1. Preparação prato <ol><li> Pratos utilizados para a cultura fatia são de vidro de fundo (com uma lamela como a base) (pratos WillCo). Estes são colocados sobre o tecido da lente em um prato de 6 centímetros de cultura de tecidos para manter o fundo de vidro limpo. </li><li> No dia antes da experiência, adicionar 2 ml 0,1% de solução de poli-L-lisina para o prato de vidro de fundo e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para permitir que o poli-L-lisina revestir o fundo de vidro. </li><li> Remover a poli-L-lisina solução e lavar três vezes em água desionizada, e depois uma vez em etanol a 70%. </li><li> Deixar a secar durante a noite. Pratos podem também ser secos por aquecimento suave num microondas em baixa potência durante 30-45 segundos. </li></ol> 2. Eletroporação embrião <ol><li> Incubar ovos a 37 ° C a Hamburger-Hamilton (HH) estágio 10 (~ 36 horas) (ou fase desejada outro). </li><li> Antes de começar preparar as agulhas de vidro (utilizamos uma flamejante / Brown modelo P87 extrator microcapilar) e quebrar a ponta da needle utilizando um fórceps finos sob um microscópio de dissecação. A extremidade da agulha deve ser afiado o suficiente para perfurar o embrião, embora não sendo tão estreita que impede a injecção da solução de ADN. </li><li> Ovos de janela e eléctrodos lugar (5 milímetros de intervalo) em ambos os lados do embrião </li><li> Injectar DNA (~ 0,025-0,5 mg / ul em água desionizada colorido com uma pequena quantidade de verde rápido) para dentro do tubo neural. </li><li> Aplicar atual - 12-17 V três vezes, o comprimento do pulso de 50ms com 950 ms entre os pulsos. </li><li> Usamos baixas concentrações de DNA e tensões eletroporação baixos para alcançar expressão mosaico para que possamos seguir células individuais. </li><li> Cubra janela na casca do ovo com durex e verifique se ele está selado. </li><li> Permitir que os embriões para recuperar durante 3-4 horas ou durante a noite a 37 ° C. </li></ol> 3. Colágeno e Slice Preparação Meio de Cultura <ol><li> Preparar a mistura de colágeno e meio de cultura fatia cerca de uma hora antes de fatiar. </li><li> Para 300 t uLipo colagénio 1 adicionar 100 uL de solução de ácido acético a 0,1% e 100 uL de 5 x meio L15. Vortex bem após cada adição. A solução deve virar amarelo. </li><li> Agora adicionar bicarbonato de sódio 15-20 ul de 7,5% e completamente vórtice. A solução deve tornar-se ligeiramente cor de rosa, eo volume de bicarbonato de sódio necessária para este pode diferir. Manter em gelo e fazer-se fresco a cada vez. </li><li> A 10 ml de meio neurobasal adicionar B-27 e suplemento Glutamax, para uma concentração de 1 x 10 solução final e gentamicina uL. </li><li> Médio lugar numa incubadora a 37 ° C tamponada com 5% de CO 2. Deixar a parte superior do recipiente para permitir que ele solto para equilibrar com a 2 CO. </li></ol> 4. Cultura Slice <ol><li> Remover embriões de ovos e lave em meio L15. </li><li> Colocar em um prato de cultura de tecidos com uma camada de Sylgard na parte inferior e fixá-los para fora através das vizinhas membranas extra-embrionárias de modo que eles são esticada. </li><li> Usando um microfoneroknife, embrião fatia mais reto possível através da região de interesse. Para medula espinal, as fatias deve estar entre 1-2 sómitos de espessura. Deixe fatias ligados ao embrião, enquanto você corta outros embriões que você não perdê-los. </li><li> Prepara-se uma ponta 200 uL micropipeta cortando ~ 1 mm da ponta e anexando presente a um p2 ou p10. Esta ponta vai ser usado para transferir as fatias da medula espinal ao prato fundo de vidro. Uma dica 10 ul não é ampla o suficiente para pegar fatias. </li><li> Revestir o interior da ponta com colagénio por pipetagem de 1 uL de colagénio mistura preparada anteriormente. Deixe por 1-2 minutos e depois lave com L15 médio. Isto impedirá que o tecido de furar para o interior da ponta. </li><li> Destaque fatia do embrião usando