A tomografia de raios-X suaves crioques pode fornecer informações quantitativas valiosas valiosas no nível celular que podem ser usadas como uma conjunção autônoma ou com outras técnicas de imagem. Imagem do sensor em um estado hidratado congelado que são necessários para coloração ou secção. Além disso, é uma técnica de alta produtividade, porque cada tomograma é coletado em apenas alguns minutos.
A crio-tomografia de raios-X macios oferece uma plataforma perfeita para acompanhar o processo de restauração celular em células infectadas ou defeituosas no nível de células únicas. Esta técnica pode relatar a eficácia de novos medicamentos antivirais ou terapia genética para reverter a infecção de fenótipos redigidos. Para carregar amostras no microscópio de raios-X de transmissão, esfrie a câmara de transferência com nitrogênio líquido até atingir menos de 100 Kelvin.
Encha a estação de trabalho com nitrogênio líquido adicional e ligue o aquecedor da borda da estação de trabalho. Quando a borda da estação de trabalho parar de ferver, coloque a caixa criogena contendo grades nos locais apropriados na estação de trabalho em condições crio-ocistas e carregue as grades nos suportes de amostras previamente resfriados. Carregue os suportes na nave auxiliar e proteja-os com as tampas.
Carregue a nave na câmara de transferência a menos de 100 Kelvin e bombeie a câmara até o vácuo. Conecte a câmara de transferência ao microscópio e siga o procedimento de vácuo na tela para carregar a nave auxiliar da câmara de transferência no microscópio. Uma vez que a nave está no microscópio com as amostras, use o braço robô microscópio para transferir um suporte de amostra para o estágio da amostra.
Para imagens de campo brilhante da grade com o microscópio de luz visível on-line, selecione a câmera do microscópio de luz visível e ligue a fonte LED do microscópio de luz visível para imagens de campo brilhante. Clique em Movimento, Controle, Amostra e de amostra para girar a amostra a menos 60 graus para que ela enfrente o objetivo do microscópio de luz visível, e selecione Controle de Movimento e Amostra e Amostra e amostra X e amostra Y para mover a amostra para as posições centradas esperadas. Selecione Microscópio, Aquisição, Configurações de Aquisição, Modos de Aquisição, Controle contínuo e inicial e clique em Controle de Movimento e Amostra para selecionar a amostra Z para refinar o foco com passos menores até cinco mícrons até que as células e/ou os furos da película de suporte de carbono estejam em foco.
Em seguida, selecione Microscópio, Aquisição, Configurações de Aquisição, Modos de Aquisição, Mosaico e Comece a iniciar a aquisição de um mapa de mosaico completo da grade no modo brightfield usando os valores padrão para o mosaico. Para imagens do mosaico do modo fluorescência, desligue a fonte LED do microscópio de luz visível para imagens de campo brilhante e selecione a fonte de luz LED correspondente ao comprimento de onda de excitação desejado e ao filtro óptico correspondente manualmente na configuração. Selecione Microscópio, Aquisição, Configurações de Aquisição, Modos de Aquisição, Contínuo e Iniciar e clique em Controle de Movimento e Amostra para selecionar a amostra Z para refinar o foco na imagem de fluorescência.
Em seguida, clique em Microscópio, Aquisição, Configurações de Aquisição, Modos de Aquisição, Mosaico e Start para adquirir um mapa de mosaico mantendo os parâmetros posicionais X e Y do mosaico brightfield. Em seguida, desligue a fonte de luz LED. Para aquisição de mosaico de raios-X, altere a fenda de saída para cinco mícrons e use uma exposição de um segundo no MISTRAL.
Selecione Microscópio, Aquisição, Configurações de Aquisição, Configurações da Câmera e Binning para ajustar o foco usando a tradução Z da amostra. Selecione Controle de movimento e Amostra para selecionar a amostra Z.A partir de etapas de cinco mícrons, refine o foco até passos de 0,5 mícrons até que a célula ou os orifícios de folha de carbono estejam bem em foco. Para adquirir um mapa de mosaico do quadrado de malha, clique em Microscópio, Aquisição, Configurações de Aquisição, Modo de Aquisição, Mosaico e Start.
