Este trabalho foi financiado por um Investigator Award Burroughs Wellcome para YM e por uma bolsa de pós-doutorado Brown-Coxe da Universidade de Yale para MD.

Materiais: <ul><li> Amostra de proteína - lisozima (50 mg / mL) </li><li> Hanging bandeja queda de 24 bem- </li><li> Sentando queda de 24 bem-bandeja </li><li> Microbatch cristalização 96 bandeja bem </li><li> Soluções de cristalização (tanto comerciais disponíveis ou home made) </li><li> Graxa de silicone </li><li> Seringa de 5 mL sem Luer-lock </li><li> Siliconizado slides cobrir </li><li> Fita de vedação óptica </li><li> Parafina </li><li> 0,1-2 mL micropipeta com retenção de baixa dicas </li><li> Pinça </li><li> Wipes profissional </li></ul> 1. Hanging / sentado Procedimento Drop: <ol><li> Para uma tela inicial pode-se usar telas disponíveis comercialmente que exploram a matriz esparsa método fatorial incompleta de condições de julgamento. A matriz esparsa método fatorial incompleta é enviesada por e selecionados a partir de condições de cristalização conhecido por macromoléculas (Carter e Carter, 1979; Cudney et al, 1994;. Jancarik e Kim, 1991;. Jancarik et al, 1991). Se a condição de cristalização já é conhecido, uma tela estreita pode ser montada, variando a concentração precipitante e pH em torno do hit original. O precipitante mais bem sucedido é polietileno glicol (PEG), seguido pelo sulfato de amônio. Juntas, essas duas conta precipitantes por cerca de 60% ​​de todos os precipitantes macromolecular registrados usados ​​para a cristalização (Gilliland et al, 1994;. Kimber et al, 2003;.. Page et al, 2003). </li><li> Prepare as suas soluções de cristalização. Normalmente, estas condições são combinadas a partir de um agente de precipitação, o sal de algum tipo e um tampão para ajustar o pH. Em alguns casos, os aditivos podem ser adicionados especificamente para a proteína de interesse. Todos solução de reserva deve ser filtrada através de filtro 0,22 mM. Alguns da solução-mãe pode ser muito viscoso (50 PEGs%, glicerol, PEG-MME, etc). <ul><li> Prepare 1,5 mL de 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6 M NaCl 0,1 M em cada NaOAc pH 4.0, 4.3, 4.6 e 4.9 (total de 24 soluções) </li></ul></li><li> Descongele a sua amostra de proteína e manter em gelo. Estoques de proteína deve ser armazenado a -80 ° C a menos que a proteína de interesse é sensível ao congelamento / degelo (se assim, armazenar a 4 ° C). Concentrações de proteínas típicos estão na faixa de 50-50 mg / mL, com maiores concentrações geralmente dando os melhores resultados. </li><li> Rotação da amostra 15min/18, 000xg / 4 ° C - algumas proteínas tendem a agregar e precipitar parcialmente depois de uma etapa descongelar. Estes agregados podem promover a precipitação amorfa do resto das moléculas de proteína, portanto, girar completa para baixo vai garantir que você tenha apenas moléculas solúveis na sua amostra. Guardar a proteína no gelo até a criação de bandeja. </li><li> Determinar a concentração de proteína a partir de sua absorbância a 280 nm usando um espectrofotômetro UV. A concentração de proteína pode ser calculado a partir da leitura de absorbância e coeficiente da proteína extinção. O coeficiente de extinção podem ser calculados com a ferramenta ProtParam no site ExPASy: <a href="http://ca.expasy.org/tools/protparam.html">http://ca.expasy.org/tools/protparam.html</a> </li><li> Preencha poços do enforcamento de 24 poços / sentado bandeja cair com 500 mL de solução precipitante de acordo com o esquema de configuração da bandeja (Figura 2B). Criar um anel de graxa de silicone em torno da borda do poço. O anel deve ter um pequeno espaço para evitar o acúmulo de pressão de ar como o bem está selado. Em gotas sentado, não há necessidade de graxa já que o bem é selada com fita adesiva (Figura 2A). </li><li> Tome um slide tampa e limpe-a com spray de ar condensado, ou um profissional wipe - evitando a poeira vai facilitar a interpretação da queda de cristalização e eliminar contaminações. Para sentar-gotas, cobertura deslizante não são usados. Em vez disso, o poço contém uma prateleira em que a proteína e precipitante são misturados. </li><li> Coloque volumes iguais da amostra de proteínas e solução de reservatório no slide tampa. Volumes diferentes de proteínas e precipitante pode ser julgado como parte do processo de otimização. Usando mais proteína do que resultados precipitante em uma concentração líquida da proteína na queda após atingir o equilíbrio, que pode ser desejável para diluir amostras de proteínas, e para retardar a nucleação de cristal ou de crescimento. Qualquer outra substância não-volátil na solução de queda também será concentrado pelo mesmo fator. Quando a proteína de pipetagem e soluções reservatório para o slide tampa, ser extremamente cuidadoso para evitar a formação de bolhas. Isso geralmente ocorre quando o ar é soprado para fora da pipeta. <ul><li> Hanging drop: 2 mL de carga de 50 mg / mL de lisozima em pH 0,02 NaOAc M 4,9 para o centro do slide tampa e adicionar-lhe 2 mL da solução do reservatório. </li><li> Sentando queda: Load 2 mL de solução de lisozima 50 mg / mL para o centro da plataforma e adicionar-lhe 2 mL da solução do reservatório. </li></ul></li><li> Virar a cobertura deslizante suave e colocá-lo sobre o anel de graxa na parte superior do poço. Pressione suavemente para que o ar pode escapar do poço através do entalhe na graxa para prevento acúmulo de pressão de ar no poço e manter o bem fechados. Air acúmulo de pressão no poço pode aumentar a cobertura deslizante, comprometendo o selo também. No método de queda sentado, opticamente clara fita transparente é usada para cobrir os poços. Assim, neste método de selagem terá lugar cada linha / coluna. </li><li> Passar para a próxima bem até bandeja está completa. </li><li> Verifique a bandeja na configuração - eliminando as partículas de poeira e outras contaminações pode reduzir a identificação de falsos positivos de cristais de proteínas. </li><li> Use uma folha de pontuação para documentar a sua experiência. </li><li> Coloque a bandeja na temperatura de incubação desejado, geralmente entre 4 C de temperatura e sala °. 