um microlanceta e retire do prato usando um p2 ou p10 equipado com uma ponta de 200 ul e definido para 1 ml. Tente tomar-se como meio mínimo possível. </li><li> Agitar a mistura de colagénio e gota 5-8 uL desta para o prato de poli-L-lisina revestido. </li><li> Immediadamente colocar fatia embrião em colágeno e posição no lugar com um par de pinças finas. Fatias devem ser posicionado de modo que o lado a ser trabalhada é nivelada com a lamela. O tecido deve aderir o revestimento de poli-L-lisina sobre a lamela. </li><li> Repita este procedimento até ter várias fatias na lamela. Em geral podemos colocar 6-9 fatias em um prato. </li><li> Uma vez que todas as fatias estão no lugar, cobrir o prato e permitir que o colagénio para definir durante 20 minutos. Alguns dos primeiros colocados do colágeno pode já ter começado a secar. Para evitar este adicionar uma pequena quantidade de L15 a estes antes de cobertura. </li><li> Uma vez ajustado, cuidadosamente adicionar meio de cultura 2ml fatia que tem sido equilibrada em CO2 a 5% a 37 ° C durante pelo menos uma hora. Cuidados devem ser tomados para não desalojar o colágeno da lamela. </li><li> Colocar em um 37 ° / 5% de CO 2 incubadora e permitir que as fatias para recuperar durante pelo menos 3 horas antes de imagem. Se não houver umidade prato, colocar em uma sagacidade caixa de acrílicoha pouco de papel de filtro humedecido em um canto. </li></ol> 5. Embrião Fatias de imagem <ol><li> Nós usamos um Core DeltaVision microscópio de campo amplo equipado com uma câmara EstaçãoMeteorológica ambiental para fatias de imagem. A câmara é constantemente mantido a 37 ° C, com um aparelho de perfusão CO 2 para manter a fase microscópio em 5% de CO 2 / ar de 95%. </li><li> Imagens é normalmente levada a cabo usando um 40 x / 1,30 NA lente de imersão em óleo e as imagens são capturadas com um HQ2 CoolSnap arrefecida câmara CCD. </li><li> Z-seções são capturadas a cada 1,5 mM por 45 mM de tecido. Tempo de exposição deve ser mantida tão baixa quanto possível. Nós normalmente expor para 5-50 ms para cada Z-seção. As imagens são capturadas a cada 7 minutos e até 9 fatias pode ser visitada usando ponto preciso do sistema DeltaVision de visitar função. </li></ol> 6. Os resultados representativos Um exemplo de seqüência de lapso de tempo de uma célula da medula espinhal progenitor émostrado na fig. 2a e filme correspondente 1. Imagem foi iniciado em uma fatia da medula espinhal de um dois dias de idade embrião (HH estádio 12). Esta célula foi transfectada com um construto expressando GFP αTubulin. Durante esta fase inicial, as células progenitoras neurais sofrer divisões predominantemente progenitora progenitoras de modo durante o qual as células se dividem para gerar duas células progenitoras mais ciclismo. Fig. Filme 2b e correspondente 2 mostra uma célula transfectada com GFP-GPI (GPI ancorada GFP), a marcação da membrana celular. Esta célula sofre uma divisão durante o qual o processo se divide em dois basal e é igualmente herdado pelas células filhas. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig1.jpg" /> Figura 1. Protocolo Slice para cultura de lapso de tempo de imagem. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig2.jpg" /> Figura 2. B célulaehavior durante o desenvolvimento normal de medula espinhal. (a) quadros selecionados de Movie 1. Celular expressando GFP-tubulina divide com um plano de clivagem que é perpendicular à superfície apical (2 h 20 min), gerando duas células filhas que dividem mais uma vez (24 h 23 min e 25 h 54 min). (B) os quadros selecionados do filme 2. Células transfectadas com GFP-GPI sofre a divisão celular durante o qual o processo é dividido basal (setas brancas) e igualmente herdado pelas células filhas. Filme 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">Clique aqui para ver filme</a> . Filme 2. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">Clique aqui para ver filme</a> .

