Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health / National Institute of Mental Health (NIH / NIMH) conceder # 1R21MH085267.

Parte 1: Preparar um molde mestre para multi-compartimento neurônio fabricação de dispositivos de co-cultura <ol><li> Primeiro passo para fabricar o mestre PMMA é fazer com que 3,5 milímetros de profundidade compartimentos. Um compartimento soma e seis axônio / glia compartimentos são definidos em um bloco de PMMA usando um micro-moagem de máquina (MDX-40, Roland ou qualquer outra máquina de fresagem CNC). PMMA mestre é, então, sonicado em álcool isopropílico por 10 minutos para remover detritos. </li><li> Matrizes de 2,5 mM estruturas crista alta são padronizados em um 50,8 mm x 50,8 mm por lâmina de vidro de um processo de fotolitografia padrão, seguido de corrosão úmida do vidro. Primeiro, matriz de estruturas cume são padronizados em um substrato de vidro limpo com fotorresiste positivo S1818 usando fotolitografia. S1818 é spin-revestido sobre o substrato (4000 rpm), macio com base em 110 ° C por 5 min, em seguida, exposto à luz UV (84 mJ / cm 2) usando um alinhador de máscara seguido pelo desenvolvimento do fotorresiste em MF319 para 40 segundos. Em seguida, o fotorresiste substrato de vidro modelado é imerso em óxido de buffer etch (BOE) em temperatura ambiente por 6-7 minutos para obter um 2,5 mM estruturas cume de altura. Finalmente, a camada de fotorresiste é retirado por acetona e álcool isopropílico, seguido de uma lavagem completa em água desionizada (DI). </li><li> Substrato de vidro com micro-ridge estruturas é hot-relevo contra o capitão PMMA para transferir seus padrões. Primeiro, PMMA mestre molde e substratos de vidro são alinhados manualmente e colocadas em uma prensa quente. Então, a temperatura é elevada a 115 ° C. Quando a temperatura desejada é atingida, 0,5 toneladas de peso é aplicado por 5 minutos. Após 5 minutos, a temperatura é resfriado a 40 ° C ea pressão é liberada. O mestre PMMA é então cortado em 50,8 mm x 50,8 bloco de tamanho mm. </li><li> PDMS pré-polímero (Sylgard 184) é misturado com agente de cura na proporção de 10: 1 em peso. </li><li> PMMA mestre é colocado dentro de um barril e mistura PDMS é derramado em cima do mestre de PMMA para fabricar um mestre PDMS. Em seguida é colocado em um dessecador conectado a uma bomba de vácuo. PDMS derramado em cima da PMMA mestre é, então, desgaseificados por 15 minutos para remover as bolhas geradas durante o processo de PDMS mistura. </li><li> Quando todas as bolhas são removidas, PDMS é colocado dentro de um forno de 85 ° C nivelado por uma hora para a polimerização. </li><li> Uma vez PDMS é completamente curado, PDMS mestre é retirado do mestre PMMA e colocado dentro de um dessecador com 2-3 gotas de triclorosilano e aspirado por 15 minutos para vapor revestimento do PDMS superfície master. Revestimento triclorosilano facilita a liberação da final PDMS neurônio co-cultura dispositivos do mestre PDMS. Após o revestimento, o mestre PDMS é brevemente lavados com álcool isopropílico para remover triclorosilano excessiva, e secos com gás N 2. </li></ol> Parte 2: Neuron replicação dispositivo de cultura <ol><li> PDMS pré-polímero (Sylgard 184) é misturado com agente de cura na proporção de 10: 1 em peso. </li><li> Mistura PDMS é derramado em cima do mestre PDMS e desgaseificado dentro de um dessecador conectado a uma bomba de vácuo por 15 minutos. É importante para não derramar PDMS muito para que os 3,5 milímetros estrutura PDMS alta no mestre não está totalmente imerso. </li><li> Quando todas as bolhas são removidas, PDMS é colocado dentro de um forno de 85 ° C nivelado por uma hora para a polimerização. </li><li> PDMS é retirado do forno após uma hora e à temperatura ambiente para esfriar. Então, os dispositivos cultura PDMS neurônio são gentilmente tirou do mestre PDMS. Descascada dispositivos PDMS são embrulhados com parafilme para protegê-los de poeiras ou detritos. </li><li> PDMS dispositivos, envolvido com parafilme, são cortadas em pedaços individuais usando uma furadeira equipada com uma lâmina. </li></ol> Parte 3: Dispositivos de montagem <ol><li> PDMS dispositivo cultura neurônio é colocado dentro do limpador de plasma e exposta ao ar plasma por 90 segundos para fazer a superfície do dispositivo PDMS hidrofílico. Este tratamento plasma facilitará microcanais para ser preenchido com meios de cultura após a montagem de poli-d-lisina substrato revestido. </li><li> Dispositivos tratados com plasma são, então, imersas