Nada disso teria sido possível sem o apoio de Nasser Rusan. Gostaria de agradecer a H. Doug Morris, Danielle Donahue e Brenda Klaunberg do NIH Mouse Imaging Facility e Ben Ache da Micro Fotônica pelo treinamento e discussão útil. Agradeço também a Mansoureh Norouzi Rad de Zeiss por escanear amostras de abdômen no Xradia 520 Versa. Lauren Smith, Samantha Smith e Rachel Ng também ajudaram na varredura. Mike Marsh, da Object Research Systems, forneceu suporte técnico dragonfly. Também sou grato pelo apoio do National Heart, Lung, and Blood Institute (1K22HL137902-01) e start up funds da Universidade de Wyoming. Agradeço também aos revisores anônimos por suas sugestões e comentários úteis.

1. Seleção de amostras e preparação de cutículas
<ol><li>Escolha o ponto de tempo de desenvolvimento adequado (embrião, larva, pupa ou adulto) para imagem.<ol>
<li>Para os estágios embrionários, as fêmeas da gaiola em pratos de ágar de suco de uva manchados com pasta de levedura e coletam ovos a cada 30-60 min. Deixe esses embriões se desenvolverem a 25 °C até que o estágio adequado seja alcançado.</li>
		<li>Para estágios larvais, colete primeiro e segundo instars de experimentos cronometrados de coleta de embriões. Escolha diretamente 3estrelas errantes do lado do frasco de comida em condições não lotadas.</li>
		<li>Para o tempo pupal, colete pré-pupas brancas (espirros invertidos) e anote o momento em que a cutícula começa a dourar. Os animais progredirão através de 15 estágios de desenvolvimento pupal em momentos definidos após o browning da cutícula e podem ser coletados emconformidade com 42.</li>
		<li>Coletar adultos como virgens após o fechamento e permitir envelhecer em um frasco de alimentos por um período necessário de tempo (por exemplo, 5 dias para o desenvolvimento completo do intestino).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfira 5-50 animais para um tubo de microcentrifus de 1,5 mL contendo 1 mL de 0,5% Triton X-100 em 1x Salina Tamponada fosfato (0,5% PBST). Enquanto toca o tubo periodicamente no topo do banco, incuba por 5 minutos à temperatura ambiente (RT) para auxiliar na remoção do revestimento hidrofóbico e permitir que os animais fiquem totalmente submersos.<ol>
<li>Para estágios embrionários, larvais e pupais, prendam o desenvolvimento adicionais colocando o tubo em um bloco de calor definido para 100 °C para 20 s seguido de resfriamento em RT por 5 min. NOTA: Os animais também podem ser congelados em nitrogênio líquido37.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fixação e coloração
<ol><li>Remova 0,5% PBST e adicione 1 mL da Solução bouin. Tubo de torneira para garantir que os animais estejam totalmente submersos. ATENÇÃO: A Solução de Bouin contém formaldeído. Pode causar toxicidade aguda à pele e aos olhos se derramado e pode ser fatal se engolido. Use luvas, óculos de segurança e um jaleco ao manusear. NOTA: Técnicas adicionais de fixação também podem ser empregadas, como o uso de etanol. Os méritos de outros fixativos são descritos detalhadamente no ref.1,30.<ol>
<li>Para embriões e amostras adultas, incubar no banco por 16-20 h na RT.</li>
		<li>Para amostras de larvas e pupal, fixar animais por 2 h na RT. Descarte a solução de Bouin e lave com 1x PBS por 5 minutos três vezes. Transfira para um prato de dissecação multi-bem contendo 1x PBS e use um pequeno pino minutien preso a um suporte para fazer um orifício na cutícula anterior e posterior, tomando cuidado para não interromper nenhum tecido mole subjacente.</li>
		<li>Transfira amostras de larvas e pupal de volta para um tubo de microfuge e adicione 1 mL de solução fresca de Bouin. Incubar no banco por 24 h na RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova a solução de Bouin e lave a amostra por 30 min com 1 mL de tampão de lavagem μ-CT (0,1 M Na2HPO4, 1,8% sacarose) ou 1x PBS três vezes.</li>
	<li>Adicione 1 mL da solução de coloração apropriada e incubar no banco por 2-7 dias. NOTA: A escolha da mancha dependerá de muitos fatores, mas geralmente é um equilíbrio entre penetração, tempo de incubação e resolução. Em geral, o ácido fosfotungstic (PTA) fornece contraste superior e resolução de tecido mole, mas requer interrupção mecânica da cutícula e tempos de incubação mais longos. Os méritos de diferentes tipos de manchas são descritos detalhadamente no ref.1.<ol>
<li>Para coloração de iodo, use 1 mL de 0,1 N I2KI (Solução Lugol). Incubar por 2 dias. Não é necessário mais interrupções da cutícula adulta.</li>
		<li>Para coloração de ácido fosfotungstic (PTA), utilize 1 mL de uma solução de 0,5% (w/v) diluída em água. Interrompa a cutícula adulta, seja removendo as partes bucais ou furando o tórax ou cutícula abdominal com um pequeno pino minutien preso a um suporte. Incubar por 5-7 dias, ou mais se a coloração do tecido parecer não homogênea.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave com 1 mL de água ultrauso ou 1x PBS por 30 min. Repita o passo de lavagem. Armazene animais na RT em água ultrauso ou 1x PBS por até um mês.</li>
	<li>Se os animais forem escaneados enquanto hidratados, proceda diretamente à seção 4. Se for necessária uma preservação mais longa da amostra, proceda à seção 3 do protocolo.</li>
</ol>3. Secagem de pontos críticos (Opcional)
<ol><li>Realizar uma série de desidratação de etanol (EtOH) na amostra: 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 100%. Adicione 1 mL da solução EtOH e incubar no banco por 1h para cada concentração na ordem indicada.</li>