<ol>
	<li>Ulloa, F., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogens+and+the+Control+of+Cell+Proliferation+and+Patterning+in+the+Spinal+Cord.">Morphogens and the Control of Cell Proliferation and Patterning in the Spinal Cord.</a> Cell Cycle. 6, 2640-2649 (2007).</li><li>Briscoe, J., Novitch, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+pathways+linking+progenitor+patterning,+cell+fates+and+neurogenesis+in+the+ventral+neural+tube.">Regulatory pathways linking progenitor patterning, cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363, 57-70 (2008).</li><li>Shiau, C., Das, R., Storey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+assay+for+high+cellular+resolution+time-lapse+imaging+of+sensory+placode+formation+and+morphogenesis.">An effective assay for high cellular resolution time-lapse imaging of sensory placode formation and morphogenesis.</a> BMC Neuroscience. 12, 37 (2011).</li><li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. 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G., Henrique, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+reporter+of+notch+signalling+indicates+regulated+and+random+notch+activation+during+Vertebrate+neurogenesis.">A novel reporter of notch signalling indicates regulated and random notch activation during Vertebrate neurogenesis.</a> BMC Biology. 9, 58 (2011).</li><li>Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Bios Scientific Publishers. , (1998).</li><li>Conchello, J. -. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+microscopy.">Optical sectioning microscopy.</a> Nat. Meth. 2, 920-931 (2005).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+performance+in+three-dimensional+fluorescence+microscopy.">Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 228, 390-405 (2007).</li><li>Biggs, D. S. 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U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging:+Opportunities,+limitations,+and+challenges.">Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Apresentamos aqui um ensaio de imagem romance lapso de tempo para monitorar o comportamento das células em cultura de frango fatia embrionário. Este ensaio permite imagens de alta resolução de tecido vivo por até 70 horas, embora os prazos entre 24-48 horas são mais fáceis de capturar. A utilização de uma objectiva de óleo elevado NA e intervalos de tempo relativamente curtos entre os pontos de aquisição de imagem permite em alta resolução, bem como nos permitindo controlar o comportamento das células, que muitas vezes ocorre rapidamente, e pode ser facilmente perdido durante imagiologia lapso de tempo convencional utilizando confocal microscopia. A principal vantagem deste ensaio é a capacidade de células de imagem ao longo de períodos longos de tempo. A utilização de gama-campo 6 em vez de laser confocal 7 microscopia é crítico para este. A microscopia confocal tem tradicionalmente oferecia várias vantagens sobre gama microscopia de campo, incluindo a capacidade de tomar secções ópticas e eliminar de informações diretamente foco <sup&gt; 7, mas o uso de um furo de pino conduz a uma perda de luz para o detector de 8, excluindo uma quantidade significativa de informação, e que necessitam de tempos de exposição mais longos. Gama microscopia de campo, por outro lado, utiliza iluminação de campo completo e todos passagem da luz através do objectivo é enviado para o detector. Isto acoplado com uma elevada eficiência quântica arrefecida com dispositivo de acoplamento de câmara (CCD) assegura de imagem com uma alta relação sinal-ruído em comparação com microscopia confocal 9, com tempos de exposição muito rápidos. Em nossa aplicação, devemos imagem por longos períodos, registro pilhas 3D e, finalmente, resolver pequenos de difração de quase-estruturas limitadas. Embora microscopia confocal impede fora-de-foco de luz sempre de alcançar o detector e assim reduz significativamente fundo em espessura, densamente-rotulados amostras 7, 8, ele só atinge uma relação sinal-ruído utilizável com a entrada de luz muito maior do que largo microscopia de campo 10. Para sparsel muito sensível à luzamostras y-rotulados como nossos eletroporados fatias de medula espinhal, portanto, ampla microscopia de campo tem um desempenho melhor do que a microscopia confocal. Quando combinado com restauração de imagem por deconvolução, que remove as informações de foco e melhora o contraste, campo-larga é então particularmente bom para a detecção de objetos pequenos, dim 11. Apesar de não ser apropriado para cada experimento tissular, esta abordagem tem sido muito eficaz para a nossa aplicação de células vivas de imagem. A escolha de proteína fluorescente é um factor importante que pode influenciar a sobrevivência celular. Descobrimos que os melhores resultados são obtidos a partir de construções que utilizam a proteína fluorescente verde (GFP) 12 como um marcador. Estamos neste momento a avaliar uma série de proteínas fluorescentes vermelhas que podem ser efetivamente utilizados em combinação com GFP para dual channel lapsos de tempo. Há uma variedade de tais proteínas disponíveis 13. Embora muitas proteínas são estáveis ​​como fusões com uma proteína fluorescente, Algumas proteínas podem ser processado por fusão instável, resultando na viabilidade celular reduzida. Em tais casos, a utilização de construções que contêm um local de entrada interna ribossoma (IRES) é útil para separar a proteína de interesse a partir da proteína fluorescente. Obtenção de imagens de fatias de medula espinhal, cuidados devem ser tomados para minimizar a exposição à luz fluorescente. As oculares do microscópio deve ser usado somente com luz transmitida (brightfield) para localizar e posição fatias. Imagens fluorescentes devem sempre ser adquiridos utilizando o software microscópio usando tempos de exposição mínimos. Estes devem ser mantidos na gama de 5-50 ms eo uso de filtros de densidade neutra deve ser experimentado. Embora os tempos de exposição mais longos podem, inicialmente, produzir imagens claras, os efeitos fototóxicas de exposição à luz fluorescente pode conduzir à morte celular. Os primeiros 5-10 iM de tecido que está mais próxima da lamela não deve ser trabalhada como esta região contém tecido que pode ter sido danificado durantecorte. Embora os exemplos aqui apresentados são de embriões electroporado em HH fase 10 e fotografada 6-7 horas mais tarde, este método pode ser usado para os embriões até HH fase 18. Em fases posteriores, o tecido da medula espinal é muito maior e assim é difícil de cortar com a mão. Nestes casos, a incorporação dos embriões em baixo ponto de fusão de agarose e corte com um vibratome pode produzir melhores resultados. Mesmo que apresentam este ensaio como um método para células de imagem na medula espinhal em desenvolvimento, esta abordagem também tem sido modificado para outros tecidos embrionários de imagem, incluindo o placódios sensorial 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> WillCo Dish </td><td> WillCo Wells </td><td> GWst-3522 </td><td></td></tr><tr><td> poli-L-lisina </td><td> Sigma </td><td> P8970 </td><td> 0,1% em Tris </td></tr><tr><td> Borosilicato capilares de vidro </td><td> Harvard Instruments </td><td> GC100-10 </td><td> Diâmetro exterior 1,0 milímetros, Diâmetro interno 0,58 milímetros </td></tr><tr><td> Eléctrodos (Genetrodes, em ovo, em forma de L </td><td> BTX </td><td> 10-001850-01 </td><td> 5 milímetros ouro plaqueada </td></tr><tr><td> ECM 830 quadrado gerador de pulso </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td> no electroopration in ovo </td></tr><tr><td> Verde rápido </td><td> Sigma </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> O colágeno tipo I rato </td><td> Sigma </td><td> C3857 </td><td></td></tr><tr><td> L-15 médio (em pó) </td><td> Sigma </td><td></td><td> 2,76 g / L em água destilada para solução de 5x </td></tr><tr><td> O bicarbonato de sódio </td><td> Sigma </td><td> S8761 </td><td> Solução 7,5% </td></tr><tr><td> Médio Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 12348-017 </td><td> sem vermelho de fenol </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> A1286001 </td><td> Solução 100x </td></tr><tr><td> B-27 suplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15710049 </td><td> 10 mg / ml </td></tr><tr><td> L15 médio (líquido 1x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Microlanceta </td><td> Altomed </td><td> A10102 </td&gt; <td> 15 graus de inclinação </td></tr><tr><td> Pinos de aço inoxidável sem cabeça </td><td> Watkins e Doncaster </td><td> E6871 </td><td> Tamanho A1 </td></tr><tr><td> Sylgard elastômero 184 </td><td> VWR </td><td> 634165S </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision sistema de microscópio núcleo </td><td> Precisão Aplicada </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coolsnap HQ2 câmera CCD </td><td> Photometrics </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