em etanol 70% por 30 minutos para esterilização e mudou-se dentro do esterilizados bio-capa. </li><li> Dispositivos esterilizados são retirados a partir do etanol 70% e secos com Millipore filtrada N 2 gás. Dispositivos secas são colocadas em cima de poli-d-lisina de isopor revestido de 6 bem placa de cultura e de uma leve pressão é aplicada para garantir a vedação entre o substrato eo dispositivo. </li><li> Cultura da mídia é então preenchido no compartimento de soma, seguido de preenchimento dos seis axônio / glia compartimentos. É melhor dar uma pausa de 1-2 minutos antes de encher axônio / glia compartimentos após a adição de meios de cultura para o compartimento soma para garantir que não haja bolhas dentro dos microcanais. </li><li> Dispositivos cheio de meios de cultura é incubado dentro de uma incubadora de 37 ° C durante a noite para lavar todos os detritos possíveis ou resíduos tóxicos. </li></ol> Parte 4: Carregamento da célula e neurônio-oligodendrócitos co-cultura <ol><li> No primeiro dia da cultura de células, células primárias de neurônios do prosencéfalo embrionário do dia 16-18 ratos são carregados no compartimento soma a uma densidade de 500 células / mm 2. Em primeiro lugar, meios de cultura tanto dentro do compartimento de soma e axônio / glia compartimentos são aspirados com pipeta antes de carregar celular. Então, as células 38.500, diluído em 40 mL de meios de cultura, são carregados para o compartimento de soma em torno das entradas de microcanais. É importante não tocar o dispositivo PDMS ao carregar as células, uma vez que pode quebrar o selo entre o dispositivo eo substrato. </li><li> Incubar os dispositivos celulares carregados por 30 minutos dentro de uma incubadora de 37 ° C para melhorar a adesão celular ao substrato. Após a incubação, todos os compartimentos são enchidos com meios de cultura. </li><li> As células são cultivadas a 37 ° C em um umidificado 5% incubadora de CO 2 e apenas metade de meios de cultura é trocado a cada 3-4 dias. </li><li> Após 14 dias de cultura in vitro de neurônios, oligodendrócitos são adicionados aos compartimentos axônio / glia para co-cultura. Oligodendrócitos, dissecados dos hemisférios cerebrais de ratos Sprague-Dawley em dia pós-natal 1-2, são adicionados a cada compartimento axônio / glia em uma densidade de área de 1.000 células / mm 2. Antes de células de carga, aproximadamente 60% dos meios de cultura no interior dos compartimentos são aspirados com pipeta. O cuidado deve ser feita para não tocar o substrato de fundo, pois pode danificar a rede axonal formada sobre o substrato. Então, 6700 células oligodendrócitos, diluído em 5 mL de meios de cultura, são adicionados aos compartimentos axônio / glia. As células são incubadas por 1 hora e compartimentos são enchidos com meios de cultura. </li><li> As células são cultivadas a 37 ° C em um umidificado 5% incubadora de CO 2 e apenas metade de meios de cultura é trocado a cada 3-4 dias por mais duas semanas. </li></ol> Parte 5: Resultados Representante: Quando os experimentos são realizados corretamente, células neuronais carregada para o compartimento soma localizar perto de entradas de microcanais e camada axonal começam a se formar no interior dos compartimentos axônio / glia, após uma semana de cultura. Sinal de neurônio a agregação de células no interior do compartimento soma pode ser uma indicação de que as células não são saudáveis. Ao carregar oligodendrócitos após duas semanas de cultura neurônio, axônio / glia compartimentos devem ser cobertos com densa camada de axônios e oligodendrócitos deve ser carregado em cima da camada de axonal. <img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig1tmb.jpg" border="0" alt="figura 1" /> Figura 1. Ilustrações esquemático do compartimento multi-microfluídicos CNS high-throughput neurônio plataforma de co-cultura. Transversal vista mostrando o isolamento de axônios do soma neuronal e dendritos, assim como o isolamento fluídico entre os compartimentos com diferença de nível fluídico minutos. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig1.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig2tmb.jpg" border="0" alt="figura 2" /> Figura 2. Fabricação e etapas de montagem para o compartimento multi-PDMS microfluídicos dispositivo de co-cultura. Cada dispositivo se encaixa em um poço de uma 6-bem placa de poliestireno convencional de cultura celular. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig2.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 2.

