O financiamento para este protocolo foi fornecido pelo Programa Intramural do NICHD para KWR (ZIA HD009002-01). Agradecemos a Jeff Farrell e seu laboratório por seu feedback esclarecedor, a Will Anderson por excelente suporte técnico, a Leanne Iannucci por testar o protocolo e medir a irradiância, e às instalações do NIH Shared Zebrafish por seu trabalho árduo mantendo o peixe-zebra saudável.

Investigando o desenvolvimento com manipulação de sinalização optogenética em peixe-zebra

Os autores não têm nada a revelar.

A injeção de mRNA é a estratégia atual para entregar bOpto-BMP/Nodal a embriões de zebrafish. Este método tem várias desvantagens. Primeiro, a quantidade apropriada de mRNA varia entre os laboratórios. A quantidade utilizada deve ser suficiente para ativar a sinalização de forma robusta com exposição à luz, mas sem ativação inadvertida do escuro. É uma boa ideia testar várias quantidades para encontrar níveis ideais de mRNA e, uma vez estabelecidos, criar alíquotas de uma mistura mestre para introduzir reproduticamente a mesma quantidade de mRNA. Em segundo lugar, a distribuição desigual do RNAm injetado pode levar à ativação desigual da sinalização. Acredita-se que injetar no centro da célula (não na gema) promova até mesmo a distribuição de mRNA. Finalmente, como o mRNA injetado se degrada com o tempo, essa abordagem pode não ser adequada para experimentos em embriões mais velhos. No futuro, esses problemas poderão ser resolvidos por linhagens de zebrafish transgênicos expressando de forma ubíqua bOpto-BMP/Nodal com um promotor materno ou induzível por drogas. Embora trabalhar com zebrafish adultos potencialmente sensíveis à luz possa ser um desafio neste contexto, os peixes-zebra 61,62 e Drosophila 22,34,35,63 transgênicos que abrigam ferramentas optogenéticas foram desenvolvidos com sucesso.
Evitar a fotoativação inadvertida é um desafio geral com ferramentas optogenéticas. Para simplificar, trate embriões injetados com mais de 1,5 hpf como sensíveis à luz. A exposição inadvertida à luz muitas vezes pode ser evitada simplesmente embrulhando pratos ou pratos com papel alumínio. No entanto, para experimentos que requerem observação visual de embriões vivos com mais de 1,5 hpf, é possível usar fontes de luz vermelha ou cobrir fontes de luz branca com papel de filtro de gel barato que bloqueia comprimentos de onda dimerizantes de LOV (Tabela de Materiais).
A caixa de luz descrita aqui é projetada para aplicações específicas que exigem controle preciso sobre os níveis de irradiância, dinâmica e comprimentos de onda da luz (Figura 2). Outros benefícios desta caixa de luz incluem exposição uniforme à luz, aquecimento inadvertido inadvertido da amostra, amplo espaço para múltiplas placas de 6 poços e fontes de luz de longa duração e espectralmente bem caracterizadas. No entanto, diferentes estratégias de exposição à luz podem ser preferíveis dependendo da aplicação da pesquisa. Muitos laboratórios desenvolveram sistemas de exposição à luz uniformes mais simples e econômicos com pegadas menores, incluindo incubadoras de revestimento com fitas de LED, suspensão de painéis de LED sobre amostras ou incorporação de LEDs em tampas de placas de cultura 32,38,39,40,64,65,66. É importante ressaltar que a caixa de luz usada neste protocolo não permite que os usuários regulem poços individuais de forma independente (em contraste com Bugaj et al.52) ou forneçam controle espacial sobre a exposição à luz. A ativação optogenética espacialmente localizada foi demonstrada com bOpto-BMP38 e bOpto-Nodal39 usando lasers em SPIM ou sistemas confocais, respectivamente, e também foi realizada com muitas outras estratégias optogenéticas em uma variedade de sistemas modelo (discutido em Rogers e Müller12). Algumas abordagens até alcançaram resolução espacial subcelular 29,30,31. Embora a implementação de sistemas de exposição à luz espacialmente localizados esteja fora do escopo deste protocolo, experimentos de ativação espacial com bOpto-BMP/Nodal são teoricamente possíveis com equipamentos especializados, como dispositivos de microespelho digital ou abordagens de mascaramento. Os leitores são encorajados a explorar a extensa literatura sobre caixas de luz DIY para experimentos optogenéticos antes de se comprometerem com uma estratégia de exposição à luz (ver, por exemplo, Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar e Khammash 53 e mais em https://www.optobase.org/materials/).