20 ° C é mais comumente sucesso. Tome cuidado para lidar com a bandeja com cuidado e evitar qualquer agitação. Ter cuidado ao abrir e fechar a porta da incubadora. Vibrações ou mudanças de temperatura durante a transferência ou a incubação pode impedir o crescimento de cristal ou afetar negativamente a qualidade de cristal. A absorção de choque material (espuma de embalagem, por exemplo) pode ser usado como estofamento sob os tabuleiros de cristal. </li><li> Verifique a bandeja de cristais no dia seguinte, e depois todos os dias, sempre manuseio das bandejas com cuidado. Documento as conclusões e as morfologias queda de uma folha de pontuação bandeja específica. Cristais geralmente levam 2-5 dias para aparecer, embora ocasionalmente aparecem cristais muito mais cedo (quase imediatamente) ou posterior (até vários meses!). Uma vez que as condições de cristalização foram identificados ea taxa de crescimento dos cristais é conhecida, o melhor é deixar as bandejas repousar até cristais apareceram e cresceu para pelo menos metade do seu tamanho final. Deixando intacta as bandejas pode reduzir o número de eventos de nucleação de cristal, portanto, produzindo um número menor de cristais maiores. </li></ol> 2. Microbatch procedimento: <ol><li> Amostra de proteínas e preparação precipitantes são como descrito acima. </li><li> Pistola uma bandeja microbatch novo para evitar poeira e outras partículas grandes. </li><li> Na bandeja microbatch, abastecimento de óleo de parafina até 3 mm de altura (apenas o suficiente para cobrir os poços). Remover o acesso de petróleo. </li><li> Carga 1 mL de solução de proteína (50 mg / mL de lisozima) no óleo pré-cheia bem - certifique-se de pipeta a solução diretamente para o fundo do poço (Figura 2A). </li><li> Carga 1 mL de solução precipitante no acordo bem ao esquema de configuração da bandeja (Figura 2B) - certifique-se a queda se deposita no fundo do poço e se funde com a gota de proteína. </li><li> Mover-se para o bem próximos até bandeja está completa. </li><li> Siga os passos 11-14 do enforcamento / sentado procedimento queda. </li></ol> 3. Resultados representativos: A cristalização é normalmente referido como o gargalo da cristalografia de raios X. A matriz esparsa tela incompleta fatorial de condições precipitantes normalmente produz muitos tipos diferentes de agregação de proteínas e precipitação, entre eles grandes monocristais. Se a proteína ou concentrações precipitante são demasiado elevados pode-se ver a matéria marrom com nenhuma forma e tamanho distintos (precipitação amorfa). Quando a solução é undersaturated, a queda será muitas vezes completamente clara e desprovida de qualquer tipo de precipitação. A Figura 3 mostra vários exemplos de fenômenos de precipitação e cristais (Dessau et al., 2006). Fenômenos mais precipitação com mais interpretação detalhada pode ser encontrada em <a href="http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html">http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html</a> . <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. O princípio da cristalização de proteínas. O princípio da cristalização de proteínas. Em um experimento de difusão de vapor (A) volumes iguais de precipitantes e de proteínas estão presentes no drop. Água difundem para fora e ambos precipitante ea concentração de proteína será duplicada até que o equilíbrio é alcançado entre a queda ea solução do reservatório. Em cristalização lote (B) o precipitante ea concentração de proteínas não se alteram durante o experimento. Ponto A - Proteína permanece undersaturated sem cristais podem ser formados, B Point - nucleação de proteínas ocorre, os cristais começaram a se formar ea concentração de proteína em solução cai para a saturação. C Point - Proteína precipitados, mas ainda podem crescer os cristais. (C) cristalização Diálise usando um gel-conectado capilar. Cristais aparecem como o sal se difunde para fora da amostra de proteínas (e / ou difunde precipitante de proteína na amostra) através da ficha gel. <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Esboço de experimentos de cristalização de proteínas típicas. (A) Procedimentos para pendurar difusão queda vapor, sentado difusão queda de vapor, e cristalização de proteínas microbatch. Em cada caso, um pequeno volume de amostra de proteína concentrado é misturado com um volume igual ou menor de precipitant solução e permitiu equilibrar. (B) Para a cristalização de frango lisozima, uma bandeja de 24 poços é configurado com diferentes concentrações de cloreto de sódio (o precipitante) e com 0,1 M de acetato de sódio como tampão com pHs diferentes (4,0-4,9). <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Resultados típicos de um experimento de cristalização de proteínas. (A) precipitação amorfo. Quando a proteína ou precipitante (ou ambos) estão em alta concentração. (B) a separação de fase. Proteína ou detergente pode separar a uma fase diferente, quando misturado com certos precipitantes em alta concentração. (C) cristais de proteínas em forma de Rod AtCSN7 obtidos em polietileno glicol 8000 e acetato de magnésio (Dessau et al., 2006). (D) Os cristais de lisozima obtidos em 1,0 M NaCl e acetato de sódio pH 4,9. (E) De acordo com gotas saturadas geralmente permanecem claros. Fotografia por Moshe Dessau.