Quando o mapa for adquirido, clique em Controle de Movimento e Amostra e altere a amostra X e prove Y para mover a amostra para uma posição de campo plano. Ajuste o tempo de exposição para um segundo no MISTRAL. Em seguida, normalize o mosaico adquirido pela imagem de campo plano para obter a transmissão e salvar o mosaico normalizado.
Para alinhar a amostra no eixo de rotação com a rotação em zero graus, selecione Controle de Movimento e Amostra e altere a amostra X, amostra Y e amostra Z para focar na característica da célula para colocar no eixo de rotação. Para girar a amostra para uma posição positiva, selecione Controle de Movimento e Amostra e altere a da amostra para positiva. Use a ferramenta de linha para desenhar uma linha sobre o recurso da célula para colocar no eixo de rotação.
Para girar a amostra para uma posição negativa, selecione Controle de Movimento e Amostra e altere a da amostra para negativa. Use a ferramenta de linha para desenhar uma linha sobre o recurso da célula para colocar no eixo de rotação. Enquanto estiver na posição positiva ou negativa, use a tradução Z da amostra para mover o recurso selecionado para a posição central entre ambas as linhas e repetir a rotação da amostra até que uma distância mínima linha-a-linha seja obtida.
Quando a da amostra for igual a zero, mova a amostra X duas vezes a distância necessária para colocar o recurso selecionado no centro do campo de visão e mova a placa de zona X para trazer o recurso de volta ao centro do campo de visão. Para reotimizar a posição da placa de zona Z em relação ao novo eixo de rotação, selecione Microscópio, Aquisição, Configurações de Aquisição, Modos de Aquisição e Série Focal e clique em Iniciar para gravar uma série focal de placa de zona Z. Em seguida, clique em Controle de Movimento e Placa de Zona e selecione a placa de zona Z para mover a placa de zona Z para a posição em que a amostra está em foco.
Para adquirir um tomograma, clique em Controle de Movimento e Amostra e selecione Sample theta para mover o ângulo máximo negativo para mais 0,1. Clique em Microscópio, Aquisição, Configurações de Aquisição, Modos de Aquisição e Tomografia para definir o número de imagens como o número total de ângulos, levando em conta a imagem no ângulo zero e na faixa angular, e definir o número de imagens. Selecione O ângulo start e o angle end, clique em Microscópio, Aquisição, Configurações de Aquisição, Configurações da câmera e defina o tempo de exposição.
Clique em Iniciar a aquisição da série de inclinação de tomografia. A amostra ideal deve ter células únicas no centro de uma malha quadrada embutida em uma fina camada de gelo e cercada por marcadores fiduciais de ouro bem dispersos. Muitas organelas diferentes, como mitocôndrias, réticula endoplasmática, vacuoles e núcleo devem ser capazes de ser distinguidas no tomograma reconstruído final, graças à reconstrução quantitativa dos coeficientes de absorção linear.
Nesta imagem, pode-se observar um quadrado com maior densidade celular. Neste exemplo, a mancha foi menos eficiente, levando a uma camada de gelo mais espessa com rachaduras. Embora algumas estruturas maiores possam ser reconhecidas nesta preparação, detalhes finos foram perdidos dentro do ruído e textura granulada devido à má qualidade de vitrificação do gelo espesso.
A amostra preservada por crio deve ser minimamente manuseada, pois a maioria dos artefatos são induzidos quando as amostras nesta fase. Normalmente, fotomicroscopia de luz crio-visível correlativa, você usa uma tomografia anterior ao substrato criostrato. Além disso, a microscopia espectral pode ser feita em elementos químicos relevantes.
Este protocolo preenche um nicho operando em um regime de espécime e resolução, que não são facilmente acessíveis por qualquer outra técnica de imagem direta, permitindo poucos mícrons e resolução de meio-campo de 30 nanômetros.