	<li>Após o último mergulho 100% EtOH, substitua por etoh fresco 100% e deixe a amostra incubar no banco durante a noite.</li>
	<li>Realize a secagem de pontos críticos das amostras seguindo as instruções do fabricante. NOTA: As instalações de microscopia eletrônica geralmente possuem uma máquina de secagem de ponto crítico (ver Tabela de Materiais) que realizará a secagem da amostra após a desidratação do EtOH.</li>
</ol>4. Montagem da amostra
<ol><li>Para amostras secas de ponto crítico, amostras de cola quente em um pino de inseto ou outro suporte projetado para caber dentro do mandril do estágio rotativo ou colocá-lo em um tubo capilar de plástico ou vidro (~1,0-1,25 mm de diâmetro interno).</li>
	<li>Para amostras hidratadas, encha uma ponta de pipeta P10 com água e fixe a extremidade estreita por vedação térmica ou filme de parafina para evitar vazamentos. ATENÇÃO: Certifique-se de embrulhar as conexões com força para que a água não vaze no scanner e cause danos.<ol>
<li>Transfira um único espécime para a ponta da pipeta usando fórceps. Usando um objeto longo e esguio, como uma agulha de 20 G embotada ou outra ponta de pipeta, empurre cuidadosamente o espécime pela ponta até que ele apenas entre em contato com a parede da ponta da tubulação para mantê-lo no lugar.</li>
		<li>Cubra a abertura da ponta da pipeta com filme de parafina para evitar a evaporação da água durante longos exames.</li>
		<li>Monte a pipeta P10 usando um suporte projetado para caber dentro do mandril do estágio rotativo(Figura 1A-C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Digitalização
<ol><li>Realize todas as calibrações necessárias da máquina antes da imagem durante o dia. NOTA: Estes variam de acordo com o fabricante e é recomendável consultar um especialista em aplicação para determinar as etapas adequadas. Consulte a Tabela de Materiais para obter informações específicas sobre a configuração e o software utilizados neste protocolo. Geralmente, calibrações como um alinhamento do eixo de estágio para remover qualquer 'oscilação' associada ao mandril estar fora do eixo em relação ao estágio rotativo e realizar correções de campo plano para garantir intensidades uniformes de pixel de fundo na câmera fornecem condições ideais de imagem para a melhor resolução e conjuntos de dados que são comparáveis em várias varreduras.</li>
	<li>Abra a porta do scanner para ter acesso ao mandril do estágio rotativo clicando no ícone 'Open Door' no canto superior esquerdo do software. Fixar a amostra apertando a coleira ao redor da base do suporte da amostra. NOTA: Use pressão suave ao anexar a amostra ao mandril rotativo para manter o alinhamento do scanner.</li>
	<li>Defina parâmetros de digitalização no software que controla o scanner para uma resolução e contraste ideais. NOTA: Estes precisarão ser determinados empiricamente, pois a fonte de raios-X, a câmera/detector e a geometria de cada scanner variam de acordo com o fabricante. Informações adicionais para a seleção dos melhores parâmetros também podem ser encontradas aqui43,bem como do especialista em aplicação do fabricante.<ol>
<li>Abra o controle de energia de fonte de raios-X (Opções | Fonte de raio-X). Use as barras de controle deslizante para definir tensão de raios-X a 30-40 kV e corrente de 100-110 μA para produzir um feixe de raios-X com 3-4W de potência e um pequeno tamanho de ponto para maior resolução.</li>
		<li>Use a caixa de diálogo Modos de Aquisição (Opções | Modos de aquisição) para definir o tempo de exposição da câmera para 500-800 ms.</li>
		<li>Use a barra de controle deslizante localizada ao lado do ícone da lupa na parte inferior do software para definir o tamanho do pixel de imagem desejado (~700 nm a 4 μm), dependendo das configurações da câmera e da posição. Isso determina o número de imagens de projeção adquiridas durante a varredura, com mais projeções levando a uma resolução aprimorada, mas tempos de varredura mais longos (ver Resultados Representativos).</li>
		<li>Clique e arraste a barra de controle deslizante localizada ao lado da seta giratória na parte inferior do software para mover a amostra ao longo de seu caminho de rotação de 360°. Certifique-se de que a amostra permaneça dentro do campo de visão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Clique no ícone'Iniciar aquisição'(ícone de seta de círculo azul) na parte superior do software. Uma caixa de diálogo aparece que permite que parâmetros adicionais de digitalização sejam definidos e a pasta de arquivo e saída onde a digitalização será salva para ser nomeada.<ol>
<li>Defina o movimento aleatório para 10 e média de 4-6 quadros. A etapa de rotação é calculada automaticamente dependendo das configurações da câmera utilizadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Comece a digitalizar clicando em 'OK' na caixa de diálogo Aquisição. Uma segunda caixa de diálogo da barra de progresso aparece que mostra o tempo de varredura. O scanner agora adquirirá uma série de imagens de projeção (Figura 1D) da amostra ao longo do caminho de rotação e não precisa ser monitorado.</li>
</ol>6. Reconstrução
