Nossa abordagem torna possível controlar a formação de rede neural usando manipulações magnéticas. Trata-se de uma ferramenta eficaz para estudos in vitro de redes e oferece nova direção terapêutica para dispositivos biointerfacing. Com esta técnica podemos controlar a localização e o crescimento da célula na escala de míccro, permitindo o design flexível do padrão magnético e, portanto, a organização da rede.
Um nanopartícula magnética eficiente e não tóxico é crucial. Para ter sucesso, são necessárias nanopartículas magnéticas apropriadas. As características importantes são o valor de tamanho, revestimento e magnetização de situação.
Demonstrando os procedimentos serão Reut Plen e Dafna Levenberg, mestres do meu laboratório. Para começar, corte os deslizamentos de vidro em pedaços de dois por dois centímetros usando uma caneta escribra. Limpe as lâminas de vidro em acetona e, em seguida, isopropanol por cinco minutos cada em um banho de ultrassônica.
Em seguida, seque-os com nitrogênio de alta pureza. Cubra o vidro com fofurista usando revestimento de giro a 6.000 RPM por 60 segundos para atingir a espessura de 1,5 micrômetro e assar 100 graus Celsius por 60 segundos. Exponha a amostra a uma fonte de luz usando uma máscara ou litografia sem máscara para alcançar o padrão desejado.
Desenvolva a amostra por 40 segundos em um desenvolvedor diluído em água destilada de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, lave-o na água por 45 segundos e seque-o com gás nitrogênio UHP. Inspecione o padrão sob um microscópio óptico.
Insira a amostra na câmara de bloqueio de carga do sistema de deposição e aguarde a pressão base. Transfira a amostra na câmara principal e coloque a amostra na altura apropriada para deposição. Aumente a potência em cada alvo até que a taxa desejada seja alcançada.
Ligue a rotação e, em seguida, deposite a multicamadas ferromagnética, alternando entre as metas de cobalto, ferro e paládio, abrindo e fechando as persianas alvo, respectivamente. Deposite 14 bicamadas de paládio de ferro cobalto e finalize com uma camada adicional de tampa de paládio. Após a conclusão do depoimento, descarregue a amostra do sistema de deposição.
Mergulhe a amostra em acetona por 30 minutos e enxágue-a com isopropanol. Em seguida, seque-o com nitrogênio UHP e examine-o sob o microscópio. Mantenha-o em um ambiente limpo e seco até usar.
Use um slide de vidro com uma barra magnética em forma de cruz de 100 micrômetros de largura depositada com multicamadas ferromagnéticas. Conecte a amostra ao suporte usando fita dupla face. Use um conectador de arame para ligar quatro fios à amostra, um em cada perna do eletrodo cruzado.
Defina o suporte da amostra e a amostra dentro do sistema de medição de transporte com um campo magnético para que o campo magnético seja perpendicular à amostra. Realize medições de tensão transversal conforme descrito no manuscrito do texto. Varrer o campo magnético e medir a tensão transversal em função do campo.
Plote a resistência transversal em função do campo magnético para determinar o sinal de Salão anômeo, que é proporcional à magnetização perpendicular no filme. Prepare o meio de crescimento básico e o meio de diferenciação para a cultura celular PC12, conforme descrito no manuscrito do texto. Cultivar células em um frasco de cultura não tratada com 10 mililitros de meio básico de crescimento, adicionando 10 mililitros de médio ao frasco a cada dois ou três dias.
Subcultura as células após oito dias. Para captação celular, centrifufique a suspensão celular por oito minutos a 200 G e temperatura ambiente, em seguida, descarte o supernasce. Resuspend as células em três mililitros de meio de crescimento básico fresco.
Centrifugar as células novamente por cinco minutos, em seguida, descartar o supernaspe e resuspend as células em três mililitros de meio de diferenciação fresco. Aspire as células 10 vezes usando uma seringa e agulha para quebrar os aglomerados celulares, em seguida, conte as células usando um hemótmetro e sementes de um milhão de células em um prato regular, sem revestimento de 35 milímetros. Adicione o volume calculado de suspensão MNP e meio de diferenciação ao prato para alcançar a concentração MNP desejada.