Estratégias optogenéticas moleculares frequentemente oferecem um maior grau de controle espaço-temporal sobre processos biológicos em comparação com abordagens históricas, como mutantes, expressão gênica ectópica, proteínas recombinantes e drogas. Os leitores interessados nos benefícios das abordagens optogenéticas podem explorar outras ferramentas publicadas disponíveis em peixes-zebra e outros organismos. Estes incluem ferramentas para manipular vias de sinalização adicionais 32,65,67,68, regular a expressão gênica 61,64,66,69,70,71, alterar a localização de proteínas 31,72 e ativar a apoptose 62. Essas ferramentas e muitas outras estão convenientemente catalogadas no OptoBase, um recurso web com curadoria para abordagens de optogenética molecular28. Para aqueles inspirados a criar novas ferramentas optogenéticas, o recurso também apresenta descrições úteis de proteínas responsivas à luz que foram empregadas em uma ampla gama de estratégias, incluindo proteínas responsivas à luz que respondem a comprimentos de onda verde, vermelho e infravermelho próximo. Estamos entusiasmados para que a comunidade científica perceba todo o potencial das abordagens optogenéticas moleculares.

As vias de sinalização permitem que as células respondam ao seu ambiente e coordenem atividades em escalas de tecidos e organismos. Sinais cruciais para o desenvolvimento embrionário incluem a proteína morfogenética óssea (BMP) dos membros da superfamília TGF-beta e o Nodal 1,2,3. Durante a embriogênese, as vias reguladas por esses sinais e outros modelam o plano do corpo, controlando a expressão gênica e processos adicionais para garantir que diversos tecidos e órgãos se desenvolvam e interajam adequadamente. Patologias, incluindo defeitos congênitos e câncer, podem ocorrer quando a sinalização ou as respostas à sinalização são perturbadas 4,5,6,7. Apesar da rigorosa investigação sobre sinalização, muito mais ainda precisa ser descoberto sobre como níveis e dinâmicas são decodificados em uma variedade de contextos 8,9,10,11, especialmente durante o desenvolvimento 12,13,14,15,16,17,18,19.
Para entender como a sinalização é decodificada, um experimento ideal seria manipular os níveis, o tempo e/ou a dinâmica da sinalização - com alto grau de controle espacial e temporal - e avaliar os resultados. Por exemplo, gradientes precisos de sinalização espacial são propostos para padronizar tecidos em desenvolvimento20,21. Alterar as distribuições espaciais dos gradientes de sinalização ajudaria a testar essa hipótese22. Além disso, a importância da dinâmica de sinalização na geração de diversas respostas celulares está ficando cada vez mais clara: uma mesma via de sinalização pode instruir as células a se diferenciarem ou proliferarem dependendo da frequência de sinalização,por exemplo9,23. Paradigmas experimentais nos quais a dinâmica de sinalização pode ser facilmente manipulada serão valiosos para explorar a relação entre dinâmica e decisões sobre o destino celular 8,12,13,14,15.