<ol><li>Para gerar os tomogramas, realize a reconstrução da imagem usando as imagens de projeção. NOTA: Enquanto quase toda a reconstrução de imagens dos scanners de geometria do feixe de cone depende do algoritmo Feldkamp16,os parâmetros individuais variam dependendo da implementação do software e devem ser determinados empiricamente. As seguintes configurações, específicas para um software comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais)podem ser usadas como guia. Parâmetros como compensação de desalinhamento, redução de artefatos de anel e correção de endurecimento de feixe (0% para a maioria das amostras de mosca) são realizados de forma iterativa para escolher os melhores valores para a reconstrução final. Para usuários avançados que gostariam de mais controle sobre o processo de reconstrução, consulte a interface MATLAB aqui44.</li>
	<li>Realize um alinhamento inicial de imagem utilizando um algoritmo de correção de turno baseado em varreduras de referência45 (Ações | Alinhamento x/Y com uma varredura de referência).
</li>
	<li>Ajuste fino cada parâmetro de reconstrução(Iniciar | Ajuste fino). Isso ativa uma caixa de diálogo 'Ajuste fino do parâmetro'.<ol>
<li>Ajuste bem o alinhamento clicando em 'Next' to 'Post-Alignment'. Defina o número de iterações para cinco e o parâmetro passo para 1.0. Clique no botão Iniciar para gerar uma série de visualizações. Selecione a imagem que está corretamente alinhada. NOTA: Uma imagem adequadamente alinhada não será embaçada ou exibirá artefatos de "cisalhamento" onde uma estrutura contínua (como a cutícula) aparece dividida.</li>
		<li>Ajuste bem a redução do artefato do anel clicando ao lado dele. Defina o número de iterações para cinco e o parâmetro passo para 1.0. Clique no botão Iniciar para gerar uma série de visualizações. Selecione a imagem que contém o menor número de anéis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uma vez otimizados os parâmetros acima para dar a melhor imagem, certifique-se de que os valores selecionados estejam devidamente representados na guia Configurações(Configurações).
</li>
	<li>Ajuste qualquer brilho final e valores de contraste usando o histograma, parâmetros de arquivo, como profundidade e tipo de bit, e utilize uma Região de Interesse (ROI) abrangendo apenas as estruturas de interesse (por exemplo, somente mosca ou cabeça inteira) para reduzir o tempo computacional(Saída).</li>
	<li>Comece a reconstrução (Comece | Comece). Se forem necessárias várias reconstruções, adicione a imagem atual ao gerenciador de lotes(Iniciar | Adicione ao lote) e repita as etapas 6.2-6.5 para as demais imagens.</li>
</ol>7. Análise de imagem
<ol><li>Visualize os tomogramas em duas e três dimensões e realize uma análise morfométrica adicional com freeware ou software comercial. NOTA: Os detalhes do software utilizado neste protocolo estão disponíveis na Tabela de Materiais. Outros pacotes de software capazes de avaliar conjuntos de dados μ-CT incluem opções de freeware como FIJI46,Seg3D (www.seg3D.org)47e ITK-SNAP48, além de software comercial (por exemplo, AMIRA). Outras aplicações que empregam algoritmos baseados em aprendizado de máquina para semi automatizar o processo de segmentação podem ajudar a acelerar os fluxos de trabalho e reduzir o viés humano (por exemplo, Biomedisa49).</li>
	<li>Importar o arquivo tomograma para o software (Arquivo | Importar arquivos de imagem). Os metadados associados ao arquivo devem ser carregados automaticamente na janela, mas também podem ser definidos manualmente para corresponder às propriedades da imagem.</li>
	<li>Para segmentar uma estrutura de interesse, clique na guia Segmento no lado esquerdo da tela. Criar uma nova Região de Interesse (ROI) (| Básica Novo), dê-lhe um nome e selecione uma cor apropriada.</li>
	<li>Defina o intervalo de limiar que engloba a estrutura de interesse (Range | Definir intervalo) usando a barra de controle deslizante.</li>
	<li>Selecione um modo de ferramenta de pintor de ROI 2D ou 3D apropriado(ROI Painter | Opção paintbrush).
</li>
	<li>Pintar uma área definida pelo limiar; pressione e segure a tecla Ctrl enquanto segura a tecla do mouse esquerdo. Para remover uma área, pressione e segure a tecla Shift enquanto segura a chave do mouse esquerdo. NOTA: Para alterar o tamanho do pincel circular ou quadrado, basta rolar a roda do mouse enquanto segura as teclas Ctrl ou Shift.</li>
	<li>Continue a pintar a estrutura de interesse durante todo o seu volume Z.</li>
	<li>Converta o ROI em uma malha(exportação | Para um | de malha Normal).
</li>
	<li>Destaque a sobreposição de malha clicando nela no painel Propriedades e Configurações de Dados no canto superior direito.</li>
	<li>Suavize a malha usando um número apropriado de iterações(Malha Lisa | Iterações). NOTA: Use o mesmo valor de iteração de suavização da malha para todas as imagens a serem comparadas.</li>
	<li>Certifique-se de que as medidas do ROI de malha (Superfície, Volume e Diâmetro do Feret) sejam exibidas no painel Informações no lado direito da tela para análise morfométrica básica. Análises adicionais podem ser realizadas utilizando o Módulo de Análise de Objetos.</li>
	<li>Renderize o objeto de malha e toda a imagem do tomograma e visualize em 3D. Use o Movie Maker embutido para gerar um vídeo do objeto (Mouse Direito Clique | Show Movie Maker) usando quadros individuais do espectador(Adicionar chave). NOTA: Vários aprimoramentos visuais também podem ser aplicados ao filme usando a guia de efeitos visuais no painel direito para destacar certas características, etc.</li>
	<li>Exporte o vídeo para visualização usando o botão Animação de Exportação no Criador de Filmes.</li>
</ol>