<ol>
	<li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. 6, 683-690 (2005).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Angew. Chem. 37, 550-575 (1998).</li><li>Taylor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2005).</li><li>Li, J., Baud, O., Vartanian, T., Volpe, J. J., Rosenberg, P. A., A, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxynitrite+generated+by+inducible+nitric+oxide+synthase+and+NADPH+oxidase+mediates+microglial+toxicity+to+oligodendrocytes.">Peroxynitrite generated by inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase mediates microglial toxicity to oligodendrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 9936-9941 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Nós desenvolvemos um compartimento multi-plataforma de co-cultura para estudar mamíferos CNS interação glia-axônio. Axônios do SNC foram isoladas com sucesso a partir de células neuronais corpos / dendrites, e oligodendrócitos foram co-cultivados com sucesso dentro do dispositivo. Densidade de neurônios pode ser variada por aplicativos, mas a concentração muito baixa ou muito alta pode levar as células à morte. Além disso, é importante mudar apenas metade de meios de cultura para que as células ou camada...

a multi-compartment cns neuron-glia co-culture microfluidic platform

Nós apresentamos um romance compartimento multi-plataforma neurônio microssistema co-cultura no SNC vitro de pesquisa interação axônio glia, capaz de realizar até seis experimentos independentes em paralelo para um maior rendimento. Nós desenvolvemos um método de fabricação para criar novos dispositivos microfluídicos ter estruturas escala micro e macro dentro do mesmo dispositivo através de um processo de litografia suave único, permitindo a fabricação em massa, com boa repetibilidade. O compartimento de multi-plataforma de co-cultura microfluídicos é composto por um compartimento de soma para os neurônios e seis axônio / glia compartimentos para oligodendrócitos (MQO). O compartimento de soma e axônio / glia compartimentos são conectados por matrizes de axônio-orientadores microcanais que funcionam como barreiras físicas para confinar soma neuronal no compartimento de soma, permitindo a crescer axônios em axônios / compartimentos glia. OLS carregado no axônio / glia compartimentos podem interagir apenas com os axônios, mas não com soma neuronal ou dendritos, permitindo localizada estudos axônio glia-interação. Os microcanais também permitiu o isolamento fluídico entre os compartimentos, permitindo seis experimentos independentes a serem realizados em um único dispositivo para um maior rendimento. Litografia macia, usando poli (dimetilsiloxano) (PDMS) é uma técnica comumente usada em microdispositivos biomédica. Reservatórios nesses dispositivos são comumente definidos pela perfuração manual. Embora o alinhamento simples e pobre ea natureza demorada do processo faz com que este processo não é adequado quando um grande número de reservatórios tem que ser repetidamente criados. O método recém-desenvolvido não requerem perfuração manual de reservatórios, superar tais limitações. Em primeiro lugar, sete reservatórios (profundidade: 3,5 mm) foram feitas em um poli (metacrilato de metila) bloco (PMMA), usando uma máquina de moagem micro. Então, as matrizes de microestruturas cume, fabricados sobre um substrato de vidro, foram hot-relevo contra o bloco de PMMA para definir microcanais que conectam a soma e axônio / glia compartimentos. Esse processo resultou em macro-escala de reservatórios (3,5 mm) e micro-escala canais (2,5 mm) para coincidir dentro de um mestre único PMMA. Uma réplica PDMS que serviu como um mestre do molde foi obtido através de litografia suave, eo dispositivo PDMS final foi replicado a partir deste mestre. Neurônios primários de E16-18 ratos foram carregados para o compartimento de soma e cultivadas por duas semanas. Após uma semana de cultura de células, os axônios cruzou microcanais e formou a camada de rede axonal somente dentro do axônio / glia compartimentos. Axônios cresceu de maneira uniforme ao longo de seis axônio / glia compartimentos e OLS de P1-2 ratos foram adicionados ao axônio / glia compartimentos de 14 dias in vitro para a co-cultura.

