O desenvolvimento de novas terapias para metástases no SNC tem sido dificultado pela falta de bons modelos pré-clínicos. Nossos modelos de xenoenxerto derivados de pacientes recapitulam melhor a metástase do SNC do que os modelos de linhagem celular historicamente usados. Utilizando diferentes vias de inoculação tumoral, pode-se estudar diferentes aspectos da cascata metastática.
Cada percurso tem vantagens que podem ser aproveitadas para o seu estudo. Quem demonstrará o procedimento será Ben Yi Tew, pós-doutorando do meu laboratório. Para a implantação no flanco subcutâneo de tumores PDX criopreservados descongelar rapidamente o tecido tumoral criopreservado em banho-maria de 37 graus Celsius.
Em seguida, enxágue em cinco mililitros de DPBS em uma placa de cultura de tecidos. Em seguida, após a confirmação da anestesia em uma rata NOG fêmea de três a oito semanas de idade, faça uma incisão de 0,5 a um centímetro no flanco esquerdo ou direito e insira um pedaço de 2x2x2 milímetros do tecido tumoral profundamente na bolsa. Após o fechamento da incisão, deixe o camundongo se recuperar da anestesia com monitoramento até que esteja deambulando.
Uma vez que o tumor começa a crescer, medir o tumor três vezes por semana com um paquímetro. No desfecho experimental apropriado, identificar metástases através de uma necropsia e confirmar a presença de tumores dentro do órgão-alvo através de uma análise histológica. Colocar o tumor PDX ressecado no DMEM sobre gelo.
Lave o tumor em cinco mililitros de DPBS em uma placa de cultura de tecidos e remova as regiões necróticas, se houver. Corte o tumor em pequenos pedaços de dois a quatro milímetros de comprimento e transfira os pedaços para um tubo contendo solução de dissociação. Usando o programa apropriado em um dissociador, dissociar mecanicamente o tecido e esticar a suspensão celular resultante através de um filtro de células de 70 micrômetros.
Use 20 mililitros de DMEM para lavar as células restantes do filtro e centrifugar a suspensão de células dissociadas. Em seguida, ressuspenda as células e DPBS para contagem e ajuste as células para uma concentração de cinco a 10 vezes 10 para a quarta célula por um a dois microlitros de DPBS. Para preparar a área cirúrgica, raspe o pelo na cabeça do rato para expor o couro cabeludo.
Em seguida, coloque o mouse em uma estrutura estereotáxica, prendendo firmemente a cabeça do mouse usando barras auriculares. Certifique-se também de administrar um analgésico apropriado. Desinfetar o couro cabeludo com três esfoliantes alternados de iodopovidona e etanol 70%.
Faça uma incisão longitudinal de cinco a sete milímetros para expor o crânio e retrair o couro cabeludo. Raspar o periósteo com pinça para localizar o bregma. Posicione a agulha do quadro estereotáxico em cima do bregma e redefina as coordenadas para zero.
Mover o braço um milímetro posterior e um milímetro lateral à direita da linha média, e marcar este local com um marcador permanente. Em seguida, faça um pequeno furo no crânio no local marcado, tomando cuidado para não perfurar o cérebro. Carregue na seringa Hamilton de cinco microlitros calibre 26 com um a dois microlitros de células e prenda a seringa ao braço estereotáxico.
Insira lentamente a agulha dois milímetros no cérebro e comece a injetar células na taxa desejada. Quando todas as células tiverem sido liberadas, retraia lentamente a agulha, preencha o orifício da rebarba com cera de osso e feche a incisão. Coloque o rato de volta em sua gaiola com monitoramento até a recuperação da anestesia.
Após a eutanásia do animal no desfecho experimental apropriado, confirme a presença de tumores no cérebro através de uma análise histológica. Para implantar tumores PDX por injeção intracardíaca, prepare as células tumorais conforme demonstrado e coloque o camundongo receptor anestesiado na posição supina. Raspar o pelo no peito do animal e desinfetar a pele exposta com iodopovidona e etanol 70%.
Desenhe de 0,5 a 10 vezes 10 até a quinta célula tumoral e até 100 microlitros de DPBS em uma seringa equipada com uma agulha de calibre 28. Localize o local de injeção ligeiramente à esquerda do esterno, a meio caminho entre a fúrcula esternal e o processo xifoide. Em seguida, insira a agulha verticalmente no mouse no local da injeção.
Uma vez observado o refluxo, indicando uma entrada bem-sucedida da agulha no ventrículo esquerdo, dispense lentamente a suspensão do tumor no ventrículo esquerdo sem mover a agulha. Quando todas as células tiverem sido liberadas, retraia lenta e verticalmente a agulha e aplique um pedaço de gaze estéril no local da injeção por cerca de um minuto até que o sangramento pare. Permita que o mouse se recupere em uma almofada aquecida com monitoramento até que esteja deambulando.
No desfecho experimental apropriado, identificar metástases através de uma necropsia e confirmar a presença de tumores dentro do órgão-alvo através de uma análise histológica. Apesar das diferenças no microambiente tumoral, os tumores PDX demonstram morfologias semelhantes contendo células com núcleos pequenos e citoplasma escasso, independentemente do local de implantação. Nesta análise, a injeção intracardíaca de células de melanoma humano resultou em metástases das células tumorais para o cérebro de camundongos, enquanto a injeção intracardíaca de metástases cerebrais de células tumorais de câncer de pulmão de pequenas células humanas resultou em metástases para a cavidade abdominal e fígado de camundongos.
Esses protocolos permitem o estabelecimento de estudos pré-clínicos para testar novos tratamentos e combinações de tratamentos, e podem auxiliar no estudo de processos biológicos e metástases tumorais.