<ol>
	<li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , (1999).</li><li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+using+incomplete+factorial+experiments.">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li><li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth.">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li><li>Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification+and+crystallization+of+a+PCI+domain+from+the+COP9+signalosome+subunit+7+(CSN7).">Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7).</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).</li><li>Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Macromolecule+Crystallization+Database,+Version+3.0:+new+features,+data+and+the+NASA+archive+for+protein+crystal+growth+data.">Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).</li><li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+matrix+sampling:+a+screening+method+for+crystallization+of+proteins.">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).</li><li>Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+study+of+the+ligand-binding+domain+of+the+bacterial+chemotaxis-mediating+aspartate+receptor+of+Salmonella+typhimurium.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium.</a> J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).</li><li>Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+mining+crystallization+databases:+knowledge-based+approaches+to+optimize+protein+crystal+screens.">Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens.</a> Proteins. 51, 562-568 (2003).</li><li>Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+growth+of+proteins,+nucleic+acids,+and+viruses+in+gels.">Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels.</a> Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Crystallization of biological macromolecules. , (1999).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li><li>Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+crystallization+strategy+for+structural+genomics:+an+optimized+two-tiered+crystallization+screen+against+the+Thermotoga+maritima+proteome.">Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste artigo vamos descrever e demonstrar geral protocolos atuais para a cristalização de proteínas. Uma vez que um procedimento multi-passo, há algumas considerações a pessoa precisa estar ciente. Ao trabalhar com volumes muito pequenos (0,5-2 mL), secagem da gota devido à evaporação é uma grande preocupação. Assim, recomenda-se a trabalhar em um ambiente bem controlado (com baixo fluxo de ar, alta umidade e controle de temperatura apertado) e adotar uma técnica que minimiza a exposição da queda para o a...

<table border="1">
		<tbody>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Lysozyme</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>L6876-1G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well VDX Plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-142</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well Cryschem Plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-158</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dow Corning Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-510</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Siliconized glass circle coverslides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-231</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>100% paraffin oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-411</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-511</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-098</td>
<td>&nbsp;</td>	</tr>	</tbody>
		</table>

protein crystallization for x-ray crystallography

Usando a estrutura tridimensional de macromoléculas biológicas para inferir como eles funcionam é uma das áreas mais importantes da biologia moderna. A disponibilidade de estruturas de resolução atômica fornece uma compreensão profunda e única da função da proteína, e ajuda a desvendar o funcionamento interno da célula viva. Até o momento, 86% do Protein Data Bank (PDB-RCSB) as entradas são estruturas macromoleculares que foram determinados através de cristalografia de raios X. Para obter cristais adequados para estudos cristalográficos, a macromolécula (proteína, por exemplo, ácidos nucléicos, proteína-proteína-proteína complexa ou complexo de ácido nucléico) deve ser purificada à homogeneidade, ou o mais próximo possível à homogeneidade. A homogeneidade da preparação é um fator chave na obtenção de cristais que difratar de alta resolução (Bergfors, 1999; McPherson, 1999). Cristalização requer trazendo a macromolécula de supersaturação. A amostra deve ser concentrado para a concentração mais alta possível, sem causar agregação ou precipitação da macromolécula (geralmente 20-50 mg / mL). Introduzir a amostra para agente de precipitação pode promover a nucleação de cristais de proteínas na solução, que pode resultar em grandes tridimensional crescimento de cristais da solução. Existem duas técnicas principais para obter cristais: vapor de difusão e cristalização lote. Na difusão de vapor, uma gota contendo uma mistura de soluções precipitantes e de proteínas é selada em uma câmara com precipitante puro. O vapor de água, em seguida, difunde para fora da gota até a osmolaridade da queda e do precipitante são iguais (Figura 1A). A desidratação da gota provoca uma concentração de ambas as proteínas lenta e precipitante até que o equilíbrio é alcançado, de preferência na zona de nucleação de cristal do diagrama de fases. O método se baseia em lote trazendo a proteína diretamente para a zona de nucleação pela proteína mistura com a quantidade adequada de precipitante (Figura 1B). Este método é geralmente realizado sob uma parafina / mistura de óleo mineral para evitar a difusão de água para fora da gota. Aqui vamos demonstrar dois tipos de configuração experimental para difusão de vapor, pendurado cair e cair sentado, além de cristalização lote sob óleo.

