A micróglia derivada de iPS representa uma fonte biologicamente relevante de micróglia humana para experimentação in vitro e é uma ferramenta importante para investigar a biologia da micróglia na saúde e na doença. Apresentamos um protocolo simples de diferenciação de micróglias que requer o uso mínimo de fatores de crescimento e alcança alta pureza e rendimento. Além disso, demonstramos um ensaio de fagocitose totalmente humanizado.
As células semelhantes a micróglias derivadas de iPSC são muito sensíveis à evaporação do meio. Você deve evitar usar os poços no canto da placa de cultura celular e encher todos os poços vazios com água para melhorar a sobrevivência. Uma vez que as células-tronco pluripotentes induzidas, ou iPSCs, tenham atingido 80% de confluência, dissociar as colônias lavando com um mililitro de DPBS e adicionando um mililitro de um reagente de dissociação por dois minutos a 37 graus Celsius.
Desaloje as colônias usando um elevador de células raspando várias vezes para criar uma única suspensão celular. Recolha a suspensão e transfira-a para um tubo cónico de 15 mililitros contendo nove mililitros de DPBS. Em seguida, centrifugar as células a 500 vezes g por um minuto, remover o sobrenadante e ressuspender em um mililitro do meio do Corpo Embrionário, ou EB.
Tome 10 microlitros de células e dilua um a dois com azul de tripano. Conte as células em um hemocitômetro e, com base na contagem de células, dilua o estoque de células para uma diluição final de 10.000 células por 100 microlitros. Para células de revestimento, adicione 100 microlitros das células diluídas por poço em uma placa de fundo redondo de 96 poços de baixa aderência.
Centrifugar a placa a 125 vezes g durante três minutos e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante quatro dias. No segundo dia, usando uma pipeta multicanal, substitua o antigo meio meio EB por um meio novo. Para gerar Precursores Primitivos de Macrófagos, ou PMPs, cubra os poços de uma placa de seis poços adicionando um mililitro de solução de revestimento Matrigel gelada.
Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por duas horas, ou durante a noite. No quarto dia de diferenciação do EB, usando uma ponta de pipeta de um mililitro, transfira os EBs para os poços revestidos de Matrigel. Pipeta para cima e para baixo para desalojar os EBs do poço.
Em seguida, mantenha a placa inclinada para permitir que os EBs se estabeleçam na borda do poço. Uma vez que todos os EBs tenham se estabilizado, pipete suavemente e substitua o meio antigo, mantendo o EB na borda do poço com três mililitros de meio completo PMP recém-preparado. Distribua uniformemente as células nos poços embaralhando manualmente a placa de um lado para o outro e de trás para frente.
Em seguida, incube a placa por sete dias para permitir que os EBs se fixem ao fundo do poço. Após sete dias, inspecione os EBs sob um microscópio de campo de luz com quatro vezes de ampliação para garantir que eles estejam presos ao fundo dos poços. Realize uma meia troca média e, no dia 21, substitua o meio completo por três mililitros de meio completo PMP.
No dia 28, procure por células redondas referidas como PMPs no sobrenadante. Em seguida, colete o meio contendo os PMPs usando uma pipeta de 10 mililitros e pipetter automático sem perturbar os EBs. Transfira os PMPs no meio para um tubo cônico de 15 mililitros.
Centrifugar os PMPs coletados a 200 vezes g por quatro minutos e aspirar o sobrenadante antes de ressussuscitá-los em um a dois mililitros de células semelhantes a micróglias, ou meio basal IMG. Em seguida, conte as células no hemocitômetro conforme descrito anteriormente. Centrifugar o resto das células e diluir os PMPs para a concentração desejada.
Em seguida, prenda as células a uma densidade de 10 a quintas células por centímetro quadrado em placas tratadas com cultura celular usando meio completo IMG recém-preparado. Para o ensaio de fagocitose de células vivas, placa 20 a 30 vezes 10 para o quarto PMPs em uma placa de 96 poços e 100 microlitros de IMG meio completo e siga o processo de diferenciação por 10 dias. No dia do ensaio, remova 40 microlitros de meio por poço e adicione 10 microlitros da solução de coloração nuclear.
Incube a placa por duas horas. Descongele os sinaptossomos rotulados no gelo e sonice suavemente usando um sonicador de água por um minuto. Novamente, coloque imediatamente os sinaptossomos no gelo.
Diluir os sinaptossomos marcados em meio completo IMG a um microlitro de sinaptossomos por 50 microlitros de meio. Para controle negativo, preparar 60 micromolares de citocalasina D em meio completo IMG para inibir a polimerização da actina e, portanto, a fagocitose. Em seguida, adicione 10 microlitros desta solução a cada poço para uma concentração final de 10 micromolares e incube por 30 minutos.
Retire a placa da incubadora e incube a 10 graus Celsius por 10 minutos. Mantenha a placa no gelo e adicione 50 microlitros de meio contendo sinaptossomos. Centrifugar a placa a 270 vezes g por três minutos a 10 graus Celsius e manter a placa no gelo até a aquisição da imagem.
Insira a placa em um leitor de imagens de células vivas e selecione os poços a serem analisados. Em seguida, selecione uma lente objetiva 20X. Em seguida, ajuste o foco, o diodo emissor de luz, ou LED, a intensidade, o tempo de integração e o ganho dos canais de campo brilhante e azul.
A fluorescência dos sinaptossomos deve ser insignificante no momento inicial. Selecione o número de telhas individuais a serem adquiridas em uma montagem por poço. Adquira 16 telhas no centro do poço, imaginando aproximadamente 5% da área total do poço.
Defina a temperatura para 37 graus Celsius e o intervalo de tempo desejado para a geração de imagens. Em seguida, abra o software de análise. Em seguida, abra o experimento que contém as imagens e clique no ícone Redução de dados.
No menu, escolha Costura de imagem em Processamento de imagem para criar uma imagem completa dos quatro por quatro blocos individuais na montagem com os parâmetros descritos no manuscrito do texto. Defina um limite de intensidade usando os canais DAPI e RFP para essas imagens. Abra uma imagem e clique em Analisar.
Em Análise, selecione Análise Celular e, em Canal de Detecção, escolha uma imagem costurada nos canais DAPI ou RFP. Em seguida, vá para a guia Máscara e Contagem Primária e estabeleça um valor limite e valores de tamanho de objeto que selecionem corretamente os núcleos de célula no canal DAPI ou o sinal de sinaptossomo no canal RFP. Para contar o número de núcleos, vá para o menu Redução de Dados e, em Análise de Imagem, selecione Análise Celular.
Novamente, vá para a guia Máscara Primária e Contagem e, em Canal, selecione as imagens costuradas DAPI e use os parâmetros descritos no manuscrito do texto. Em seguida, vá para a guia Métricas Calculadas e selecione Contagem de Células. Em seguida, para obter a área do sinal do sinaptossomo, vá para o menu Redução de Dados e, em Análise, selecione Análise Celular.
Novamente, vá para a guia Máscara Primária e Contagem e, em Canal, selecione Imagens costuradas por RFP e use os parâmetros detalhados no manuscrito do texto. Em seguida, vá para a guia Métricas Calculadas e selecione Área de Soma de Objetos. Na guia Redução de Dados, clique em OK para permitir que o software analise todas as imagens adquiridas.
Depois que as imagens forem analisadas, exporte os valores de Área de Soma de Objetos e Contagem de Células para cada ponto de tempo. Em seguida, divida a Área de Soma do Objeto pela Contagem de Células para calcular a área normalizada por ponto de tempo. Se comparando vários tratamentos, ou genótipos, calcule o índice de fagocitose usando a equação dada.
As iPSCs indiferenciadas apresentam morfologia de colônia compacta com bordas bem definidas. As iPSCs dissociadas formaram agregados esféricos denominados EBs e crescem em tamanho até o quarto dia de diferenciação. Quando os EBs são banhados para geração de PMP, eles se ligam às placas revestidas de Matrigel, e uma camada de células se espalha e envolve os agregados esféricos.
No dia 28, células redondas com uma grande relação citoplasma/núcleo aparecem na suspensão. Recomenda-se fortemente a cultura de iPSCs em placas revestidas com laminina 521 em vez de Matrigel, devido ao maior rendimento de PMP em placas revestidas com laminina 521. Após a exposição dos PMPs ao meio IMG, as células adquirem uma morfologia semelhante à microglia com um pequeno citoplasma na presença de processos alongados.
Além disso, a identidade da micróglia foi verificada por coloração imunofluorescente. Tipicamente, mais de 95% das células expressam IB1 e aproximadamente 90% das células expressam P2RY12 e TMEM119. A análise de Western blot confirmou que a iPSC derivou neurônios motores inferiores para marcadores sinápticos expressos por sinaptossomos, sinaptofisina e proteína de densidade pós-sináptica 95.
No controle em relação ao ponto de tempo inicial, por 10 horas, o sinal fluorescente vermelho foi robusto, pois a maioria dos sinaptossomos havia sido engolida e estava localizada em compartimentos intracelulares ácidos. Nos IMGs tratados com Cytochalasin D, uma forte redução do sinal vermelho por zero e 10 horas indicou que o sinal detectado resulta de eventos fagocíticos. A área dos sinaptossomos engolidos aumentou com o tempo até 16 horas.
No entanto, a área de sinal vermelho das células tratadas com Cytochalasin D não aumentou com o tempo. As células semelhantes à Microglia derivadas do iPS podem ser usadas para várias aplicações, incluindo fagocitose e resposta inflamatória no estudo de doenças neurodesenvolvimentais e neurodegenerativas.
