rápida da medula espinhal e manutenção reversa para obter melhor viabilidade celular. Patch clamp permite uma compreensão única das transmissões sinápticas e a compreensão dos potenciais de ação, codificando atividades padrão pela estimulação da medula espinhal.

the-ex-vivo-preparation-spinal-cord-slice-for-whole-cell-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

1.4K visualizações.  Tsinghua University. A estimulação da medula espinhal pode ajudar os pacientes a resolver a maioria das funções de movimento após a lesão. A maioria dos neurônios deve executar comportamentos de modo sensorial. Estudar a resposta elétrica da maioria dos neurônios pode ajudar na compreensão da lógica subjacente da neuromodulação da carga espinhal.A pinça de remendo é o método padrão-ouro para registros eletrofisiológicos celulares com altíssima resolução espaço-temporal. Portanto, este...

Vídeo: Autor em destaque: Avançando a estimulação da medula espinhal - explorando as respostas celulares dos neurônios motores por meio da eletrofisiologia do patch-clamp 

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to execute sensorimotor behaviors, directly studying the electrical responses of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation. To simultaneously record diverse stimulus characteristics and cellular responses, a patch-clamp is a good method to study the electrophysiological characteristics at a single-cell scale. However, there are still some complex difficulties in achieving this goal, including maintaining cell viability, quickly separating the spinal cord from the bony structure, and using the SCS to successfully induce action potentials. Here, we present a detailed protocol using patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS with high spatiotemporal resolution, which can help researcher improve their skills in separating the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neuron and avoid unnecessary trial and mistake.

This protocol describes a method using a patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to spinal cord stimulation (SCS) with high spatiotemporal resolution, which can help researchers improve their skills in separating the spinal cord and maintaining cell viability simultaneously.

Neurociência

Spinal Cord Dissection for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons

After exposing the heart of an anesthetized rat, cut the right atrium using fine scissors and inject 100 milliliters of chilled perfusing fluid at approximately two milliliters per second within one minute. Position the rat in the prone position. Cut the spine at the anterior superior iliac spine and the curvature shifting point of the thoracic column.Immediately place the isolated spine into the oxygenated ice cold perfusing solution to wash off residual blood and fat tissue. Then transfer the isolated spine to the anatomical tray with its dorsal side up and the rostral end near the operator. Fill the tray with 50 milliliters of continuously oxygenated ice cold cutting solution.Under a dissection microscope, cut the vertebral pedicles on both sides from the rostral end using micro scissors. Next, delicately sever the dura mater along its dorsal midline with micro scissors. Lift the rostral part of the spinal cord carefully and cut the nerve root, leaving about one millimeter reserved.After the spinal cord has been separated from the vertebral canal, secure it with the ventral side facing up using two insect pins. Trim any excessive nerve roots, leaving about one millimeter intact. Then separate the lumbar enlargement to a length of six to seven millimeters using a micro scissor.

Dissecção da Medula Espinhal para o Registro de Patch-Clamp de Células Inteiras em Neurônios Motores

Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons

After dissecting the spinal cord and separating the lumbar enlargement, place the lumbar enlargement on a 35 degree slope with the dorsal side up and the caudal side down. Absorb any excess water on the tissue surface using an absorbent filter paper. Carefully pour the molten agarose gel into the Petri dish containing the lumbar enlargement.Position the Petri dish in the ice water mixture to ensure rapid gel cooling. Shape the gel into a cube of 15 by 10 by 10 millimeters, and mount it onto the specimen disc using super glue. Adjust the vibratome settings to a thickness of 350 micrometers, a speed of 0.14 to 0.16 millimeters per second, an amplitude of one millimeter, and a vibration frequency of 85 hertz.Now, use the cover slide tweezers to clip a slice and place it into the incubation chamber, filled with continuously oxygenated artificial cerebrospinal fluid.

Preparação de Corte de Medula Espinhal para o Registro de Patch-Clamp de Células Inteiras em Neurônios Motores

Patch-Clamp Recording to Study the Electrical Responses of Motor Neurons to Spinal Cord Stimulation

To begin, place the prepared spinal cord slice in the recording chamber. Then place the anode of the micro-manipulation system near the dorsal midline in the cathode close to the dorsal root entry zone for proper spinal cord stimulator positioning. Now switch to a 60X objective lens to identify a healthy neuron having a smooth and bright surface without visible nuclei.Slightly decrease the infrared intensity, turn on the fluorescent light source, and adjust the light filter to the wideband ultraviolet excitation option. Now, select an appropriate Fluoro-Gold-positive motor neuron and gradually lower the electrode until it is near the neuron. As the pipette contacts its surface, look for a small membrane indentation at the tip level and release the previously-applied positive pressure.Then apply negative pressure to the pipette using a syringe and wait until the resistance value rises to gigaohms on the software interface. Clamp the membrane potential at minus 70 millivolts. Press the fast capacitance compensation button on the amplifier's software interface, then apply a brief negative pressure to rupture the cell membrane and press the slow capacitance compensation button on the amplifier's software interface.Apply the spinal cord stimulation for one to two seconds keeping the amplitude between one and 10 milliamperes. Determine the motor threshold by gradually increasing the stimulation amplitude until the first action potential is observed. Distinguish delayed and immediate firing motor neurons using a five-second depolarizing current injection around rheobase in the current clamp mode.After turning off the spinal cord stimulation, continue recording the membrane potentials to capture the spontaneous action potentials firing. When the amplitude of spinal cord stimulation was raised, the membrane potential was increased, and the action potentials were triggered every 10 to 20 pulses. After the spinal cord stimulation was turned off, the neuron fired a series of spontaneous action potentials for a short period of time.Then, the resting membrane potential returned to minus 65 millivolts.