As vias de sinalização que controlam sistemas multicelulares são dinâmicas. Para entender a função dessas dinâmicas, é essencial ser capaz de modular sutilmente essas dinâmicas sem afetar a atividade de sinalização geral. Este protocolo utiliza um sistema microfluido que permite dissecção funcional de oscilações de sinalização no desenvolvimento de embriões de camundongos.
A dinâmica de sinalização foi encontrada em muitos tecidos, incluindo os adultos. Microfluidos é uma ferramenta versátil que pode ser adaptada para atender a muitos sistemas de modelos, incluindo culturas celulares, tecidos e organoides. Para começar, prepare a quantidade necessária de PDMS misturando o monômero com o catalisador em uma proporção de nove para um para induzir a polimerização.
Use ferramentas descartáveis e certifique-se de que a mistura seja adequadamente alcançada. Coloque a mistura de PDMS em um dessecator e aplique vácuo por aproximadamente 30 minutos para remover o ar. Despeje uma camada PDMS de aproximadamente três a cinco milímetros no molde do chip e coloque de volta no dessecator por aproximadamente 30 minutos.
Cure o molde colocando-o em um forno durante a noite a 65 graus Celsius ou inferior, dependendo do material do molde. Corte o chip do molde usando um bisturi. Perfurar furos de entrada e saída com um soco de biópsia de um milímetro a partir do interior da câmara microfluidica.
Limpe o deslizamento de vidro com ar comprimido. Para ligar o chip ao escorregador de vidro, coloque o chip e o deslizamento de vidro no forno de plasma com as laterais a serem ligadas de frente para cima. Gere plasma usando o protocolo específico para a máquina usada, em seguida, conecte o chip ao vidro colocando as superfícies ativadas umas nas outras e aplicando pressão uniformemente.
Para preparar a tubulação e o chip para o experimento, corte a tubulação em um ângulo de 45 graus e coloque uma agulha em cada um dos tubos. Coloque a tubulação com agulhas, o chip e os plugues em um prato e esterilize-os expondo à luz ultravioleta por aproximadamente 15 minutos. Para revestir o chip com fibronectina, coloque o chip em um béquer contendo PBS mais 1%penicilina ou estreptomicina à temperatura ambiente.
Lave o chip com PBS para remover ar com uma pipeta P200. Carregue uma seringa de três mililitros para cada câmara do chip. Conecte a agulha à seringa contendo fibronectina e conecte a seringa à bomba de seringa.
Lave a tubulação manualmente para remover o ar. Conecte a tubulação de saída à saída do chip. Certifique-se de empurrar o tubo até o fundo e definir uma baixa taxa de fluxo para revestir o chip.
Deixe a bomba de seringa funcionar por pelo menos duas horas ou durante a noite. Quando terminar, pare a bomba e corte a tubulação logo após a agulha. Prepare seringas preenchidas com o meio para o experimento e desgas tanto o meio de cultura quanto o chip dentro da PBS.
Tente lavar ou sugar a maioria das bolhas de ar do chip, em seguida, instalar seringas nas bombas e anexar tubos de entrada às seringas. Para carregar tecido no chip, disseque a ponta mais posterior da cauda. Lave o chip com meio de cultura com 25 HEPES micromolar para remover o PBS.
Carregue o tecido no chip usando uma pipeta P200. Após cada etapa de carga tecidual, feche a entrada correspondente de carga de tecido usando um pedaço de tubulação cheia de PDMS. Para montar a configuração microfluidica, conecte a tubulação ao chip microfluido sem obter bolhas de ar dentro.
Para isso, certifique-se de que há uma gota de meio presente no final da tubulação. Uma vez que toda a tubulação é anexada ao chip, tire-o do béquer e coloque-o em um prato contendo um tecido molhado. Coloque o prato e aproximadamente 1,5 metros de tubulação de entrada em uma incubadora para a cultura da noite para o dia.
Garanta uma alta umidade para evitar a formação de bolhas de ar durante a cultura. Alternativamente, seque a parte externa do chip e coloque-a em um suporte de microscópio, em seguida, coloque o suporte e aproximadamente 1,5 metros de tubos de entrada dentro da câmara de incubação de um microscópio invertido para um experimento de imagem ao vivo. Após pelo menos 20 minutos de fluxo constante, inicie o bombeamento planejado para o experimento.
Para entrar na sinalização de entalhe no embrião do rato segmentante, use um programa de bombeamento de 100 minutos médios e 30 minutos de pulsos de drogas repetidos até o final do experimento, normalmente por 24 horas. Para imagens em tempo real, comece a fotografar depois de pelo menos 30 minutos. Para confirmar a entrada de oscilações de sinalização, vários experimentos são alinhados usando o tempo dos pulsos da droga e visualizados com o corante Cascata Azul.
As oscilações quantificadas podem ser destreficadas e exibidas como desvio médio e padrão ou fases das oscilações podem ser calculadas. A relação de fase entre oscilações de culturas independentes de embriões posteriores entre si e os pulsos externos de drogas pode ser analisada. Para confirmar a entranção, pode-se, por exemplo, determinar o período das oscilações de sinalização endógena usando o programa pyBOAT baseado em Python.
Ao aplicar pulsos com um período de 130 minutos, as oscilações de sinalização de entalhe também mostram um período de 130 minutos. É fundamental evitar a evaporação do líquido durante o experimento microfluido. Caso contrário, bolhas de ar se formarão no chip que interfere com o fluxo médio.
Para evitar isso, desgas o médio e o chip e certifique-se de que a umidade na incubadora é alta o suficiente. Usando este método, a dinâmica de sinalização pode ser modulada e seus efeitos podem ser analisados por imagens em tempo real de repórteres fluorescentes, imunostainings ou hibridização in situ. Além disso, o tecido também pode ser extraído do chip para análise posterior.
Pode-se usar este método para estudar a função de oscilações de sinalização no desenvolvimento embrionário. Foi aplicado para demonstrar a importância do turno de fase entre duas vias de sinalização oscilantes para a segmentação do embrião do camundongo. De forma mais geral, agora pode ser usado para dissecar o mecanismo de codificação de sinalização dinâmica em sistemas multicelulares.
