Nosso protocolo descreve o uso de um biosensor de peróxido de hidrogênio em neurônios e larvas de zebrafish cultivados. Este protocolo ajudará os pesquisadores a dissecar o papel das espécies reativas de oxigênio na fisiologia e fisiopatologia normais. A principal vantagem dessa técnica é a detecção em tempo real do peróxido de hidrogênio em animais vivos e células cultivadas.
Este método pode ser aplicado a outros animais, como o sistema modelo de roedores. Para preparar as tampas, utilize tampas limpas com ácido armazenadas em 100% etanol. Use fórceps para remover uma mancha de cobertura do recipiente de armazenamento e flame-o para remover o etanol residual.
O ar seca completamente a mancha de cobertura colocando-a em um ângulo dentro de um prato de cultura de 35 milímetros. Prepare Poly-D-Lysine ou PDL, ou solução de trabalho. Aplique PDL no centro de cada deslizamento de cobertura, evitando a disseminação da solução para as bordas e incubar o PDL por 20 a 30 minutos em temperatura ambiente.
Certifique-se de que o PDL não seque. Lave o PDL com 0,5 mililitros de água estéril e deixe as placas secarem completamente. Prepare a solução de trabalho laminin.
E aplique-o no centro de cada deslizamento de cobertura, certificando-se de evitar a disseminação da solução para as bordas. Incubar as placas a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada por duas a seis horas, evite uma secagem da solução de laminina. Para realizar uma dissecção de embriões em células de gânglios de retina ou RGCs, prepare e rotule quatro pratos de cultura tecidual de 35 milímetros e encha-os com quatro mililitros de 70% de etanol.
E2 mídia um. E2 mídia dois. E e a mídia E2 três, no dia da dissecação.
Mantenha os pratos na geladeira. Quando os embriões de zebrafish estiverem 34 horas após a fertilização, leve os pratos de cultura revestidos com laminina para fora da incubadora. E lave os deslizamentos de tampa três vezes com 0,5 mililitros de 1X PBS.
Após a lavagem final, adicione quatro mililitros de ZFCM+mídia a cada prato de cultura. Evite secar a placa. Recupere os pratos de cultura refrigerada preparados e deixe-os equilibrar à temperatura ambiente.
Encha de quatro a seis tubos PCR com 15 microliters de ZFCM+media. Recupere embriões de zebrafish da incubadora e mergulhe em embriões em um prato de cultura tecidual de 35 milímetros contendo 70% de etanol por 5-10 segundos para esterilizá-lo. Usando uma transferência de pipeta, transfira embriões para o prato de mídia E2, contendo mídia E2 estéril para lavar o excesso de etanol.
Em seguida, transfira os embriões para a mídia E2 dois pratos e remova seus acordes com fórceps afiados. Finalmente, transfira embriões para a mídia E2 três prato para realizar dissecções. Usando um par de fórceps finos, posicione e segure os embriões anteriores à gema com um dos fórceps.
E remova a cauda posterior para o saco de gema com as outras fórceps. Pegue o pescoço com fórceps e tire a cabeça para expor o cérebro e os olhos à mídia E2. Com a ponta de fórceps finos, revira suavemente os olhos da cabeça enquanto segura o tecido craniano para baixo com um segundo fórceps.
Transfira quatro olhos para um dos tubos previamente preparados contendo ZFCM+Gently triturar para cima e para baixo com uma pipeta p20 cerca de 45 vezes para dissociar células. Transfira o ZFCM+com as células dissociadas para o centro das tampas. Mantenha culturas na parte superior do banco a 22 graus Celsius em um rack de espuma de poliestireno para absorver vibrações.
No dia da imagem, verifique as células sob o microscópio para validar o crescimento dos axônios de RGC. Para imagens de células vivas, transfira as tampas do prato de cultura para uma câmara de imagem celular viva. Use um microscópio invertido equipado com um filtro vermelho DIC objetivo OG-590 Longpass e uma câmera EMCCD.
Antes da imagem, substitua o meio ZFCM+por ZFCM-Depois de posicionar as células com o objetivo de 10X, adquira imagens a ampliação de 60X usando um objetivo de imersão de óleo. Use uma ampliação adicional de 1,5X. Primeiro adquira imagens DIC.
Em seguida, imagem roGFP2-Orp1, usando o conjunto de filtros apropriado. Depois de tirar o primeiro conjunto de imagens, troque mídia com mídia contendo diferentes soluções de tratamento. A mídia deve ser alterada a cada 30 minutos de imagem para evitar alterações de pH e osmolaridade.
Para imagens in vivo, mantenha embriões pós-fertilização de 22 a 24 horas em meio E3, contendo 0,003% de tiorea fenil sem azul de metileno. Troque mídia e remova embriões mortos diariamente. Na idade desejada, anestesiar e montar embriões em 1%de agarose em pratos de cultura de fundo de vidro de 35 milímetros.
Os embriões podem ser orientados dorsalmente, ventricamente ou lateralmente, dependendo da região de interesse para a imagem. Depois que a agarose solidificar, encha os pratos com mídia E3 sem azul de metileno, mas com 0,016%tricaine. Configure o microscópio para imagens.
Use um microscópio confocal de varredura a laser invertido para imagens montadas na parte inferior de uma gota de agarose. Excite roGFP2-Orp1 e adquira imagens correspondentes com os filtros de emissão desejados. Adquira pilhas z com espessura de seção de cinco micrometros através da parte desejada dos embriões.
Após a imagem, remova os embriões de Agarose com fórceps finos e mantenha-os na incubadora e mídia livre de metileno azul com tiorea fenil até a idade desejada. Uma imagem representativa do biosensor de peróxido de hidrogênio e dos axônios estendidos RGC de peixe-zebra cultivado é mostrada aqui. O corpo celular, o axônio e os cones de crescimento são claramente visíveis em neurônios individuais.
A adição de peróxido de hidrogênio à mídia cultural aumenta os valores de proporção, mostrando que mudanças em tempo real podem ser detectadas com este sistema. A quantificação dos níveis de peróxido de hidrogênio é mostrada no painel B.To determinar os níveis de peróxido de hidrogênio em embriões inteiros de zebrafish, o mRNA foi injetado durante o estágio de uma célula, fazendo com que todos os tecidos expressassem o biosensor roGFP2-Orp1. A região principal das larvas de zebrafish é mostrada em dois pontos de tempo diferentes, focando nos níveis de peróxido de hidrogênio na retina.
Os níveis basais de peróxido de hidrogênio nos embriões de zebrafish em dois dias após a fertilização e cinco dias após a fertilização foram medidos. Em dois dias após a fertilização, os valores de razão foram significativamente menores do que em cinco dias após a fertilização. Além disso, cada animal mostrou um nível diferente de aumento no teor de peróxido de hidrogênio da retina.
O uso de fórceps finos para remover os olhos e a dissociação suave dos olhos com a pipeta são os passos mais críticos neste procedimento. Este protocolo pode ser seguido por tratamentos medicamentosos para investigar os fatores envolvidos na sinalização ros.
