Os autores são gratos a Ulrich Marggraf (ISAS) para SU-8 de fabricação e Maria Becker (ISAS) para SEM imagem. A pesquisa foi financiada pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), um Bundesministerium für Bildung und Forschung concessão (BMBF 0101-31P6541) e pelo Ministerium für Inovação, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen. Heike Hardelauf graças a Escola Internacional de Leibniz &quot;Biologia de Sistemas Lab-on-a-Chip&quot; de apoio financeiro.

Os protocolos são destinados para os neurocientistas, e estão resumidos na Figura 2. Como tal, é recomendável que microfabricação dos SU-8 mestres usados ​​para replicação PDMS é terceirizada para instalações comerciais ou institucionais. Os dois projetos de máscara de camada estão disponíveis gratuitamente como informação suplementar (CEP) na Royal Society of Chemistry website 12. Importante, a primeira camada de SU-8 deve ser fabricado, a uma profundidade de 2,5-3,0 um, e a segunda a uma profundidade de 25-30 m. Estas são dimensões fundamentais necessários para arraying neurônio eficaz. O limite de altura de 3 mícron é também necessário para evitar que os neurónios a ser transportado ou migração entre os dois compartimentos 12. 1. Microfluidic replicação de dispositivos no PDMS <ol><li> Misture o pré-polímero de PDMS completamente com o agente de cura (184), a uma proporção de 10:1 e desgaseificar a mistura em um secador de vácuo para tipicamente 20 min. Alternativamente, coloque o mixtura em um tubo Falcon 50 ml e usar baixa g centrifugação para a desgaseificação. </li><li> Coloque a 2-camada microestruturada SU-8 bolacha numa placa de aquecimento de 80 ° C e alinhar quadros de polímero para cada dispositivo da bolacha. Despeje PDMS nos quadros a uma profundidade de 5 mm e ≥ permitir&gt; 1 hora para garantir a completa cura térmica. </li><li> Uma vez curado, remover a pastilha da placa de aquecimento e deixa-se arrefecer sobre uma superfície plana. </li><li> Usar óculos de protecção e de trabalho de um canto (longe dos SU-8 microestruturas) com um bisturi rígida para gentilmente prêmio do quadro e PDMS do wafer. </li><li> Retirar o molde PDMS da armação e usar um par de tesouras para cortar o dispositivo de PDMS em excesso. Este assim chamado intermitente é geralmente produzido quando uma película fina de PDMS espalha entre a armação de polímero e a superfície da bolacha. </li><li> PDMS restantes pode ser aplicada a toda a bolacha e curado para proteger a pastilha durante o armazenamento. Remover esta antes da moldagem dispositivo subseqüente, e ao fazê-lo remover qualquer particular os contaminantes da superfície. </li></ol> 2. Assembléia dispositivo e Interligação <ol><li> Prepare as seis portas de interface usando de 3 mm de diâmetro biópsia soco. Trabalhar em uma superfície escura, em boas condições de luz e com as características microstructured viradas para cima para ajudar o alinhamento das portas com os canais microfluídicos. </li><li> Inspecione o dispositivo para partículas. Remova os com fita adesiva reversível. </li><li> O circuito de microfluidos é encapsulado usando uma camada de PDMS fina montados numa lamela de vidro: Estes são preparados por vazamento de um pequeno volume (~ 0,5 ml) da mistura de agente de cura de PDMS-(10:1, 601) sobre a base de um sistema flexível, grau bacteriológica placa de Petri. Pressione suavemente uma lamela sobre a camada de PDMS, coloque sobre a placa de aquecimento e cura térmica por alguns minutos. Rapidamente após o resfriamento, usar um bisturi para cortar e prêmio da bicamada lamela-PDMS da placa de Petri. Aparar com uma tesoura, se necessário. </li><li> Vínculo Plasma o dispositivo PDMSe camada de suporte para produzir uma boa vedação: As condições ótimas são instrumento específico. Por exemplo, um forno de plasma a funcionar a 70 W e 40 kHz, numa atmosfera de oxigénio de 0,2 mbar durante 40 segundos produz uma excelente ligação PDMS-PDMS. Uma vez tratada plasma, pressionar ambas as partes juntas e deixe por um minuto para totalmente vínculo. </li><li> Use tubo de silicone (1,6 mm DI, 3.2 mm de diâmetro externo) para fazer a interface com as bombas e seringas. </li></ol> 3. Biomaterial Padronização e Operações microfluídicos Os protocolos para a modelação em biomaterial in situ, cultura neurónio e tratamentos fluídicos estão ilustrados na Figura 2. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Protocolos microfluídicos Illustrated. A) PL e PLL-g-PEG padronização; Além da camada de adesão de células (por exemplo,PL, verde), com a produção a máscara de água alinhada B) tratamento de plasma de ar atmosférica do PL exposto evaporação.; dois pinos de antena são usados, com a antena introdução plasma ilustrado com uma estrela rosa. C) PBS (azul) lavagem por aspiração é usado para evitar contaminar a região tratada com plasma com PL. D) Entrega de PLL-g-PEG (vermelho ) por aspiração para revestir as regiões tratadas com plasma E) carregamento celular.; arraying microfluídicos simultânea de neurônios para ambos os compartimentos de acompanhamento por aspiração, F) mídia () perfusão rosa usando um fluxo hidrostática orientado G) tratamentos fluídicos isolados.; tratamento periférico de um agente de teste (preto) entregues a partir da entrada inferior de flanco por aspiração e H) central de tratamento livrou da entrada central inferior por aspiração. Figura e lenda reproduzido com permissão da Sociedade Real de Química(RSC) 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> Imediatamente após plasma colagem dos canais microfluídicos PDMS são altamente hidrofílico (ângulo de contato ≤ 5 °). Tais superfícies são adequadas para a adesão e a cultura de linhas de células, tais como células neuronais, como SH-SY5Y humanas diferenciadas. Para a cultura ex vivo de neurónios primários e a cultura de linhas de células precursoras neuronais tais como a linha de células do mesencéfalo Lund humano (LUHMES) um revestimento de poliaminas, ou polilisina (PL) ou poliornitina (PO), é necessário, como uma âncora electrostático. Além de proteínas de adesão tais como laminina ou a fibronectina são muitas vezes necessário que o revestimento de interface de integrina. No entanto, os revestimentos PL e PO prontamente ligam os neurônios, dificultando a entrega de microfluídica para os sites da matriz e também a imposição de tensões de cisalhamento indesejados. Para resolver este problema biomaterial em-chippadronização é necessária para localizar materiais de adesão nos sites armadilha e os microcanais conseqüência. Isso também promove o desenvolvimento de conexões inter-compartimento e reduz emaranhamento local. O protocolo envolve também a adição de materiais de PEG para áreas vizinhas para garantir as proteínas e os neurónios são restritas para os locais desejados durante a cultura prolongada. O protocolo seguinte é documentado na Figura 3: <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Água mascaramento para modelação prependicular biomaterial por plasma. A) Ilustração do processo de mascaramento água com os micropillars PDMS fixando os menisco de água no local para stencil plasma. A curvatura do menisco no plano vertical, tem sido negligenciado. B) uma máscara de água visualizadas com um corante vermelho e posicionada por menisco pinning. C) O estampados revestimento PL-FITC fotografada após stencil plasma. D) A adição de proteína rejeitar e repelente célula PLL-g-PEG-TRITC a um revestimento com estampas de plasma PL-FITC. Isto foi usado para o registro de células SH-SY5Y e também para padronizar uma camada de fibronectina adicional para células LUHMES. Figura e lenda reproduzido com permissão da Royal Society of Chemistry (RSC) 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <ol><li> Masking Água para in situ Biomaterial Patterning por Plasma Stenciling <ol><li> Pouco tempo depois da ligação de plasma pipeta de um volume de 0,5 ul de PL ou PO (100 ug / ml em PBS 1x) no centro da parte inferior da porta. Em questão de segundos, todo o circuito microfluídica é preenchido por ação capilar. Deixar durante alguns minutos para revestir completamente a superfície de PDMS hidrofílicos com a poliaminas. </li><li> Remover moléculas de poliamina não ligados por lavagem controlado por aspiração com 1x PBS (ver figura 2C) durante 1 min. </li><li> Remova toda a PBS dos portos e aquecer o dispositivo de iluminação com um microscópio. Isso aumenta a evaporação das portas para a formação da água máscara rápida. A máscara de água (ilustrado na Figura 3A e documentado na Figura 3B) é estabelecida dentro de ~ 5 min. </li><li> Inspecione o dispositivo por meio de microscopia para garantir mascaramento água está completa. Por favor note estruturas reservatório a montante do local de matriz estão incluídas no projecto de máscara para prolongar a estabilidade da máscara de água (~ 15 min). </li><li> Inserir