Crystallization is usually referred to as the bottleneck of X-ray crystallography. A sparse matrix incomplete factorial screen of precipitating conditions typically produces many different types of protein aggregation and precipitation, among them large single crystals. If the protein or precipitant concentrations are too high one can see brown matter with no distinct shape and size (amorphous precipitation). When the solution is undersaturated, the drop will often be completely clear and devoid of any kind of precipitat...

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Protein Crystallization for X-ray Crystallography

A estrutura 3-D de uma molécula fornece um entendimento único de como as funções molécula. O principal método para determinação da estrutura de quase-atômica resolução é cristalografia de raios X. Aqui, demonstramos os métodos atuais de obtenção de cristais tridimensionais de qualquer macromolécula, uma vez que são adequados para determinação de estrutura por cristalografia de raios X.

Cristalização de proteínas para cristalografia de raios X

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

protein-crystallization-for-x-ray-crystallography

Research

JoVE Journal

Biology

63.0K visualizações.  Yale University. A estrutura 3-D de uma molécula fornece um entendimento único de como as funções molécula. O principal método para determinação da estrutura de quase-atômica resolução é cristalografia de raios X. Aqui, demonstramos os métodos atuais de obtenção de cristais tridimensionais de qualquer macromolécula, uma vez que são adequados para determinação de estrutura por cristalografia de raios X.

Vídeo: Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard cuticle which makes it difficult to use protocols of classical histology. In addition, histological sectioning destroys the sample and can therefore not be used for unique material. Hence, a non-destructive method is desirable which allows to view inside small samples without the need of sectioning.
We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (France) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows us to reconstruct the internal organization in its natural state without the artefacts produced by histological sectioning. These date can be used for quantitative morphology, landmarks, or for the visualization of animated movies to understand the structure of hidden body parts and to follow complete organ systems or tissues through the samples.

We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows the reconstruction of internal structures in their natural state without the artefacts produced by histological sectioning.

Não-invasivo 3D Visualization com Sub-micron Resolução Usando Síncrotron-X-ray-tomografia

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Biologia

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

Avaliar Trials bidimensional cristalização de proteínas da membrana Pequenas de Estudos Biologia Estrutural por Cristalografia Electron

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

De alto rendimento cristalização de proteínas de membrana Usando o método Bicelle lipídico

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

3D Printing of Preclinical X-ray Computed Tomographic Data Sets

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing. Traditional, mold-injection methods to create models or parts have several limitations, the most important of which is a difficulty in making highly complex products in a timely, cost-effective manner.1 However, gradual improvements in three-dimensional printing technology have resulted in both high-end and economy instruments that are now available for the facile production of customized models.2 These printers have the ability to extrude high-resolution objects with enough detail to accurately represent in vivo images generated from a preclinical X-ray CT scanner. With proper data collection, surface rendering, and stereolithographic editing, it is now possible and inexpensive to rapidly produce detailed skeletal and soft tissue structures from X-ray CT data. Even in the early stages of development, the anatomical models produced by three-dimensional printing appeal to both educators and researchers who can utilize the technology to improve visualization proficiency. 3, 4 The real benefits of this method result from the tangible experience a researcher can have with data that cannot be adequately conveyed through a computer screen. The translation of pre-clinical 3D data to a physical object that is an exact copy of the test subject is a powerful tool for visualization and communication, especially for relating imaging research to students, or those in other fields. Here, we provide a detailed method for printing plastic models of bone and organ structures derived from X-ray CT scans utilizing an Albira X-ray CT system in conjunction with PMOD, ImageJ, Meshlab, Netfabb, and ReplicatorG software packages.

Using modern plastic extrusion and printing technologies, it is now possible to quickly and inexpensively produce physical models of X-ray CT data taken in a laboratory. The three -dimensional printing of tomographic data is a powerful visualization, research, and educational tool that may now be accessed by the preclinical imaging community.

Impressão 3D de pré-clínica de raios-X tomografia computadorizada de Conjuntos de Dados

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing.  Traditional, ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

Melhorar a taxa de sucesso de cristalização de proteínas pela Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

Expressão Mammalian Cell eficiente e de uma etapa de purificação extracelular glicoproteínas para a cristalização

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...