Historicamente, múltiplos métodos têm sido utilizados para manipular a sinalização em contextos de desenvolvimento, levando a descobertas fundamentais 1,2,3. A sinalização pode ser bloqueada usando mutantes de perda de função da via, expressão de inibidores ectópicos ou drogas antagonistas. Métodos para ativar a sinalização incluem drogas agonistas, ligantes recombinantes, expressão ectópica de ligantes ou receptores constitutivamente ativos e mutantes inibidores de perda de função de vias aéreas. Esses métodos variam ao longo de um continuum de controle experimental. Por exemplo, mutantes e expressão ectópica podem cair no lado da marreta do contínuo: Com essas abordagens, mudanças dramáticas e sistêmicas na atividade da via podem causar morte precoce e impedir investigações em estágios posteriores, ou ao longo do tempo podem resultar em efeitos pleiotrópicos difíceis de desembaraçar. Além disso, muitas vezes é desafiador manipular independentemente um recurso de sinalização por vez, como nível ou duração. No outro extremo do contínuo, alguns métodos oferecem controle experimental mais preciso, como dispositivos microfluídicos que expõem amostras a drogas ou proteínas recombinantes com controle temporal e, às vezes, espacial 18,24,25, ou métodos genéticos, incluindo promotores induzíveis por choque térmico e tecido-específicos que podem oferecer benefícios semelhantes16,26,27. No entanto, esses métodos podem ser difíceis de executar, podem não ser reversíveis, podem ter cinética relativamente lenta ou baixa resolução, e podem não estar disponíveis em alguns sistemas modelo.
Abordagens optogenéticas moleculares são uma poderosa adição a este kit de ferramentas. Essas abordagens utilizam proteínas que respondem a diferentes comprimentos de onda de luz para manipular processos biológicos, incluindo a sinalização8,12,13,14,15, e foram desenvolvidas ao longo de décadas para uso em uma variedade de sistemas, desde cultura celular até animais inteiros12,13,28. Em comparação com abordagens históricas, a optogenética molecular pode muitas vezes oferecer um maior grau de controle espaço-temporal sobre processos biológicos: O controlador em sistemas optogenéticos é a luz, e o controle do comprimento de onda, intensidade, duração e frequência de exposição da luz é relativamente simples. Com sistemas sofisticados, como microscópios confocais e de dois fótons, o controle espacial na faixa subcelular é possível 29,30,31. Ferramentas para manipular optogeneticamente a sinalização têm sido desenvolvidas e aplicadas em vários sistemas, incluindo os descritos em Johnson et al.22, Čapek et al.32, Krishnamurthy et al.33 e Huang et al.34. Por exemplo, explorando o controle espacial proporcionado pela optogenética, essa estratégia foi recentemente utilizada para modificar um gradiente de sinalização em embriões de Drosophila, demonstrando que a embriogênese de moscas é surpreendentemente robusta a mudanças nessegradiente22. A reversibilidade e a rápida cinética liga/desliga dos ativadores de sinalização optogenética também os tornaram ferramentas atrativas para investigar a decodificação da dinâmica da sinalização8,12,13,14,15,34,35,36.
O embrião de peixe-zebra precoce é um sistema in vivo adequado para estudos optogenéticos porque é fertilizado externamente, transparente, amigável à microscopia e geneticamente tratável. A exposição à luz é mais fácil de entregar a embriões que se desenvolvem fora da mãe, a luz pode penetrar e acessar seus tecidos não opacos, embriões vivos de peixe-zebra toleram bem a imagem (além de transparentes) e os métodos genéticos existentes fornecem oportunidades diretas para experimentos de knockdown e superexpressão, além do desenvolvimento de transgênicos úteis37.
Recentemente, ferramentas optogenéticas foram desenvolvidas para ativar a sinalização BMP38 e Nodal39 em embriões de zebrafish com exposição à luz azul (Figura 1). Referimo-nos a essas ferramentas como bOpto-BMP e bOpto-Nodal (b para ativado por luz azul e Opto para optogenética). bOpto-BMP/Nodal são baseados em mecanismos de ativação de vias semelhantes. A ligação de BMP ou ligantes nodais às suas respectivas receptoras serina-treonina quinases conduz interações de domínio receptor quinase que levam à fosforilação de efetores de sinalização (Smad1/5/9 para BMP e Smad2/3 para Nodal). Os efetores de sinalização fosforilados então se translocam para o núcleo e regulam a expressão do gene alvo3 (Figura 1A,D). Essas interações do receptor quinase podem ser tornadas responsivas à luz acoplando as quinases do receptor às proteínas dimerizantes responsivas à luz: Com a exposição à luz, essas proteínas quiméricas devem dimerizar-se, fazendo com que os domínios da quinase do receptor interajam e ativem a sinalização (Figura 1B,C,E,F). É importante ressaltar que, ao contrário dos receptores endógenos, o bOpto-BMP/Nodal não contém domínios de ligação ao ligante extracelular, garantindo atividade independente do ligante (Figura 1C,F). Essa estratégia de ativação optogenética foi primeiramente realizada com o receptor tirosina quinases40,41,42 e depois aplicada com o receptor serina-treonina quinases.