pinos de aço inoxidável nas portas (Figura 2B). Estes são usados ​​para acoplar o plasma gerado por uma descarga de coroa à pressão atmosférica de mão ou gerador Tesla (por exemplo, operando a 2 MHz, de 30 de sinal kV) 19,20 para os canais de microfluidos vagos. Aponte a ponta da tele plasma fonte próxima à ponta de um alfinete e plasma tratar a microcanais para ≤ 1 seg. Use condições de pouca luz para observar padrões plasma. </li><li> Retire a máscara de água com uma etapa de lavagem. Use aspiração paralelo das 3 portas superiores. Use 4 comprimentos iguais de tubo de silicone conectado por um adaptador de 4 direções para uma bomba de aspiração de alcançar a aspiração paralelo. Comece aspiração e dispensar PBS nas 3 portas de fundo para desenhar PBS através do circuito de microfluídica. Desta maneira um material de contraste de PDMS-poliamina é produzido (veja a Figura 3C). PBS evacuar do circuito de microfluidos e deixar durante várias horas para restaurar o estado nativo, hidrofóbico. Isso torna os PDMS totalmente não-permissiva para adesão celular. </li><li> Deve materiais de adesão adicionais, tais como laminina ou fibronectina, ser necessário realizar as seguintes etapas são necessárias e deve ser feito imediatamente após a remoção da máscara de água: Pipetar um volume de 10 ul do enxerto de co-polímero de poli-L- Lisina-poli (etileno-glicol) (PLL-g-PEG, 100 ug / ml, em PBS), em ambos os canais de fundo de flanqueamento, seguindo-se a aspiração dos canais flanqueando superiores durante 2 min. </li><li> Sem interromper o fluxo, remover o excesso de PLL-g-PEG por troca com um tampão PBS. A selectivamente revestimentos das regiões não-revestido de poliamina com a unidade de PEG agir para evitar a adsorção de proteínas e adesão celular 17,21. </li><li> Proteínas de adesão, tais como laminina ou fibronectina, em seguida, pode ser co-localizada com o revestimento de poli-amina: Pipetar 10 ul de volume destas proteínas de ECM (tipicamente de 10 ug / ml) em todos os três portas inferiores. Aspirar a partir dos três portas superiores até que o dispositivo está cheio com a solução de proteína e incubar durante 1 hora para produzir um revestimento de boa qualidade. </li><li> Remover o excesso de proteínas, aspirando PBS a partir dos três portas inferiores. </li></ol></li><li> Microfluidic único neurônio arraying <ol><li> Prime os dispositivos com aprocomeu mídia. Adicionar 20 volumes ul às 3 portas inferiores e por aspiração paralelo de três portas superiores rapidamente encher o circuito microfluídicos com a mídia. Use um conector de tubulação de 4 vias para acoplar as 3 portas superiores através de tubos de silicone de tamanho igual a uma bomba de aspiração. </li><li> Adicionar 20 ul de uma suspensão de células desagregadas (1 x 10 6 células / ml) a cada uma das portas de entrada de flanqueamento (0, na Figura 1). </li><li> Equipar uma bomba de aspiração com um regulador de fluxo ou usar uma seringa para aspiração delicada das 3 portas superiores. Completa arraying neurônio tipicamente requer 1 min. </li><li> Colha os neurônios em excesso permanecem nos 4 portas de acompanhamento com uma pipeta para arraying em dispositivos microfluídicos subseqüentes. </li><li> Remova o tubo. Preencha todas as portas com a mídia e coloque o dispositivo na incubadora. Dentro de algumas horas, as células tornam-se totalmente aderente no padrão biomaterial. </li></ol></li><li> Cultura Neuron, Selective Fluidic Tratamento e Immunostaining <ol><li> Troque a mídia por perfusão periódica utilizando alimentação hidrostática (a 2 milímetros diferença de altura da coluna é adequadamente lento). </li><li> Alternativamente, mergulhe o dispositivo micro na mídia, trocando a mídia periodicamente (2-3 dias), como com culturas de células normais. </li><li> Tratamentos fluídicos selectivos para qualquer compartimento de cultura de neurónios ou o compartimento de crescimento de neurites central são atingidos como se segue: Pipetar 20 ul da substância de teste na porta de fundo do canal de interesse, e aspirado a partir da porta directamente acima. Para tratamentos longos reduzir a taxa de fluxo através de um regulador de fluxo e reabastecer a substância de teste, conforme necessário. </li><li> Protocolos de imunocoloração variam para cada alvo molecular e reagentes associados. Para contrariar o risco potencial de dano induzido pelo cisalhamento para os neurônios de uma taxa de fluxo lento foi usado. Isso resulta em aumento épocas de aplicação para aspergir completamente o sistema, estendendo tempos normais de protocolo. Hyperfusão drostatic usando portas com diferentes alturas de coluna (por exemplo, 2 mm) foi utilizada para fornecer os reagentes. Adição de reagente mais rápida e remoção utilizando uma bomba pode ser usada para reduzir os prazos experimentais. Ligue uma bomba de aspiração para as 3 portas superiores a desenhar a partir dos reagentes 3 portas inferiores. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+control+of+neurite+development+by+nerve+growth+factor.">Local control of neurite development by nerve growth factor.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 74 (10), 4516-4519 (1997).</li><li>Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+sympathetic+neurons+in+compartmentalized+cultures.+I.+Local+control+of+neurite+growth+by+nerve+growth+factor.">Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of neurite growth by nerve growth factor.</a> Dev Biol. 93 (1), 1-12 (1982).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+multicompartment+device+for+neuroscience+research.">Microfluidic multicompartment device for neuroscience research.</a> Langmuir. 19, 1551-1556 (2003).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2 (8), 559-565 (2005).</li><li>Kilinc, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian-like+degeneration+of+central+neurons+after+synchronized+and+geometrically+registered+mass+axotomy+in+a+three-compartmental+microfluidic+chip.">Wallerian-like degeneration of central neurons after synchronized and geometrically registered mass axotomy in a three-compartmental microfluidic chip.</a> Neurotox. Res. 19, 149-161 (2011).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+controlled+and+multifactor+involved+assay+of+neuronal+regeneration+after+chemical+injury+in+an+integrated+microfluidics.">Spatiotemporally controlled and multifactor involved assay of neuronal regeneration after chemical injury in an integrated microfluidics.</a> Anal. Chem. 84 (15), 6444-6453 (2012).</li><li>Kim, Y. T., Karthikeyan, K., Chirvi, S., Dave, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-optical+microfluidic+platform+to+study+injury+and+regeneration+of+single+axons.">Neuro-optical microfluidic platform to study injury and regeneration of single axons.</a> Lab Chip. 9, 2576-2581 (2009).</li><li>Hellman, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+axonal+injury+and+regeneration+in+micropatterned+neuronal+culture+using+pulsed+laser+microbeam+dissection.">Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection.</a> Lab Chip. 10 (16), 2083-2092 (2010).</li><li>Kunze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-pathological+connected+primary+neurons+in+a+microfluidic+device+for+Alzheimer+studies.">Co-pathological connected primary neurons in a microfluidic device for Alzheimer studies.</a> Biotechnol. Bioeng. 108 (9), 2241-2245 (2011).</li><li>Liu, W. W., Goodhouse, J., Jeon, N. L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+chamber+for+analysis+of+neuron-to-cell+spread+and+axonal+transport+of+an+alpha-herpesvirus.">A microfluidic chamber for analysis of neuron-to-cell spread and axonal transport of an alpha-herpesvirus.</a> PLoS One. 3 (6), (2008).</li><li>Markus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varicella-Zoster+virus+(VZV)+infection+of+neurons+derived+from+human+embryonic+stem+cells:+Direct+demonstration+of+axonal+infection,+transport+of+VZV,+and+productive+neuronal+infection.">Varicella-Zoster virus (VZV) infection of neurons derived from human embryonic stem cells: Direct demonstration of axonal infection, transport of VZV, and productive neuronal infection.</a> J. Virol. 85 (13), 6220-6233 (2011).</li><li>Dinh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+construction+of+minimalistic+neuronal+co-cultures.">Microfluidic construction of minimalistic neuronal co-cultures.</a> Lab Chip. 13 (7), 1402-1412 (2013).</li><li>Tan, W. H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+trap-and-release+integrated+microfluidic+system+for+dynamic+microarray+applications.">A trap-and-release integrated microfluidic system for dynamic microarray applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (4), 1146-1151 (2007).</li><li>Frimat, J. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+array+with+cellular+valving+for+single+cell+co-culture.">A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture.</a> Lab Chip. 11 (2), 231-237 (2011).</li><li>Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+enzyme+concentrations,+kinetics,+and+inhibition+analysis+using+high-density+hydrodynamic+cell+isolation+arrays.">Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays.</a> Anal. Chem. 78 (14), 4925-4930 (2006).</li><li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+network+formation+assay:+A+spatially+standardized+neurite+outgrowth+analytical+display+for+neurotoxicity+screening.">The network formation assay: A spatially standardized neurite outgrowth analytical display for neurotoxicity screening.</a> Lab Chip. 10, 701-709 (2010).</li><li>Hardelauf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fidelity+neuronal+networks+formed+by+plasma+masking+with+a+bilayer+membrane:+analysis+of+neurodegenerative+and+neuroprotective+processes.">High fidelity neuronal networks formed by plasma masking with a bilayer membrane: analysis of neurodegenerative and neuroprotective processes.</a> Lab Chip. 11 (16), 2763-2771 (2011).</li><li>Whitesides, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry.">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).</li><li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+bonding+by+means+of+a+portable,+low-cost+corona+system.">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).</li><li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+stencilling+methods+for+cell+patterning.">Plasma stencilling methods for cell patterning.</a> Anal. Bioanal. Chem. 395 (3), 601-609 (2009).</li><li>Huang, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene+glycol)+layers+on+metal+oxide+surfaces:+surface-analytical+characterization+and+resistance+to+serum+and+fibrinogen+adsorption.">Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption.</a> Langmuir. 17, 489-498 (2001).</li><li>Li, N., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+topographical+and+biochemical+cues+by+axons+during+growth+on+microfabricated+3-D+substrates.">Integration of topographical and biochemical cues by axons during growth on microfabricated 3-D substrates.</a> Exp. Cell Res. 311 (2), 307-316 (2005).</li><li>Huang, L. R., Cox, E. C., Austin, R. H., Sturm, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+particle+separation+through+deterministic+lateral+displacement.">Continuous particle separation through deterministic lateral displacement.</a> Science. 304 (5673), 987-990 (2004).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+nanoparticle+functionality+and+toxicity+on+the+central+nervous+system.">A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system.</a> J. R. Soc. Interface. 7, (2010).</li><li>Brenneman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+olfactory+transport+of+inhaled+manganese+((MnCl2)-Mn-54)+to+the+rat+brain:+Toxicokinetic+investigations+in+a+unilateral+nasal+occlusion+model.">Direct olfactory transport of inhaled manganese ((MnCl2)-Mn-54) to the rat brain: Toxicokinetic investigations in a unilateral nasal occlusion model.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 169 (3), 238-248 (2000).</li><li>Magal&#227;es, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+neuritic+transport+of+scrapie+prion+protein+coincident+with+infection+of+neuronal+cells.">Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells.</a> J. Neurosci. 25 (21), 5207-5216 (2005).</li><li>Diogenes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+alpha-synuclein+oligomers+modulate+synaptic+transmission+and+impair+LTP+via+NMDA-receptor+activation.">Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation.</a> J Neurosci. 32 (34), 11750-11762 (2012).</li><li>Egger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila.">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nat. Protoc. 8 (5), 958-965 (2013).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A técnica arraying microfluídica é o primeiro de seu tipo, que permite a manipulação de precisão único neurônio para o estabelecimento de culturas minimalistas. Juntamente com o método in situ padronização biomaterial, uma abordagem poderosa para alinhar os padrões celulares com estruturas microfluídicos, estas culturas minimalistas têm níveis de conectividade de alta intercompartimental com reduzida emaranhamento local. Estas características podem ser utilizadas para o estudo de eficiência de ...