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A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

Nós desenvolvemos um romance de vários compartimentos neurônio plataforma microssistema co-cultura para a investigação in vitro a interação do SNC axônio glia. A plataforma é capaz de realizar até seis experimentos independentes em paralelo e foi fabricado usando um recém-desenvolvido macro / micro método de fabricação híbrida.

Um compartimento Multi-glia do SNC Neuron-Co-cultura plataforma microfluídica

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

a-multi-compartment-cns-neuron-glia-co-culture-microfluidic-platform

Research

JoVE Journal

Biology

11.9K visualizações.  Texas A&M University (TAMU). Nós desenvolvemos um romance de vários compartimentos neurônio plataforma microssistema co-cultura para a investigação in vitro a interação do SNC axônio glia. A plataforma é capaz de realizar até seis experimentos independentes em paralelo e foi fabricado usando um recém-desenvolvido macro / micro método de fabricação híbrida.

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissecção do CNS Larval em Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biologia

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Um dispositivo de geração de Gradient microfluídicos de Biologia Celular

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Captura de célula usando um dispositivo micro

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

O Probe microfluídicos: Operação e Uso de Processamento de Superfície localizada

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

Adesão e agregação plaquetária sob fluxo usando células de fluxo microfluídicos

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

A Multi-Parametric Sistema Perifusion Islet dentro de um dispositivo Perifusion microfluídicos

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluídicos Co-cultura de células epiteliais e bactérias para a Investigação Solúvel sinal mediada por interações

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Um dispositivo micro para Quantificar Quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo and for characterizing the earliest genes involved in hematopoiesis, without having to deal with embryonic lethalities. The ES/OP9 co-culture system was originally designed to produce hematopoietic progeny, without the over production of macrophages, as the OP9 stromal cell line is derived from the calvaria of osteopetrosis mutant mice that lack functional M-CSF. The in vitro ES/OP9 co-culture system can be used in order to recapitulate early hematopoietic development. When cultured on OP9 stromal cells, ES cells differentiate into Flk-1+ hemangioblasts, hematopoietic progenitors, and finally mature, terminally differentiated lineages. The standard ES/OP9 co-culture protocol entails the placement of ES cells onto a confluent layer of OP9 cells; as well as, periodic replating steps in order to remove old, contaminating OP9 cells. Furthermore, current protocols involve evaluating only the hematopoietic cells found in suspension and are not optimized for evaluation of ES-derived progeny at each day of differentiation. However, with replating steps and the harvesting of only suspension cells one potentially misses a large portion of ES-derived progeny and developing hematopoietic cells. This issue becomes important to address when trying to characterize hematopoietic defects associated with knockout ES lines. Here we describe a modified ES/mStrawberry OP9 co-culture, which allows for the elimination of contaminating OP9 cells from downstream assays. This method allows for the complete evaluation of all ES-derived progeny at all days of co-culture, resulting in a hematopoietic differentiation pattern, which more directly corresponds to the hematopoietic differentiation pattern observed within the embryo.

mStrawberry OP9 cells allow for complete evaluation of all ES-derived progeny from co-culture.

Modificado ES / OP9 Co-Protocol Cultura Fornece Caracterização melhorada de Progênie Hematopoiéticas

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo ...