Este trabalho foi financiado por um Investigator Award Burroughs Wellcome para YM e por uma bolsa de pós-doutorado Brown-Coxe da Universidade de Yale para MD.

Materiais: <ul><li> Amostra de proteína - lisozima (50 mg / mL) </li><li> Hanging bandeja queda de 24 bem- </li><li> Sentando queda de 24 bem-bandeja </li><li> Microbatch cristalização 96 bandeja bem </li><li> Soluções de cristalização (tanto comerciais disponíveis ou home made) </li><li> Graxa de silicone </li><li> Seringa de 5 mL sem Luer-lock </li><li> Siliconizado slides cobrir </li><li> Fita de vedação óptica </li><li> Parafina </li><li> 0,1-2 mL micropipeta com retenção de baixa dicas </li><li> Pinça </li><li> Wipes profissional </li></ul> 1. Hanging / sentado Procedimento Drop: <ol><li> Para uma tela inicial pode-se usar telas disponíveis comercialmente que exploram a matriz esparsa método fatorial incompleta de condições de julgamento. A matriz esparsa método fatorial incompleta é enviesada por e selecionados a partir de condições de cristalização conhecido por macromoléculas (Carter e Carter, 1979; Cudney et al, 1994;. Jancarik e Kim, 1991;. Jancarik et al, 1991). Se a condição de cristalização já é conhecido, uma tela estreita pode ser montada, variando a concentração precipitante e pH em torno do hit original. O precipitante mais bem sucedido é polietileno glicol (PEG), seguido pelo sulfato de amônio. Juntas, essas duas conta precipitantes por cerca de 60% ​​de todos os precipitantes macromolecular registrados usados ​​para a cristalização (Gilliland et al, 1994;. Kimber et al, 2003;.. Page et al, 2003). </li><li> Prepare as suas soluções de cristalização. Normalmente, estas condições são combinadas a partir de um agente de precipitação, o sal de algum tipo e um tampão para ajustar o pH. Em alguns casos, os aditivos podem ser adicionados especificamente para a proteína de interesse. Todos solução de reserva deve ser filtrada através de filtro 0,22 mM. Alguns da solução-mãe pode ser muito viscoso (50 PEGs%, glicerol, PEG-MME, etc). <ul><li> Prepare 1,5 mL de 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6 M NaCl 0,1 M em cada NaOAc pH 4.0, 4.3, 4.6 e 4.9 (total de 24 soluções) </li></ul></li><li> Descongele a sua amostra de proteína e manter em gelo. Estoques de proteína deve ser armazenado a -80 ° C a menos que a proteína de interesse é sensível ao congelamento / degelo (se assim, armazenar a 4 ° C). Concentrações de proteínas típicos estão na faixa de 50-50 mg / mL, com maiores concentrações geralmente dando os melhores resultados. </li><li> Rotação da amostra 15min/18, 000xg / 4 ° C - algumas proteínas tendem a agregar e precipitar parcialmente depois de uma etapa descongelar. Estes agregados podem promover a precipitação amorfa do resto das moléculas de proteína, portanto, girar completa para baixo vai garantir que você tenha apenas moléculas solúveis na sua amostra. Guardar a proteína no gelo até a criação de bandeja. </li><li> Determinar a concentração de proteína a partir de sua absorbância a 280 nm usando um espectrofotômetro UV. A concentração de proteína pode ser calculado a partir da leitura de absorbância e coeficiente da proteína extinção. O coeficiente de extinção podem ser calculados com a ferramenta ProtParam no site ExPASy: <a href="http://ca.expasy.org/tools/protparam.html">http://ca.expasy.org/tools/protparam.html</a> </li><li> Preencha poços do enforcamento de 24 poços / sentado bandeja cair com 500 mL de solução precipitante de acordo com o esquema de configuração da bandeja (Figura 2B). Criar um anel de graxa de silicone em torno da borda do poço. O anel deve ter um pequeno espaço para evitar o acúmulo de pressão de ar como o bem está selado. Em gotas sentado, não há necessidade de graxa já que o bem é selada com fita adesiva (Figura 2A). </li><li> Tome um slide tampa e limpe-a com spray de ar condensado, ou um profissional wipe - evitando a poeira vai facilitar a interpretação da queda de cristalização e eliminar contaminações. Para sentar-gotas, cobertura deslizante não são usados. Em vez disso, o poço contém uma prateleira em que a proteína e precipitante são misturados. </li><li> Coloque volumes iguais da amostra de proteínas e solução de reservatório no slide tampa. Volumes diferentes de proteínas e precipitante pode ser julgado como parte do processo de otimização. Usando mais proteína do que resultados precipitante em uma concentração líquida da proteína na queda após atingir o equilíbrio, que pode ser desejável para diluir amostras de proteínas, e para retardar a nucleação de cristal ou de crescimento. Qualquer outra substância não-volátil na solução de queda também será concentrado pelo mesmo fator. Quando a proteína de pipetagem e soluções reservatório para o slide tampa, ser extremamente cuidadoso para evitar a formação de bolhas. Isso geralmente ocorre quando o ar é soprado para fora da pipeta. <ul><li> Hanging drop: 2 mL de carga de 50 mg / mL de lisozima em pH 0,02 NaOAc M 4,9 para o centro do slide tampa e adicionar-lhe 2 mL da solução do reservatório. </li><li> Sentando queda: Load 2 mL de solução de lisozima 50 mg / mL para o centro da plataforma e adicionar-lhe 2 mL da solução do reservatório. </li></ul></li><li> Virar a cobertura deslizante suave e colocá-lo sobre o anel de graxa na parte superior do poço. Pressione suavemente para que o ar pode escapar do poço através do entalhe na graxa para prevento acúmulo de pressão de ar no poço e manter o bem fechados. Air acúmulo de pressão no poço pode aumentar a cobertura deslizante, comprometendo o selo também. No método de queda sentado, opticamente clara fita transparente é usada para cobrir os poços. Assim, neste método de selagem terá lugar cada linha / coluna. </li><li> Passar para a próxima bem até bandeja está completa. </li><li> Verifique a bandeja na configuração - eliminando as partículas de poeira e outras contaminações pode reduzir a identificação de falsos positivos de cristais de proteínas. </li><li> Use uma folha de pontuação para documentar a sua experiência. </li><li> Coloque a bandeja na temperatura de incubação desejado, geralmente entre 4 C de temperatura e sala °. 20 ° C é mais comumente sucesso. Tome cuidado para lidar com a bandeja com cuidado e evitar qualquer agitação. Ter cuidado ao abrir e fechar a porta da incubadora. Vibrações ou mudanças de temperatura durante a transferência ou a incubação pode impedir o crescimento de cristal ou afetar negativamente a qualidade de cristal. A absorção de choque material (espuma de embalagem, por exemplo) pode ser usado como estofamento sob os tabuleiros de cristal. </li><li> Verifique a bandeja de cristais no dia seguinte, e depois todos os dias, sempre manuseio das bandejas com cuidado. Documento as conclusões e as morfologias queda de uma folha de pontuação bandeja específica. Cristais geralmente levam 2-5 dias para aparecer, embora ocasionalmente aparecem cristais muito mais cedo (quase imediatamente) ou posterior (até vários meses!). Uma vez que as condições de cristalização foram identificados ea taxa de crescimento dos cristais é conhecida, o melhor é deixar as bandejas repousar até cristais apareceram e cresceu para pelo menos metade do seu tamanho final. Deixando intacta as bandejas pode reduzir o número de eventos de nucleação de cristal, portanto, produzindo um número menor de cristais maiores. </li></ol> 2. Microbatch procedimento: <ol><li> Amostra de proteínas e preparação precipitantes são como descrito acima. </li><li> Pistola uma bandeja microbatch novo para evitar poeira e outras partículas grandes. </li><li> Na bandeja microbatch, abastecimento de óleo de parafina até 3 mm de altura (apenas o suficiente para cobrir os poços). Remover o acesso de petróleo. </li><li> Carga 1 mL de solução de proteína (50 mg / mL de lisozima) no óleo pré-cheia bem - certifique-se de pipeta a solução diretamente para o fundo do poço (Figura 2A). </li><li> Carga 1 mL de solução precipitante no acordo bem ao esquema de configuração da bandeja (Figura 2B) - certifique-se a queda se deposita no fundo do poço e se funde com a gota de proteína. </li><li> Mover-se para o bem próximos até bandeja está completa. </li><li> Siga os passos 11-14 do enforcamento / sentado procedimento queda. </li></ol> 3. Resultados representativos: A cristalização é normalmente referido como o gargalo da cristalografia de raios X. A matriz esparsa tela incompleta fatorial de condições precipitantes normalmente produz muitos tipos diferentes de agregação de proteínas e precipitação, entre eles grandes monocristais. Se a proteína ou concentrações precipitante são demasiado elevados pode-se ver a matéria marrom com nenhuma forma e tamanho distintos (precipitação amorfa). Quando a solução é undersaturated, a queda será muitas vezes completamente clara e desprovida de qualquer tipo de precipitação. A Figura 3 mostra vários exemplos de fenômenos de precipitação e cristais (Dessau et al., 2006). Fenômenos mais precipitação com mais interpretação detalhada pode ser encontrada em <a href="http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html">http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html</a> . <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. O princípio da cristalização de proteínas. O princípio da cristalização de proteínas. Em um experimento de difusão de vapor (A) volumes iguais de precipitantes e de proteínas estão presentes no drop. Água difundem para fora e ambos precipitante ea concentração de proteína será duplicada até que o equilíbrio é alcançado entre a queda ea solução do reservatório. Em cristalização lote (B) o precipitante ea concentração de proteínas não se alteram durante o experimento. Ponto A - Proteína permanece undersaturated sem cristais podem ser formados, B Point - nucleação de proteínas ocorre, os cristais começaram a se formar ea concentração de proteína em solução cai para a saturação. C Point - Proteína precipitados, mas ainda podem crescer os cristais. (C) cristalização Diálise usando um gel-conectado capilar. Cristais aparecem como o sal se difunde para fora da amostra de proteínas (e / ou difunde precipitante de proteína na amostra) através da ficha gel. <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Esboço de experimentos de cristalização de proteínas típicas. (A) Procedimentos para pendurar difusão queda vapor, sentado difusão queda de vapor, e cristalização de proteínas microbatch. Em cada caso, um pequeno volume de amostra de proteína concentrado é misturado com um volume igual ou menor de precipitant solução e permitiu equilibrar. (B) Para a cristalização de frango lisozima, uma bandeja de 24 poços é configurado com diferentes concentrações de cloreto de sódio (o precipitante) e com 0,1 M de acetato de sódio como tampão com pHs diferentes (4,0-4,9). <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Resultados típicos de um experimento de cristalização de proteínas. (A) precipitação amorfo. Quando a proteína ou precipitante (ou ambos) estão em alta concentração. (B) a separação de fase. Proteína ou detergente pode separar a uma fase diferente, quando misturado com certos precipitantes em alta concentração. (C) cristais de proteínas em forma de Rod AtCSN7 obtidos em polietileno glicol 8000 e acetato de magnésio (Dessau et al., 2006). (D) Os cristais de lisozima obtidos em 1,0 M NaCl e acetato de sódio pH 4,9. (E) De acordo com gotas saturadas geralmente permanecem claros. Fotografia por Moshe Dessau.

<ol>
	<li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , (1999).</li><li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+using+incomplete+factorial+experiments.">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li><li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth.">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li><li>Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification+and+crystallization+of+a+PCI+domain+from+the+COP9+signalosome+subunit+7+(CSN7).">Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7).</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).</li><li>Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Macromolecule+Crystallization+Database,+Version+3.0:+new+features,+data+and+the+NASA+archive+for+protein+crystal+growth+data.">Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).</li><li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+matrix+sampling:+a+screening+method+for+crystallization+of+proteins.">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).</li><li>Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+study+of+the+ligand-binding+domain+of+the+bacterial+chemotaxis-mediating+aspartate+receptor+of+Salmonella+typhimurium.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium.</a> J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).</li><li>Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+mining+crystallization+databases:+knowledge-based+approaches+to+optimize+protein+crystal+screens.">Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens.</a> Proteins. 51, 562-568 (2003).</li><li>Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+growth+of+proteins,+nucleic+acids,+and+viruses+in+gels.">Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels.</a> Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Crystallization of biological macromolecules. , (1999).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li><li>Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+crystallization+strategy+for+structural+genomics:+an+optimized+two-tiered+crystallization+screen+against+the+Thermotoga+maritima+proteome.">Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste artigo vamos descrever e demonstrar geral protocolos atuais para a cristalização de proteínas. Uma vez que um procedimento multi-passo, há algumas considerações a pessoa precisa estar ciente. Ao trabalhar com volumes muito pequenos (0,5-2 mL), secagem da gota devido à evaporação é uma grande preocupação. Assim, recomenda-se a trabalhar em um ambiente bem controlado (com baixo fluxo de ar, alta umidade e controle de temperatura apertado) e adotar uma técnica que minimiza a exposição da queda para o a...

<table><tbody><tr><td>Lysozyme</td><td></td><td>Sigma-aldrich</td><td>L6876-1G</td></tr><tr><td>24 well VDX Plate</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-142</td></tr><tr><td>24 well Cryschem Plate</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-158</td></tr><tr><td>Dow Corning Vacuum Grease</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-510</td></tr><tr><td>Siliconized glass circle coverslides</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-231</td></tr><tr><td>100% paraffin oil</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-411</td></tr><tr><td>1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-511</td></tr><tr><td>96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate)</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-098</td></tr></tbody></table>

protein crystallization for x-ray crystallography

Usando a estrutura tridimensional de macromoléculas biológicas para inferir como eles funcionam é uma das áreas mais importantes da biologia moderna. A disponibilidade de estruturas de resolução atômica fornece uma compreensão profunda e única da função da proteína, e ajuda a desvendar o funcionamento interno da célula viva. Até o momento, 86% do Protein Data Bank (PDB-RCSB) as entradas são estruturas macromoleculares que foram determinados através de cristalografia de raios X. Para obter cristais adequados para estudos cristalográficos, a macromolécula (proteína, por exemplo, ácidos nucléicos, proteína-proteína-proteína complexa ou complexo de ácido nucléico) deve ser purificada à homogeneidade, ou o mais próximo possível à homogeneidade. A homogeneidade da preparação é um fator chave na obtenção de cristais que difratar de alta resolução (Bergfors, 1999; McPherson, 1999). Cristalização requer trazendo a macromolécula de supersaturação. A amostra deve ser concentrado para a concentração mais alta possível, sem causar agregação ou precipitação da macromolécula (geralmente 20-50 mg / mL). Introduzir a amostra para agente de precipitação pode promover a nucleação de cristais de proteínas na solução, que pode resultar em grandes tridimensional crescimento de cristais da solução. Existem duas técnicas principais para obter cristais: vapor de difusão e cristalização lote. Na difusão de vapor, uma gota contendo uma mistura de soluções precipitantes e de proteínas é selada em uma câmara com precipitante puro. O vapor de água, em seguida, difunde para fora da gota até a osmolaridade da queda e do precipitante são iguais (Figura 1A). A desidratação da gota provoca uma concentração de ambas as proteínas lenta e precipitante até que o equilíbrio é alcançado, de preferência na zona de nucleação de cristal do diagrama de fases. O método se baseia em lote trazendo a proteína diretamente para a zona de nucleação pela proteína mistura com a quantidade adequada de precipitante (Figura 1B). Este método é geralmente realizado sob uma parafina / mistura de óleo mineral para evitar a difusão de água para fora da gota. Aqui vamos demonstrar dois tipos de configuração experimental para difusão de vapor, pendurado cair e cair sentado, além de cristalização lote sob óleo.

Crystallization is usually referred to as the bottleneck of X-ray crystallography. A sparse matrix incomplete factorial screen of precipitating conditions typically produces many different types of protein aggregation and precipitation, among them large single crystals. If the protein or precipitant concentrations are too high one can see brown matter with no distinct shape and size (amorphous precipitation). When the solution is undersaturated, the drop will often be completely clear and devoid of any kind of precipitat...

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Protein Crystallization for X-ray Crystallography

A estrutura 3-D de uma molécula fornece um entendimento único de como as funções molécula. O principal método para determinação da estrutura de quase-atômica resolução é cristalografia de raios X. Aqui, demonstramos os métodos atuais de obtenção de cristais tridimensionais de qualquer macromolécula, uma vez que são adequados para determinação de estrutura por cristalografia de raios X.

Cristalização de proteínas para cristalografia de raios X

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

protein-crystallization-for-x-ray-crystallography

Research

JoVE Journal

Biology

63.3K visualizações.  Yale University. A estrutura 3-D de uma molécula fornece um entendimento único de como as funções molécula. O principal método para determinação da estrutura de quase-atômica resolução é cristalografia de raios X. Aqui, demonstramos os métodos atuais de obtenção de cristais tridimensionais de qualquer macromolécula, uma vez que são adequados para determinação de estrutura por cristalografia de raios X.

Vídeo: Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize proteins, DNAs, RNAs, and their complexes can however not be predicted. Employing a broad variety of conditions is a way to increase the yield of quality diffraction crystals. Two fully automated systems have been developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology (Cambridge, England, MRC-LMB) that facilitate crystallization screening against 1,920 initial conditions by vapor diffusion in nanoliter droplets. Semi-automated protocols have also been developed to optimize conditions by changing the concentrations of reagents, the pH, or by introducing additives that potentially enhance properties of the resulting crystals. All the corresponding protocols will be described in detail and briefly discussed. Taken together, they enable convenient and highly efficient macromolecular crystallization in a multi-user facility, while giving the users control over key parameters of their experiments.

Automated systems and protocols for the routine preparation of a large number of screens and nanoliter crystallization droplets for vapor diffusion experiments are described and discussed.

Automated protocolos para cristalização Macromolecular no laboratório de Biologia Molecular MRC

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Bioquímica

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in their largest dimension, which used to represent a challenge. We present two alternative workflows for the structure determination of protein microcrystals by X-ray crystallography with a particular focus on crystals grown in vivo. The microcrystals are either extracted from cells by sonication and purified by differential centrifugation, or analyzed in cellulo after cell sorting by flow cytometry of crystal-containing cells. Optionally, purified crystals or crystal-containing cells are soaked in heavy atom solutions for experimental phasing. These samples are then prepared for diffraction experiments in a similar way by application onto a micromesh support and flash cooling in liquid nitrogen. We briefly describe and compare serial diffraction experiments of isolated microcrystals and crystal-containing cells using a microfocus synchrotron beamline to produce datasets suitable for phasing, model building and refinement.
These workflows are exemplified with crystals of the Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) polyhedrin produced by infection of insect cells with a recombinant baculovirus. In this case study, in cellulo analysis is more efficient than analysis of purified crystals and yields a structure in ~8 days from expression to refinement.

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

A protocol is presented for X-ray crystallography using protein microcrystals. Two examples analyzing in vivo-grown microcrystals after purification or in cellulo are compared.

Microcristalografia de Cristais de Proteína e<em&gt; Em Cellulo</em&gt; Difração

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We describe a versatile microfluidic chip that enables the production of crystals by the efficient method of counter-diffusion. The convection-free environment provided by the microfluidic channels is ideal for crystal growth and useful to diffuse a substrate into the active site of the crystalline enzyme. Here we applied this approach to the CCA-adding enzyme of the psychrophilic bacterium Planococcus halocryophilus in the presented example. After crystallization and substrate diffusion/soaking, the crystal structure of the enzyme:substrate complex was determined at room temperature by serial crystallography and the analysis of multiple crystals directly inside the chip. The whole procedure preserves the genuine diffraction properties of the samples because it requires no crystal handling.

A versatile microfluidic device is described that enables the crystallization of an enzyme using the counter-diffusion method, the introduction of a substrate in the crystals by soaking, and the 3D structure determination of the enzyme:substrate complex by a serial analysis of crystals inside the chip at room temperature.

Cristalização e Determinação Estrutural de uma Enzima:Complexo de Substrato por Cristalografia Serial em um Chip Microfluido Versátil

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins on-chip with the dialysis method and allowing in situ single-crystal or serial crystallography experiments at room temperature. The protocol details the fabrication process of the microchips, the manipulation of the on-chip crystallization experiments and the treatment of the in situ collected X-ray diffraction data for the structural elucidation of the protein sample. The main feature of this microfabrication procedure lies on the integration of a commercially available, semipermeable regenerated cellulose dialysis membrane in between two layers of the chip. The molecular weight cut-off of the embedded membrane varies depending on the molecular weight of the macromolecule and the precipitants. The device exploits the advantages of microfluidic technology, such as the use of minute volumes of samples (&#60;1 &#181;L) and fine tuning over transport phenomena. The chip coupled them with the dialysis method, providing precise and reversible control over the crystallization process and can be used for investigating phase diagrams of proteins at the microliter scale. The device is patterned using a photocurable thiolene-based resin with soft imprint lithography on an optically transparent polymeric substrate. Moreover, the background scattering of the materials composing the microchips and generating background noise was evaluated rendering the chip compatible for in situ X-ray diffraction experiments. Once protein crystals are grown on-chip up to an adequate size and population uniformity, the microchips can be directly mounted in front of the X-ray beam with the aid of a 3D printed holder. This approach addresses the challenges rising from the use of cryoprotectants and manual harvesting in conventional protein crystallography experiments through an easy and inexpensive manner. Complete X-ray diffraction data sets from multiple, isomorphous lysozyme crystals grown on-chip were collected at room temperature for structure determination.

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

This paper details the fabrication protocol of microfluidic chips developed for on-chip protein crystallization with the dialysis method and in situ X-ray diffraction experiments. The microfabrication process makes it possible to integrate a semipermeable regenerated cellulose dialysis membrane with any molecular weight cut-off, between two layers of the chip.

Cristalização de proteínas no chip por microdiálise para estudos de difração de raios-X in situ

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

Química

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since cryogenic temperatures are non-physiological and may prevent, deter, or even alter protein structural dynamics, a robust method for routine X-ray diffraction experiments at room temperature is highly desirable. The crystal-on-crystal device and its accompanying hardware and software used in this protocol are designed to enable in situ X-ray diffraction at room temperature for protein crystals of different sizes without any sample manipulation. Here we present the protocols for the key steps from device assembly, on-chip crystallization, optical scanning, crystal recognition to X-ray shot planning and automated data collection. Since this platform requires no crystal harvesting nor any other sample manipulation, hundreds to thousands of protein crystals grown on chip can be introduced into an X-ray beam in a programmable and high-throughput manner.

This contribution describes how to set up protein crystallization on crystal-on-crystal devices and how to perform automated serial data collection at room temperature using the on-chip crystallization platform.

Cristalização no chip e difração serial em larga escala à temperatura ambiente

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug discovery. To date, X-ray crystallography remains the most successful method for solving three-dimensional protein structures at atomic resolution. With recent advances in serial crystallography, either using X-ray free electron lasers (XFELs) or synchrotron light sources, protein crystallography has progressed to the next frontier, where the ability to acquire time-resolved data provides important mechanistic insights into the behavior of biological molecules at room temperature. This protocol describes a straightforward high-throughput (HTP) workflow for screening crystallization conditions through the use of a 96-well dialysis plate. These plates follow the Society for Biomolecular Screening (SBS) standard and can be easily set up using any standard crystallization laboratory. Once optimal conditions are identified, large quantities of crystals (hundreds of microcrystals) can be produced using the dialyzer. To validate the robustness and versatility of this approach, four different proteins were crystallized, including two membrane proteins.

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

The presented protocol describes a straightforward approach for screening protein crystallization conditions and crystal growth using a 96-well high-throughput dialysis plate. The use of dialyzer tubes for the large-scale growth of microcrystals is also demonstrated for serial crystallography and MicroED applications.

Cristalização de proteínas de alto rendimento via microdiálise

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...

Triagem de alto rendimento para cristalização de proteínas

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into an ordered lattice amenable to diffraction remains challenging. The crystallization of biomolecules is largely experimentally defined, and this process can be labor-intensive and prohibitive to researchers at resource-limited institutions. At the National High-Throughput Crystallization (HTX) Center, highly reproducible methods have been implemented to facilitate crystal growth, including an automated high-throughput 1,536-well microbatch-under-oil plate setup designed to sample a wide breadth of crystallization parameters. Plates are monitored using state-of-the-art imaging modalities over the course of 6 weeks to provide insight into crystal growth, as well as to accurately distinguish valuable crystal hits. Furthermore, the implementation of a trained artificial intelligence scoring algorithm for identifying crystal hits, coupled with an open-source, user-friendly interface for viewing experimental images, streamlines the process of analyzing crystal growth images. Here, the key procedures and instrumentation are described for the preparation of the cocktails and crystallization plates, imaging the plates, and identifying hits in a way that ensures reproducibility and increases the likelihood of successful crystallization.

Autor em destaque: triagem de alto rendimento para obter cristais para cristalografia de proteínas  

This protocol details high-throughput crystallization screening, ranging from the 1,536 microassay plate preparation to the end of a 6 week experimental time window. Details are included about the sample setup, the imaging obtained, and how users can perform analyses using an artificial intelligence-enabled graphical user interface to quickly and efficiently identify macromolecular crystallization conditions.

Triagem de alto rendimento para obter hits de cristal para cristalografia de proteínas

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

Cristalização automatizada de proteínas e coleta de dados em tempo real

Crystallization and In Situ Room Temperature Data Collection Using the Crystallization Facility at Harwell and Beamline VMXi, Diamond Light Source

Protocols for robotic protein crystallization using the Crystallization Facility at Harwell and in situ room temperature data collection from crystallization plates at Diamond Light Source beamline VMXi are described. This approach enables high-quality room-temperature crystal structures to be determined from multiple crystals in a straightforward manner and provides very rapid feedback on the results of crystallization trials as well as enabling serial crystallography. The value of room temperature structures in understanding protein structure, ligand binding, and dynamics is becoming increasingly recognized in the structural biology community. This pipeline is accessible to users from all over the world with several available modes of access. Crystallization experiments that are set up can be imaged and viewed remotely with crystals identified automatically using a machine learning tool. Data are measured in a queue-based system with up to 60&#176; rotation datasets from user-selected crystals in a plate. Data from all the crystals within a particular well or sample group are automatically merged using xia2.multiplex with the outputs straightforwardly accessed via a web browser interface.

Autor em destaque: Avançando na análise da estrutura de proteínas para o desenvolvimento de medicamentos 

We present a protocol for the crystallization of proteins using the crystallization facility in the Research Complex at Harwell and subsequent in situ X-ray crystallographic data collection from crystals within the plates at Diamond&#39;s Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) beamline. We describe sample requirements, crystallization protocols, and data collection guidelines.

Cristalização e Coleta de Dados de Temperatura Ambiente In Situ Usando a Instalação de Cristalização em Harwell e Linha de Luz VMXi, Fonte de Luz Diamante

Cristalização de proteínas para cristalografia de raios X

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Automated protocolos para cristalização Macromolecular no laboratório de Biologia Molecular MRC

Microcristalografia de Cristais de Proteína e

Cristalização e Determinação Estrutural de uma Enzima:Complexo de Substrato por Cristalografia Serial em um Chip Microfluido Versátil

Cristalização de proteínas no chip por microdiálise para estudos de difração de raios-X in situ

Cristalização no chip e difração serial em larga escala à temperatura ambiente

Cristalização de proteínas de alto rendimento via microdiálise

Triagem de alto rendimento para obter hits de cristal para cristalografia de proteínas

Triagem de alto rendimento para obter hits de cristal para cristalografia de proteínas

Triagem de alto rendimento para obter hits de cristal para cristalografia de proteínas

Cristalização e Coleta de Dados de Temperatura Ambiente In Situ Usando a Instalação de Cristalização em Harwell e Linha de Luz VMXi, Fonte de Luz Diamante