<html> Tecido neuronal é altamente complexa; uma mistura heterogênea de celular que é espacialmente ordenados dentro camadas e compartimentos definidos e com conectividade de plástico através de contatos celulares e especialmente via axônio e dendrito excrescências. Novas técnicas são necessárias para conferir maior liberdade experimental para obter insights mais profundos e mecanismos centrais desvendar a doença, o desenvolvimento ea função saudável. A câmara Campenot 1,2 e, mais recentemente, microfabricados concretizações 3,4 pode ser usado para a preparação ex vivo de rede neuronal co-culturas com a capacidade de perturbar selectivamente as diferentes populações somáticas e também as suas excrescências de neurites. Estes dispositivos microfluídicos têm, por exemplo, foram usados ​​para estudar a degeneração de axônios e regeneração seguinte químico 5,6 ou laser axotomia 6-8, tauopathy 9, a disseminação viral 10,11, e localização de mRNA em axônios 4. ent &quot;&gt; Para ampliar o alcance dos neurobiólogos, os avanços tecnológicos são necessários para preparar minimalistas neuronais co-culturas. Isso permite disentanglement da rede neuronal para a investigação do sistema com uma única célula e precisão sub-celular. O requisito mínimo para o número de células é aberta a possibilidade de analisar os tipos de células raras, incluindo células dopaminérgicas substantia nigra relevantes para a doença de Parkinson, gânglios espirais do ouvido, os neurónios periféricos, e células estaminais. Além disso, a economia celular é relevante para a iniciativa 3Rs. Usando essas plataformas microfluídicos, telas de toxicidade em grande escala ou outra alta taxa de transferência, os dados rico série experimental exigindo neurônios animais já pode ser considerado. Neste trabalho são descritos os protocolos para a fabricação e uso de um dispositivo micro. Arraying microfluídicos em combinação com um em biomateri situmétodo de padronização al pode ser utilizado para o registro de altamente interconectadas co-culturas de neurônios que usam números de celular mínimos. Arraying microfluídico se baseia numa abordagem de fluxo diferencial de 12-15, em que armadilhas microestruturados são posicionadas dentro de um circuito de fluido (ilustrado, juntamente com imagens de MEV da Figura 1). O caminho 0 → 1 tem a resistência mais baixa de fluidos (R2&gt; R 1) para o transporte de neurónios de um conjunto linear de aberturas microestruturadas - As entradas para os canais de crescimento de neurites. Ocupação da armadilha por uma única célula localmente impede o fluxo para desviar as linhas de corrente para capturar células subseqüentes em armadilhas vizinhos. Ocupação completa das armadilhas na matriz de liga a proporção de fluidos (1 R&gt; R 2) para desviar as linhas de corrente para o trajecto sinuoso (0 → 2) para produzir um modo de operação manual para a remoção de excesso de neurónios. Figura 1. Microfluidic Circuit. A) O circuito de resistência diferencial fluídico para arraying único neurônio, com flanquear câmaras cultura interligados por canais de crescimento de neuritos. B, imagens C) SEM da bicamada neurônio compartimentada co-cultura array com menisco fixando micropillars. Com este projeto, as estruturas de neurônio de captura em forma de tridente foram usados ​​para promover fasciculation das excrescências neurite. Figura e lenda reproduzido com permissão da Royal Society of Chemistry (RSC) 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> A preparação de redes neuronais micropatterned em substratos planares pode ser facilmente alcançada (para exampl<html> es do nosso grupo, ver Frimat et al. 16 e Heike et al. 17). No entanto, encapsulando padrões materiais bioativos dentro de dispositivos de PDMS e com a exigência de alinhamento micrômetro escala destes para os canais microfluídicos representa um grande desafio técnico. Na seção 3.1 um protocolo para a em-chip, ou in situ, a preparação de padrões de biomateriais é apresentado. Esses padrões permitem registro neurônio durante prazos longos de cultura e promover outgrowths entre os compartimentos. Microestruturas menisco-pinagem são usados ​​para alinhar uma máscara de água chamado com o neurônio arraying sites e canais de crescimento de neuritos. A máscara de água protege revestimentos moléculas de adesão durante o tratamento de plasma, enquanto que as superfícies expostas são desintegrados para definir o padrão biomaterial. Além disso, os protocolos são fornecidos para a cultura de células e para o isolamento de fluidos necessários para o tratamento selectivo dos diferentes compartimentos de co-cultura. ve_content &quot;&gt; Os protocolos são projetados para alavancar os princípios user-friendly de litografia suave para a replicação de poli (dimetilsiloxano) (PDMS) dispositivos microfluídicos 18. Da mesma forma, em biomaterial situ padronização é simples, explorando de evaporação de superfície e fenômenos de tensão, e só exigindo uma fonte de plasma de mão barato. microfluídicos O circuito de forma eficaz os programas de carregamento do compartimento celular e tratamentos específicos que fazem essas operações simplesmente uma questão de distribuição de materiais na porta inferior correto e aspiração de cima. Desta forma, pretende-se dar os neurobiólogos a liberdade de preparar e utilizar dispositivos microfluídicos em seus próprios laboratórios.