bOpto-BMP/Nodal utilizam o domínio homodimerizante luz-oxigênio-voltage sensing (LOV) responsivo à luz azul (~450 nm) da alga Vaucheria fridiga AUREO1 protein (VfLOV)43,44. Esses construtos consistem em um motivo de miristoilação direcionado à membrana, seguido por domínios BMP ou nodal receptor quinase, fundidos a um domínio LOV (Figura 1B,E). A exposição à luz azul deve causar homodimerização da LOV, resultando em interações no domínio da quinase do receptor que levam à respectiva fosforilação do Smad e ativação da via (Figura 1C,F). Para bOpto-BMP, uma combinação de construções com os domínios da quinase do receptor tipo I de Acvr1l (também conhecido como Alk8) e BMPR1aa (também conhecido como Alk3) e o domínio quinase do receptor tipo II de BMPR2a foi encontrada para ativar otimamente a sinalização38 (Addgene #207614, #207615 e #207616). Para o bOpto-Nodal, uma combinação de construtos com o domínio da quinase do receptor tipo I do Acvr1ba e o domínio quinase do receptor tipo II do Acvr2ba é usada39.
bOpto-BMP/Nodal foram introduzidos em embriões de peixe-zebra inicial injetando RNAm no estágio de uma célula e usados para investigar o papel da duração da sinalização na interpretação nodal39, para determinar por que o peixe-zebra perde a capacidade de responder ao Nodal45 e para examinar como os genes-alvo do BMP respondem a diferentes níveis de sinalização de BMP38. É provável que essas ferramentas continuem a ser úteis em uma gama diversificada de investigações futuras. No entanto, a força dos ativadores de sinalização optogenética também é sua fraqueza: amostras sensíveis à luz devem ser tratadas com cuidado para evitar atividade de sinalização ectópica inadvertida. A exposição à luz ambiente ou à luz solar pode ativar o bOpto-BMP/Nodal.
Este protocolo fornece sugestões práticas para o uso de BMP e ativadores nodais baseados em LOV-mRNA codificados por mRNA em embriões precoces de zebrafish. Começa detalhando uma estratégia para construir uma caixa de luz para controlar a exposição à luz uniforme e a temperatura (Figura 2, Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2, Arquivo Suplementar 3, Arquivo Suplementar 4, Arquivo Suplementar 5, Arquivo Suplementar 6, Arquivo Suplementar 7, Arquivo Suplementar 8). Em seguida, descreve dois experimentos de controle chave que determinam se um ativador de sinalização optogenética está se comportando como esperado, ou seja, ativando a atividade da via apenas quando exposto à luz (Figura 3). O primeiro ensaio de controle envolve o exame de fenótipos um dia após a fertilização em embriões expostos e não expostos à luz (Figura 3A). Embriões expostos à luz injetados com RNAm, mas não embriões não expostos, devem fenocopiar BMP ou superexpressão nodal (Figura 4A,B; Os fenótipos de BMP, em particular, são claramente distinguíveis neste momento ponto46). Este ensaio fornece uma leitura rápida da atividade. No segundo ensaio de controle, para determinar se os fenótipos são causados especificamente pelo excesso de BMP ou sinalização nodal e para observar diretamente a mudança nos níveis de sinalização, a coloração de imunofluorescência é usada para detectar efetores de sinalização fosforilados (pSmad1/5/9 ou pSmad2/3, respectivamente) após uma exposição à luz de 20 min em torno do estágio final de blástula/gastrulação inicial, quando a atividade de sinalização foi bem descrita12, 16,17,47,48,49,50 (Figura 3B e Figura 4C). (Observe que, embora a ativação espacialmente localizada tenha sido demonstrada tanto para o bOpto-BMP38 quanto para o bOpto-Nodal39, esse protocolo descreve apenas estratégias uniformes de exposição à luz e ativação de sinalização.) É aconselhável executar esses experimentos de controle antes de aplicar o bOpto-BMP/Nodal em questões específicas de pesquisa, a fim de determinar condições experimentais locais ideais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Building a light box &#38; Light exposure protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#8 x 1&#34; Hex Self-drilling Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>99663A222</td>
			<td>1.4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Optical Power and Energy Meter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>1.7 
			4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (142 liters)</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>139400</td>
			<td>1.3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Panel Mount (1/4&#34; thick cast black acrylic)</td>
			<td>Custom part / Piedmont Plastics</td>
			<td>Incubator_panel</td>
			<td>1.4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large HSS Spiral Groove Step Drill Bit</td>
			<td>CO-Z</td>
			<td>SDB0001TA</td>
			<td>1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED lens gasket, Incubator gasket; 1/32&#34; thick black silicone</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5812T12</td>
			<td>1.4.3 
			1.4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED microplate illuminator</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>NA</td>
			<td>1.1 