high-resolution live imaging of cell behavior in the developing neuroepithelium

O cordão espinal embrionária consiste de ciclismo células progenitoras neurais que dão origem a uma grande percentagem das células neuronais e gliais do sistema nervoso central (SNC). Embora muito se sabe sobre os mecanismos moleculares que padrão a medula espinhal e provocar a diferenciação neuronal 1, 2, falta-nos um profundo entendimento desses eventos iniciais ao nível do comportamento das células. É, portanto, crucial para estudar o comportamento de células progenitoras neurais em tempo real, como se submetem a neurogênese. No passado, imagem em tempo real do tecido embrionário inicial tem sido limitada pela célula / tecido viabilidade em cultura, assim como os efeitos fototóxicas de imagem fluorescente. Apresentamos aqui um ensaio de novo para a imagiologia de tecido, tais por longos períodos de tempo, utilizando um novo protocolo de cultura ex vivo fatia e de campo largo microscopia de fluorescência (Fig. 1). Essa abordagem alcança monitoramento de longo prazo de lapso de tempo de pinto embrionário scélulas do cordão pinal progenitoras com resolução espacial e temporal. Este ensaio pode ser modificado para a imagem de uma gama de tecidos embrionários 3, 4 Para além da observação de comportamentos celulares e sub-celular, o desenvolvimento de novos e repórteres altamente sensíveis para a actividade do gene (por exemplo, sinalização Notch 5) faz com que este ensaio uma ferramenta poderosa com a qual compreende como sinalização regula o comportamento celular durante o desenvolvimento embrionário.

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High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Imagem tecido embrionário em tempo real, é um desafio durante longos períodos de tempo. Aqui nós apresentamos um ensaio para o monitoramento das alterações celulares e sub-celular na medula espinhal pinto por longos períodos com resolução espacial e temporal. Esta técnica pode ser adaptado para outras regiões do sistema nervoso e embrião em desenvolvimento.

De alta resolução de imagem ao vivo de comportamento de células no desenvolvimento neuroepitélio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

high-resolution-live-imaging-cell-behavior-developing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.2K visualizações.  University of Dundee, Dundee, UK. Imagem tecido embrionário em tempo real, é um desafio durante longos períodos de tempo. Aqui nós apresentamos um ensaio para o monitoramento das alterações celulares e sub-celular na medula espinhal pinto por longos períodos com resolução espacial e temporal. Esta técnica pode ser adaptado para outras regiões do sistema nervoso e embrião em desenvolvimento.

Vídeo: High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neurociência

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

De alta resolução funcionais Métodos ressonância magnética para Midbrain Humanos

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo imagens ao vivo de divisões celulares simples no mouse neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Alta resolução<em&gt; In Vivo</em&gt; Manual Protocolo Segmentação para hipocampo humano subcampos Utilizando Ressonância Magnética 3T

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Um Processo de Implantação de uma Câmara Spinal para Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Criação de Imagens do Cordão do rato Spinal

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Imagens ao vivo de nicotina Induzida Sinalização de Cálcio e Neurotransmitter lançamento Junto ventrais do hipocampo Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

De alta resolução de ressonância magnética estrutural do Subcórtex Humano<I&gt; In Vivo</I&gt; E Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

De alta resolução Quantificação do Comportamento Odor-guiada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Usando a<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

High-Resolution Análise Quantitativa immunogold de Receptores de Membrana na retina fita Sinapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...