<table><tbody><tr><td>PDMS Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS Elastosil RT 601</td><td>Wacker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR</td><td>630-1590</td><td>130-160 mm thick</td></tr><tr><td>3 mm biopsy punches</td><td>Kai Medical</td><td></td><td>Handle with care - extremely sharp</td></tr><tr><td>Tygon tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-50-HL</td><td>1.65 mm ID; 3.35 mm OD</td></tr><tr><td>1 ml syringe (Inkjekt and Omnifix)</td><td>Braun</td><td>6064204</td><td></td></tr><tr><td>4-Way tubing connector</td><td>VWR or Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow regulator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>722645</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm pins</td><td>Dressmaking Departments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td><td>Stability in storage can be an issue</td></tr><tr><td>poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Polylysine-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3069</td><td></td></tr><tr><td>Polyornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Inverted fluorescent microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Example aspiration pump</td><td>KNF Neuberger, Laboport</td><td>N811KVP</td><td></td></tr><tr><td>Hand held corona discharge device</td><td>Leybold-Heraeus, USA</td><td>VP23</td><td>May not comply with your country&#039;s safety standards</td></tr><tr><td>Femto plasma oven</td><td>Diener Electronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacuum dessicator or centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of neuronal co-cultures with single cell precision

Realizações microfluídicos da câmara Campenot têm atraído grande interesse da comunidade da neurociência. Estas plataformas de co-cultura interligados pode ser usado para investigar uma variedade de questões, abrangendo desenvolvimento neurobiologia e funcional para a infecção e propagação da doença. No entanto, os sistemas convencionais requerem entradas significativas celulares (muitos milhares por compartimento), inadequados para o estudo de células de baixa abundância, como nigra primário dopaminérgico substantia, gânglios espiral, e os neurônios melanogaster Drosophilia e impraticável para a experimentação de alto rendimento. As culturas densas são também altamente enredada localmente, com algumas excrescências (&lt;10%) que interligam as duas culturas. Neste trabalho protocolos microfluídicos e padronização simples são descritos que enfrentar esses desafios: (i) um neurônio único microfluídicos método arraying, e (ii) um método de mascaramento de água para revestimentos de biomateriais padronização de plasma para register neurônios e promover crescimento entre os compartimentos. Minimalista neuronais co-culturas foram preparadas com de alto nível (&gt; 85%) conectividade intercompartimental e pode ser usado para experimentos neurobiologia alto rendimento com precisão uma única célula.