O autor declara não ter interesses concorrentes ou financeiros.

A visualização intacta de melanogaster de Drosophila intacta em todas as fases de desenvolvimento tem permanecido um desafio, principalmente devido à incompatibilidade da microscopia leve com a cutícula espessa e pigmentada encontrada neste animal. Enquanto outros métodos inteiros de imagem animal, como ressonância magnética (RM), Tomografia de Coerência Óptica (OUT) e ultramicroscopia aliada à limpeza tecidual, juntamente com a limpeza de tecidos, têm sido utilizados com sucesso em moscas50,51,52,53,54, μ-CT apresenta uma série de vantagens que o tornam ideal para toda a imagem animal deste organismo13,15,30 . Raios-X penetram facilmente na cutícula pigmentada e seu pequeno comprimento de onda permite imagens submicinas. A rotulagem requer investimento mínimo em produtos químicos amplamente disponíveis e sem habilidades de banco especializadas13. μ-CT scanners também estão disponíveis comercialmente, e os custos são comparáveis às plataformas de microscopia leve, ao mesmo tempo em que são mais atraentes para uma ampla gama de disciplinas (Geologia, Paleontologia, Engenharia, etc.) que também podem se beneficiar de sua disponibilidade em uma instituição. As fontes de raios-X síncrotrons também podem ser usadas para imagens de μ-CT de alta resolução de insetos fixos e vivos31,55,56, mas são menos acessíveis do que os scanners comerciais de bancada.
Este protocolo fornece uma maneira eficiente de obter imagens μ-CT de adultos voadores, pupas, larvas e embriões celularizados. Observe que para muitas das etapas descritas acima, métodos alternativos também podem ser aplicados para preparar amostras para imagens. Outros estudos têm proporcionado uma comparação detalhada das diferentes etapas de fixação, rotulagem e secagem para uso em insetos e os interessados em adotar essa técnica são incentivados a avaliar os méritos de cada abordagem1,4,13,29,30,57. Embora este protocolo seja relativamente simples, algumas sugestões úteis são apresentadas.
Em primeiro lugar, deve-se tomar cuidado ao interromper a cutícula de espécimes intactos, de tal forma que os tecidos moles subjacentes não são significativamente interrompidos. É importante deixar que as fases larval e pupal precoces sejam fixação por 2 horas na solução de Bouin antes de cutucar. Isso endurecerá o tecido e limitará a quantidade de hemoglifo que vai escorrer dos orifícios de cutícula, o que pode alterar a arquitetura dos órgãos. Segmentos corporais individuais (cabeça, tórax e abdômen) do adulto podem ser separados se a estrutura de interesse estiver localizada lá. Recomenda-se usar um bisturi para cortar limpamente esses segmentos em vez de separá-los com fórceps, o que poderia interromper a arquitetura 3D do intestino ou do sistema nervoso central, por exemplo. Quanto ao tempo, os adultos geralmente precisam de apenas 16 horas. para fixação completa, enquanto os estágios larval e pupal precisam de 24 h. Além disso, se a coloração de iodo ou PTA parecer desigual, a amostra pode ser colocada de volta em solução para incubar por mais tempo até que até mesmo a coloração seja alcançada. Por fim, as amostras hidratadas não devem ser colocadas a 4 °C, pois isso parece induzir a formação de bolhas de ar dentro da cavidade corporal após o aquecimento à temperatura ambiente.
Em segundo lugar, a montagem da amostra variará de acordo com o instrumento, o tipo de estágio e se a amostra precisa permanecer hidratada ou foi um ponto crítico seco. Se hidratado, certifique-se de que a amostra não vaze e possivelmente destrua o scanner. Ao montar a amostra dentro de uma ponta de pipeta, certifique-se de empurrar suavemente com um objeto embotado até que os espécimes encontrem leve resistência e não possam se mover. Empurrar muito forte pode levar à deformação da cutícula e defeitos estruturais subjacentes. Além disso, certifique-se de que a amostra está alinhada no suporte o mais próximo possível do eixo de rotação. Qualquer oscilação aumentará os tempos de varredura devido ao campo de visão maior e reduzirá a resolução do tomograma final após a reconstrução.
Em terceiro lugar, as configurações do scanner para aquisição de imagens de projeção também variam de acordo com o instrumento. Para maximizar as capacidades de resolução do scanner, o tamanho da mancha do feixe de raios-X deve ser o menor possível (5-10 μm). Isso pode ser alcançado equilibrando as configurações de tensão de raios-X e correntes de tal forma que a potência total seja de 3-4 W. Com essas configurações e o tempo de exposição adequado na câmera, pode-se alcançar a atenuação adequada do feixe de raios-X pela amostra e o contraste de imagem ideal. O uso de filtros de alumínio ou cobre entre o objeto e a fonte de raios-X pode ser usado para ajustar as configurações ideais de energia de raios-X para o melhor contraste de imagem ou atenuar o feixe suficientemente para fontes mais altas de energia a serem usadas. Quanto à resolução da imagem, isso dependerá de muitas variáveis diferentes, incluindo tipo de mancha, número de imagens de projeção, tamanho do pixel da imagem, posição da câmera, movimento da amostra, vibrações do scanner e parâmetros de reconstrução. Um fantasma padrão de barra (QRM GmbH) contendo marcadores de tamanho conhecidos pode ajudar a avaliar a resolução espacial para um determinado scanner e configuração da câmera.
Também vale a pena avaliar os méritos da imagem de amostras de ponto crítico seco ou hidratado. Sombke et al. realizaram uma avaliação comparativa dos dois métodos e encontraram a secagem de pontos críticos como superior às aplicações μ-CT envolvendo artrópodes30. No entanto, os benefícios das amostras hidratadas são que os animais são submetidos a menos exposição química e mecânica que poderia levar a artefatos quantitativos e morfológicos. Isso também tende a preservar tecidos delicados melhor do que o CPD. No entanto, as amostras hidratadas têm uma vida útil muito menor e devem ser imagens no máximo um mês após a fixação, uma vez que a degradação do tecido e a qualidade da imagem reduzida se tornam óbvias nesse ponto. Além disso, a resolução das amostras hidratadas será ligeiramente menor que uma amostra seca de ponto crítico, pois os raios-X também devem penetrar tanto através de uma ponta de pipeta plástica quanto do líquido circundante (água ou tampão). Ponto Crítico As amostras secas podem ser preservadas por períodos muito mais longos de tempo, especialmente quando mantidas em Drierite. Eles também podem ser colocados diretamente no caminho do raio-X, simplesmente colando as asas ou pernas a um pino de inseto e colocando-o no mandril de palco, simplificando o processo de montagem. No entanto, a extensa desidratação do etanol dessas amostras pode levar ao encolhimento tecidual e à perda de arquitetura de tecido delicado, razão pela qual é importante realizar uma série de concentrações crescentes de EtOH para minimizar esses efeitos. No entanto, deve-se notar que todas as formas de tratamento químico, incluindo a fixação de paraformaldeído e até mesmo a coloração de iodo podem causar encolhimento tecidual58,59. Embora nenhum dos métodos forneça medições do "tamanho real do órgão" em uma mosca viva, as medidas morfométricas ainda são válidas quando comparamos animais mutantes e selvagens, desde que as etapas de fixação, coloração e secagem sejam realizadas de forma idêntica para ambos os conjuntos de amostras — de preferência em paralelo.
Em conclusão, μ-CT fornece uma ferramenta de imagem animal útil para Drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. Muitos outros estudos mostraram o poder dessa tecnologia para entender vários aspectos da taxonomia de insetos, ecologia, fisiologia, desenvolvimento e anatomia que podem ajudar a informar estudos futuros em moscas1,28,30,31,32,55,56,57 . Combinada com as ferramentas de microscopia genética e leve já amplamente utilizadas neste organismo, μ-CT pode se posicionar dentro de um pipeline experimental que permite uma compreensão mais profunda entre genótipo e fenótipo.

Métodos de imagem que permitem a investigação detalhada das estruturas interiores de um objeto sem destruir sua arquitetura 3D global provaram ser amplamente benéficos para uma série de disciplinas diferentes, incluindo física, engenharia, ciência dos materiais, arqueologia, paleontologia, geologia e biologia1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Entre esses métodos de imagem não destrutivos, as plataformas baseadas em raios-X são especialmente úteis devido à capacidade de raios-X de alta energia penetrar em muitos tipos e materiais de amostra diferentes com dispersão mínima em comparação com ondas de luz visíveis. Tomografia computadorizada (TC), Tomografia Microcomputada (μ-CT), Tomografia Nanocomputada (Nano-CT) e Microtomografia Síncrotron surgiram, portanto, como as principais tecnologias para imagens baseadas em raios-X de amostras que variam de medidores a mícrons, com recursos de resolução de milímetros a subcron10,11,12,13,14.
Embora essas plataformas diferem em seu design, geometria de raios-X e componentes para equilibrar o tamanho e a resolução da amostra, todas elas dependem do mesmo princípio básico para captura de imagem: uma fonte de raios-X que viajam através do objeto e são capturados por um detector. Atenuação diferencial do feixe de raios-X à medida que passa por densidades variadas dentro do objeto gera contraste de imagem. Os dados 3D são obtidos girando a amostra ou o detector, coletando uma série de imagens de projeção 2D que são então reconstruídas usando algoritmos em tomogramas contendo informações 3D cuja resolução é isotropic em x,y,z15. Para muitos scanners de μ-CT que utilizam uma geometria de raios-X de feixe de cone para projetar raios-X no objeto que está sendo imageado, o algoritmo Feldkamp é usado para reconstruir o objeto com erros mínimos16.
A resolução de uma determinada plataforma é determinada principalmente por parâmetros do sistema, como o tamanho do feixe de raios-X (tamanho da mancha), geometria do scanner (distância do objeto à fonte de raios-X), tamanho dos pixels no detector e o algoritmo de reconstrução empregado. Fatores adicionais, como vibrações de scanner, flutuações de raios-X, movimento da amostra e tipo de material ou mancha química usada para visualizar o objeto também podem influenciar significativamente a resolução espacial sob condições de imagem do mundo real15.
Para aplicações biomédicas, a Tomografia E μ-CT têm desempenhado um papel fundamental no avanço da compreensão dos mecanismos de anatomia, fisiologia, desenvolvimento e doenças, servindo como ferramenta tanto para diagnósticos de pacientes humanos quanto como plataforma de imagem pré-clínica para organismos modelo17,18. Por exemplo, o Mouse International Phenotyping Consortium, cujo objetivo é identificar a função de cada gene no genoma do camundongo, utiliza μ-CT como parte de seu oleoduto fenotipado19. Seus resultados têm sido fundamentais para a compreensão dos genes envolvidos no desenvolvimento e nos processos de doenças, ao mesmo tempo em que servem como um atlas para anatomia e desenvolvimentode camundongos 20. Outros organismos modelo, como zebrafish e ratos, também adotaram totalmente o uso de μ-CT para a realização de fenotipagem animal inteira de um número de mutantes genéticos17,21,22,23.
A vantagem de combinar imagens animais inteiras com organismos modelo é que uma compreensão mecanicista da função genética para um determinado processo biológico pode ser totalmente explorada. Isso é possível devido aos genomas bem caracterizados e muitas ferramentas genéticas disponíveis em organismos modelo que permitem a manipulação precisa da função genética em pontos de tempo distintos do desenvolvimento, tecidos específicos, células individuais e até organelas subcelulares. Estes incluem sistemas de expressão binária, como o sistema UAS/GAL4 (e seus muitos derivados), CRISPR/Cas9 e RNAi24,25,26. Quando essas ferramentas genéticas são usadas em conjunto com um poderoso pipeline de imagem composto por microscopia eletrônica, microscopia leve (fluorescente e não fluorescente), e imagens animais inteiras como μ-CT, uma avaliação completa de moléculas, células, tecidos, órgãos e todo o organismo pode ser alcançada, permitindo uma compreensão muito mais profunda da função genética.
Este protocolo se concentra no uso de μ-CT no organismo modelo não-mamífero Drosophila melanogaster, cuja miríade de ferramentas genéticas ajudaram a elucidar numerosos mecanismos moleculares26,27. Foi adotado a partir de protocolos anteriores em insetos não-modelo1,28,29,30,31,32, e constrói-se de estudos anteriores μ-CT em Drosophila para estabelecer um protocolo padronizado para seu uso neste animal 33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. As etapas para a preparação, imagem e análise bem-sucedidas dos conjuntos de dados fly μ-CT usando scanners disponíveis comercialmente são delineadas. Com este protocolo, todos os estágios de desenvolvimento da mosca podem ser visualizados em alta resolução para estudos descritivos e testes de hipóteses, incluindo taxonomia, anatomia, desenvolvimento, fisiologia e doença27. Este protocolo também será útil para a imagem de praticamente qualquer inseto e até mesmo materiais não vivos que requerem coloração química para contraste de imagem para melhorar a visualização por μ-CT.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For critical point drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#39;s Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT10132</td>
			<td>For animal fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dragonfly Software</td>
			<td>Object Research Systems</td>
			<td></td>
			<td>For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine Solution (I2KI)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SI86-1</td>
			<td>For staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcomputed Tomography Scanner</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Skyscan 1172</td>
			<td>Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 &#181;m pixel size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcomputed Tomography Scanner Software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-15</td>
			<td>For poking hole in cuticle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRecon Image Reconstruction Software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipet tips</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-120</td>
			<td>Sample mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Resarch Products International</td>
			<td>P32060-4000.0</td>
			<td>Dilute to 1X with water before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic Acid Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79690-25g</td>
			<td>For staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26018-17</td>
			<td>For Minutien Pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>111036</td>
			<td>To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Ray Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Xradia 520 Versa</td>
			<td>Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD&#8482;)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole animal imaging of drosophila melanogaster using microcomputed tomography

Ferramentas biomédicas de imagem permitem a investigação de mecanismos moleculares em escalas espaciais, de genes a organismos. Drosophila melanogaster, um organismo modelo bem caracterizado, beneficiou-se do uso de microscopia de luz e elétrons para entender a função genética ao nível das células e tecidos. A aplicação de plataformas de imagem que permitem a compreensão da função genética ao nível de todo o organismo intacto aumentaria ainda mais nosso conhecimento sobre mecanismos genéticos. Aqui é apresentado todo um método de imagem animal que delineia os passos necessários para visualizar a Drosophila em qualquer estágio de desenvolvimento utilizando tomografia microcomputada (μ-CT). As vantagens do μ-CT incluem instrumentação comercialmente disponível e tempo mínimo de hands-on para produzir informações 3D precisas na resolução de nível de micron sem a necessidade de dissecção ou métodos de compensação de tecidos. Emparelhado com softwares que aceleram a análise de imagem e a renderização 3D, a análise morfométrica detalhada de qualquer tecido ou sistema de órgãos pode ser realizada para entender melhor os mecanismos de desenvolvimento, fisiologia e anatomia para estudos descritivos e testes de hipóteses. Utilizando um fluxo de trabalho de imagem que incorpora o uso de microscopia eletrônica, microscopia leve e μ-CT, uma avaliação minuciosa da função genética pode ser realizada, promovendo assim a utilidade deste poderoso organismo modelo.

A Figura 2 mostra imagens de um embrião, 3ª larva instar, pupae no estágio adulto pharate (P7), e uma mosca fêmea adulta manchada com iodo e imagem hidratada na água usando um scanner de bancada comercial. A excelente preservação e até mesmo a coloração de tecido delicado são aparentes, permitindo que todos os órgãos principais sejam prontamente identificados e utilizados para análise morfométrica e visualização 3D.
Normalmente, varreduras que adquirem menos imagens de projeção da amostra fornecem resolução menor do que as varreduras que adquirem mais imagens de projeção, com o tempo de troca sendo gasto na varredura. Embora os tempos de varredura variem de acordo com o instrumento e outros parâmetros de digitalização, as varreduras que adquirem algumas centenas de projeções (~3 μm tamanho do pixel de imagem) leva cerca de 30 minutos por espécime, enquanto as varreduras que consistem em milhares de imagens de projeção (700 nm-1,25 μm tamanho de pixel de imagem) podem levar de 8-16 h. Uma comparação do mesmo caso de cabeça de mosca adulto tomado tanto no modo de varredura 'lento' (milhares de projeções) quanto "rápido" (centenas de projeções) é mostrado na Figura 3. É importante ressaltar que as análises morfométricas não diferem entre varreduras 'lentas' e 'rápidas'(Figura 3C)40. Nosso pipeline de imagem, portanto, utiliza varreduras rápidas para gerar um tamanho amostral suficientemente grande para análise morfométrica, e varreduras lentas para visualizar quaisquer defeitos morfológicos ou anatômicos em maior resolução. Utilizando o software (Passo 7), qualquer tecido ou sistema de órgão de interesse pode ser segmentado e usado para análise morfométrica e visualizado em 3D usando o cineasta(Filme 1).
A Figura 4 mostra um exemplo do abdômen de mosca manchado com PTA e hidratado (água) ou seguindo a secagem de ponto crítico (CPD) em um microscópio de raios-X (Tabela de Materiais). O detalhe proporcionado por uma combinação do PTA e as capacidades desta plataforma é facilmente evidente nessas imagens, de tal forma que as células epitélios individuais dos feixes de midgut e esperma dentro dos testículos são facilmente resolvidas. Enquanto a imagem do CPD mostra uma resolução marginalmente aumentada em relação à amostra hidratada, uma melhor preservação da ultraestrutura de tecidos delicados (como as células de gordura próximas à cutícula) é alcançada com amostras hidratadas(Filme 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral do design do scanner e montagem da amostra para μ-CT. (A) Um scanner comercial de bancada μ-CT. (B) Veja dentro do scanner. A fonte de raios-X (à direita) emite raios-X que passam pela amostra localizada em um estágio rotativo (seta amarela). Atenuação desses raios-X geram contraste de imagem à medida que passam pela amostra e pelo detector, que consiste em uma tela de cintilação que converte raios-X em fótons e uma câmera CCD padrão (esquerda). (C) Montagem de uma mosca de fruta adulta para imagem hidratada na água. Os pontos de conexão entre a ponta da pipeta e o suporte de latão são embrulhados em filme de parafina para evitar vazamentos e danos potenciais ao scanner. O mandril de palco também é destacado. Note que a ponta da pipeta foi posicionada ligeiramente fora do eixo, o que levou a um tempo de varredura mais longo e redução da resolução na reconstrução final. (D) Uma única imagem de projeção 2D de uma mosca fêmea adulta; centenas a milhares dessas projeções são adquiridas durante uma varredura ao longo do eixo de rotação e são usadas para reconstrução para gerar tomogramas contendo resolução isotrópica e informações 3D precisas. Barras de escala (C) = 2 mm. P, Posterior; V, Ventral. Este valor foi modificado de Schoborg et al.40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig02.jpg"> Figura 2: Todos os estágios do ciclo de vida de Drosophila melanogaster, imagens por μ-CT. Amostras manchadas com iodo e imagens hidratadas em água. Mostrado é uma única fatia 2D. (A) Um embrião que completou os estágios iniciais da gastrulação (asterisco). (B) Uma terceira larva instar. (C) Um adulto de pharate P7 durante a metamorfose. (D) Uma fêmea adulta. Vários órgãos são destacados: BWM, músculos da parede corporal; Br, cérebro; Cd, cardíaco; Cr, colheita; DLMs, músculos longitudinais dorsais; DVM, músculos ventral dorsal; E-AD, disco antena dos olhos; Em, embrião; FB, corpos gordos; FBCs, células do corpo de gordura; H, coração; Hg, hindgut; La, lamina; L, perna; Mg, midgut; OL, lobo óptico cerebral; Ov, ovipositor; PC, cutícula pupal; SG, glândulas salivares; VNC, cabo de nervo ventral; W, asa; WD, disco de asa. Barras de escala (A) = 100 μm; (B)-(D) = 500 μm. D, Dorsal; A, Anterior; L, esquerda. Parâmetros de varredura: Distância da Fonte à Amostra (mm): (A, D) 36,5, (B) 48,8, (C) 40,3. Fonte para Distância da Câmera (mm): (A, D) 350, (B, C) 285. Tamanho do Pixel da câmera (μm): (A-D) 11.6. Tamanho do Pixel da imagem (μm): (A, D) 1.2, (B) 1.9, (C) 1.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig03.jpg"> Figura 3: Os parâmetros de varredura e a resolução da imagem não alteram as análises morfométricas. Uma cabeça adulta digitalizou usando as configurações do scanner'A, A' ( A, A') (centenas de projeções) e(B, B)configurações de scanner 'lentas' (milhares de projeções). O cérebro está delineado em amarelo. (C) Medições de volume cerebral a partir de varreduras lentas e rápidas. Estruturas destacadas: AL; lóbulo antenal; CB, cérebro central; FB, corpo em forma de ventilador; FCs, células de gordura; La, lamina; Lo, lobula; LoP, placa de lobula; Eu, medulla; Re, retina. n = 5, teste t de Welch. ns = não significativo. Barras de escala = 100 μm. Parâmetros de varredura: Distância da fonte à amostra (mm): (A) 44,4, (B) 36,5. Fonte à Distância da Câmera (mm): (A) 348 (B) 350. Tamanho do Pixel da câmera (μm): (A-B) 11.6. Tamanho do Pixel da imagem (μm): (A) 2,95, (B) 1.2. Este valor foi modificado de Schoborg et al.40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig04.jpg"> Figura 4: Abdômen de melanogaster de Drosophila, retratado por Microscopia de Raio-X. Os abdômens foram manchados com 0,5% de PTA e hidratado (água) ou seguindo a secagem de ponto crítico (DPC). (A) Ponto Crítico Abdômen seco, mostrado a partir da perspectiva YZ e (A') perspectiva XZ. (B) Abdômen hidratado, mostrado a partir da perspectiva YZ e (B') perspectiva XZ. Vários órgãos são destacados: FC, células de gordura; Hg, hindgut; Mg, Midgut; SP, Bomba de Esperma; Te, Testes. Barras de Escala (A) = 250 μm. D, Dorsal; A, Anterior; L, esquerda. Parâmetros de varredura: Distância da fonte para amostra (mm): (A) 6,7, (B) 7. Fonte à Distância da Câmera (mm): (A) 28 (B) 29,5. Objetivo: (A-B) 4X. Tamanho do Pixel da imagem (μm): (A-B) 0,65. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Filme 1: Uma terceira larva instar, renderizada em 3D usando o Cineasta em Dragonfly. Os órgãos destacados incluem o cérebro (amarelo), os discos imagináveis de antena dos olhos (vermelho), o corpo gordo (azul) e os músculos da parede corporal (verde). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_1_Revised.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este filme.</a>
Filme 2: Comparação de amostras imagens em água ou seguir a secagem de ponto crítico. Abdômens manchados com 0,5% de PTA são mostrados. Ambos os abdômens foram escaneados com configurações idênticas do tamanho do pixel de imagem (0,65 μm). Uma série de fatias 2D são mostradas em um formato 'Z-stack' (YZ) começando na superfície dorsal e terminando na superfície ventral do abdômen. Órgãos destacados: FC, células de gordura; Mg, Midgut; SP, Bomba de Esperma; Te, Testes. Parâmetros de varredura: Distância da fonte para amostra (mm): (A) 6,7, (B) 7. Fonte à Distância da Câmera (mm): (A) 28 (B) 29,5. Objetivo: (A-B) 4X. Tamanho do Pixel da imagem (μm): (A-B) 0,65. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_2_Revised.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este filme.</a>

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Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

É apresentado um protocolo que permite a visualização de melanogaster de Drosophila intacto em qualquer estágio de desenvolvimento utilizando tomografia microcomputada.

Imagem Animal inteira de Drosophila melanogaster usando tomografia microcomputada

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

whole-animal-imaging-drosophila-melanogaster-using-microcomputed

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

4.8K visualizações.  University of Wyoming. É apresentado um protocolo que permite a visualização de melanogaster de Drosophila intacto em qualquer estágio de desenvolvimento utilizando tomografia microcomputada.

Vídeo: Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Imagem Vertical de<em&gt; Drosophila</em&gt; Câmaras de ovo

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Biologia do Desenvolvimento

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Ensaiando populações de células do sangue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Elevando a mosca da fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sob axênicas e gnotobióticos Condições

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. This morphological alteration is also recognized as epithelial to mesenchymal transition (EMT). Dysregulation of EMT is associated with fibrosis and cancer metastasis. There is emerging evidence that EMT is controlled by a number of molecular mechanisms. As such, many key genes that control apical constriction are also known to be important factors in the EMT observed in cancer metastasis. Like EMT during Drosophila gastrulation, epithelial cells can be induced to change their shape and be reprogrammed to redirect cell fate towards various other cell types. Here we provide a robust imaging method of Drosophila gastrulation to assay the initiation of morphogenetic cellular movements and cell fate identification during this stage of embryonic development. Using this method, we identify cell rearrangement at the time of gastrulation and demonstrate the importance of apical constriction during gastrulation using GFP labeled DE-cadherin.

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Herein we describe a procedure to capture live images of Drosophila gastrulation. This has enabled us to better understand the apical constriction involved in early development and further analyze mechanisms governing cellular movements during tissue structure modification.

Imagiologia de Alteração Forma celular e Movimento celular em<em&gt; Drosophila</em&gt; gastrulação Usando Reporter DE-caderina moscas transgénicas

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Descongelamento, cultivo e Cryopreserving linhas de células de Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

Métodos para testar a perturbação endócrina na Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Ensaio para a integridade da barreira hematoencefálica na Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ribonucleoprotein particle movement, mRNA localization, organelle movement, and cytoskeletal dynamics. There are several methods for live imaging that have been developed. Due to the fact that each method involves dissecting individual ovarioles placed in media or halocarbon oil, cellular damage due to hypoxia and/or physical manipulation will inevitably occur over time. One downstream effect of hypoxia is to increase oxidative damage in the cells. The purpose of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries after induction of controlled cellular damage. Here, we use hydrogen peroxide to induce cellular oxidative damage and give examples of the effects of such damage on two subcellular structures, mitochondria and Clu bliss particles. However, this method is applicable to any subcellular structure. The limitations are that hydrogen peroxide can only be added to aqueous media and would not work for imaging that uses halocarbon oil. The advantages are that hydrogen peroxide is readily available and inexpensive, acts quickly, its concentrations can be modulated, and oxidative damage is a good approximation of damage caused by hypoxia as well as general tissue damage due to manipulation.

The objective of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries.

Visualizando os efeitos do dano oxidativo nas câmaras de ovos de Drosophila usando imagens ao vivo

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged molecules within complex biological samples. While traditional confocal microscopes allow one to resolve two adjacent fluorescent point sources located a few hundred nanometers apart, observing the finer details of subcellular biology requires the ability to resolve signals in the order of tens of nanometers. Numerous hardware-based methods for super-resolution microscopy have been developed to allow researchers to sidestep such resolution limits, although these methods require specialized microscopes that are not available to all researchers. An alternative method for increasing resolving power is to isotropically enlarge the sample itself through a process known as expansion microscopy (ExM), which was first described by the Boyden group in 2015. ExM is not a type of microscopy per se but is rather a method for swelling a sample while preserving the relative spatial organization of its constituent molecules. The expanded sample can then be observed at an effectively increased resolution using a traditional confocal microscope. Here, we describe a protocol for implementing ExM in whole-mount Drosophila embryos, which is used to examine the localization of Par-3, myosin II, and mitochondria within the surface epithelial cells. This protocol yields an approximately four-fold increase in sample size, allowing for the detection of subcellular details that are not visible with conventional confocal microscopy. As proof of principle, an anti-GFP antibody is used to distinguish distinct pools of myosin-GFP between adjacent cell cortices, and fluorescently labeled streptavidin is used to detect endogenous biotinylated molecules to reveal the fine details of the mitochondrial network architecture. This protocol utilizes common antibodies and reagents for fluorescence labeling, and it should be compatible with many existing immunofluorescence protocols.

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Here, a protocol for the implementation of expansion microscopy in early Drosophila embryos to achieve super-resolution imaging using a conventional laser-scanning confocal microscope is presented.

Usando microscopia de expansão para ampliar fisicamente embriões de Drosophila de montagem inteira para imagens de super-resolução

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...

Imagem de explantes cerebrais vivos de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Autor em destaque: Investigando a dinâmica assimétrica da divisão celular: um protocolo para imagens ao vivo de explantes cerebrais de larvas de Drosophila 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Imagem de células vivas de cérebros de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...