Misture as células, MNPs e meio de diferenciação, em seguida, incubar o prato em uma incubadora umidificada de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por 24 horas. Limpe o substrato padronizado com 70% de etanol e coloque-o em um prato de cultura de 35 milímetros no capô. Coloque um grande ímã abaixo do substrato padronizado por um minuto, em seguida, remova-o movendo o prato para cima e para longe e tirando o ímã do capô.
Acenda a luz ultravioleta por 15 minutos. Para preparar um substrato de vidro revestido de colágeno, diluir o colágeno tipo um em uma proporção de um a 50 em 30% de etanol. Cubra o vidro com a solução.
Deixe o prato descoberto no capô por quatro horas até que toda a solução evaporar, em seguida, lave-o três vezes em PBS estéril. Remova as células da incubadora, centrifufique a suspensão celular por cinco minutos a 200 G e descarte o supernasce. Resuspend as células em um mililitro de meio de diferenciação fresco e conte as células usando um hemótmetro.
Semente 10 às cinco células no topo do substrato em um prato de cultura de 35 milímetros e adicionar dois mililitros de meio de diferenciação. Incubar a cultura em uma incubadora umidificada de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius. Após 24 horas, adicione um a 100 beta-NGF de murina fresco às células.
Renove o meio de diferenciação e adicione beta-NGF fresco a cada dois dias. Imagem as células a cada dois dias usando microscopia leve e realizar imunossuagem nas células após a formação da rede. Plataformas magnéticas com diferentes formas geométricas foram fabricadas e MNPs de óxido de ferro fluorescente foram sintetizados por nucleação.
Medições magnetométricas dos MNPs mostram que a curva de magnetização não tinha histerese, campo de baixa saturação e saturação de magnetização relativamente alta. As células PC12 foram incubadas em média misturadas com os MNPs fluorescentes de óxido de ferro, transformando-as em unidades magnéticas. Os MNPs foram internalizados na soma das células, mas não nos núcleos.
A concentração de ferro dentro das células aumentou com o aumento da concentração de MNP no meio. A viabilidade das células PC12 carregadas de MNP para diferentes concentrações de MNPs foi avaliada pela comparação dos parâmetros morfológicos das células carregadas de MNP utilizando a análise do Cardume, não mostrando diferença em relação às células de controle. Ensaios baseados em XTT e Resazurina confirmaram que as concentrações avaliadas de MNPs não apresentaram citotoxicidade significativa em relação às células.
As células PC12 com e sem tratamento MNP foram cultivadas e diferenciadas em um substrato magnético. As células magnetizadas foram encontradas para se conectar aos padrões magnéticos e crescer galhos de acordo com os padrões, enquanto as células sem tratamento MNP cresceram sem afinidade com os dispositivos magnéticos. O posicionamento das células em um substrato com geometria hexagonal é mostrado aqui.
75% dos corpos celulares carregados de MNP estavam em contato com as listras magnéticas, enquanto apenas 35% das células não imaginadas estavam localizadas nas listras. Além do efeito de posicionamento celular, essas plataformas magnéticas foram encontradas para controlar a direcionalidade dos neurites em crescimento. Para avaliar o efeito magnético na direcionalidade do crescimento neuronal, o ângulo entre os neurites e as listras magnéticas foi medido, mostrando correlação significativa com a orientação das listras magnéticas.
Este procedimento é facilmente adaptado para direcionar compostos ativos, como drogas, depois de conjuga-los a nanopartículas magnéticas. O pode ser traduzido para ensaios de triagem de medicamentos de alto rendimento ou tratamento local dentro dos tecidos. Esta nova abordagem abre novas possibilidades para funcionalizar outros substratos ou dispositivos adicionando estruturas magnéticas atraentes.
Atualmente, estamos desenvolvendo interfaces de chip de neurônios biocompatíveis melhoradas.