Exploits mascaramento Água tensão superficial. A tolerância de pressão na interface ar-líquido escalas inversamente com o raio de curvatura [ <img fo:content-width="1in" src="files/ftp_upload/51389/51389eq1.jpg" width="113" /> , Produzindo as interfaces altamente estáveis ​​em dimensões de microfluidos. Os micropillars efetivamente ancorar a máscara de água no local. Formação máscara água é conduzida através de evaporação a partir das portas de microfluidos, com a taxa de aumento de aquecimento. Usa...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision at JoVE.com

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Protocolos para único neurônio microfluídicos arraying e mascaramento de água para a padronização dos revestimentos de biomateriais plasma em-chip são descritos. Altamente interligados co-cultura pode ser preparado através de entradas de células mínima.

Preparação de Neuronal co-culturas com precisão única célula

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

preparation-of-neuronal-co-cultures-with-single-cell-precision

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K visualizações.  ISAS.  Protocolos para único neurônio microfluídicos arraying e mascaramento de água para a padronização dos revestimentos de biomateriais plasma em-chip são descritos. Altamente interligados co-cultura pode ser preparado através de entradas de células mínima. 

Vídeo: Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Biologia do Desenvolvimento

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Preparação de Dissociated rato Culturas Neuron Cortical

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Biologia

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminar Co-cultura de neurônios de rato Primária Cortical e Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Neurociência

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

Isolamento e cultivo de células neurais embrionárias de ratos: um protocolo rápido

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (&#947;-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials. 
During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other. 
To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

The molecular mechanisms that co-ordinate the formation of inhibitory GABAergic synapses during ontogeny are largely unknown. To study these processes,we have developed a co-culture model system which incorporates embryonic medium spiny GABAergic neurons cultured together with stably transfected human embryonic kidney 293 (HEK293) cells expressing functional GABAA receptors.

Formação Sinapse Inibitória em uma co-cultura-tipo que comportem GABAérgicos espinhosos médios neurônios e células HEK293 expressando estavelmente GABA<sub&gt; A</sub&gt; Receptores

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up para a investigação detalhada da Relação Neuron-glia

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

A Scalable Method to Study Neuronal Survival in Primary Neuronal Culture with Single-cell and Real-Time Resolution

Neuronal loss is at the core of many neuropathologies, including stroke, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. Different methods were developed to study the process of neuronal survival upon cytotoxic stress. Most methods are based on biochemical approaches that do not allow single-cell resolution or involve complex and costly methodologies. Presented here is a versatile, inexpensive, and effective experimental paradigm to study neuronal survival. This method takes advantage of sparse fluorescent labeling of the neurons followed by live imaging and automated quantification. To this aim, the neurons are electroporated to express fluorescent markers and co-cultured with non-electroporated neurons to easily regulate cell density and increase survival. 
Sparse labeling by electroporation allows a simple and robust automated quantification. In addition, fluorescent labeling can be combined with the co-expression of a gene of interest to study specific molecular pathways. Here, we present a model of stroke as a neurotoxic model, namely, the oxygen-glucose deprivation (OGD) assay, which was performed in an affordable and robust homemade hypoxic chamber. Finally, two different workflows are described using IN Cell Analyzer 2200 or the open-source ImageJ for image analysis for semi-automatic data processing. This workflow can be easily adapted to different experimental models of toxicity and scaled up for high-throughput screening. In conclusion, the described protocol provides an approachable, affordable, and effective in vitro model of neurotoxicity, which can be suitable for testing the roles of specific genes and pathways in live imaging and for high-throughput drug screening.

Here, we present a simple, potent, and versatile methodology to investigate neuronal survival upon cytotoxic stress in primary cortical neurons with cellular resolution in real time or in fixed material.

Neuronal loss is at the core of many neuropathologies, including stroke, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. Different methods were developed to ...

 Protocolo de co-cultura primária de microglia e neurônio para estudos de interação do SNC

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

Autor em destaque: Modelo de co-cultura in vitro para estudar interações microglia-neuronais em condições de doença

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.

Preparação de Neuronal co-culturas com precisão única célula

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

Preparação de Dissociated rato Culturas Neuron Cortical

Bilaminar Co-cultura de neurônios de rato Primária Cortical e Glia

Isolamento e cultivo de células neurais embrionárias de ratos: um protocolo rápido

Formação Sinapse Inibitória em uma co-cultura-tipo que comportem GABAérgicos espinhosos médios neurônios e células HEK293 expressando estavelmente GABA

A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An

A Scalable Method to Study Neuronal Survival in Primary Neuronal Culture with Single-cell and Real-Time Resolution

Geração e co-cultura de microglia primária murina e neurônios corticais

Geração e co-cultura de microglia primária murina e neurônios corticais

Geração e co-cultura de microglia primária murina e neurônios corticais