			1.4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 10mm Cube Standoff</td>
			<td>Newark Eletronics</td>
			<td>005.60.533</td>
			<td>1.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 x 10mm 316SS Flat Head Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91801A156</td>
			<td>1.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M6 x 10mm 316SS Flat Head Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91801A305</td>
			<td>1.4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memory card thermometer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15-081-111</td>
			<td>1.9 
			3.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Power Meter Sensor Head (150 mW)</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S170C</td>
			<td>1.7 
			4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red gel filter paper #E106</td>
			<td>Rosco / B&#38;H Foto &#38; Electronics</td>
			<td>110084014805-E106</td>
			<td>4.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Side Brackets (1/4&#34; thick cast black acrylic)</td>
			<td>Custom part / Piedmont Plastics</td>
			<td>Side_bracket</td>
			<td>1.4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Bracket (1/4&#34; thick cast black acrylic)</td>
			<td>Custom part / Piedmont Plastics</td>
			<td>Vertical_bracket</td>
			<td>1.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weather stripping: Light duty EPDM foam, 1/2&#34; wd 1/4&#34; tk</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8694K12</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generating mRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZNA MicroElute Cycle Pure Kit</td>
			<td>Omega</td>
			<td>D6293-02</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Miniprep Kit (250 rxns)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsample incubator (Hybex)</td>
			<td>SciGene</td>
			<td>1057-30-0</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsample incubator 1.5 ml tube block (Hybex)</td>
			<td>SciGene</td>
			<td>1057-34-0</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>R3189L</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-Opto-Alk3</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>207614</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-Opto-Alk8</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>207615</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-Opto-BMPR2a</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>207616</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit (250 rxns)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injecting mRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (UltraPure)</td>
			<td>Invitrogen / Thermo Fisher</td>
			<td>16500500</td>
			<td>3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml glass beakers</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB100250</td>
			<td>3.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well dishes (case of 50)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08 772 1B</td>
			<td>3.1.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-8A ball joint</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>B-8A</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Back pressure unit (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>BPU</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot switch (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>FWS</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GJ-1 magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries (4 in, OD 1 mm, filament)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>3.1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish bottoms (for dechorionating)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>08-748A</td>
			<td>3.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes (5 3/4&#34; with wide tip)</td>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>63A53WT</td>
			<td>3.1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection dish molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>tu1</td>
			<td>3.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP iron plate</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IP</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-152 micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pipette holder kit (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>MIMPH-MPIP-Kit</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometers</td>
			<td>Meiji Techno America</td>
			<td>MA285</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-2 pressure injector (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>3.1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm x 15 mm, case of 500)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td>3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (10 ml, green)</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F37898-0000</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>3.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squeeze bottles (500 ml)</td>
			<td>Nalgene / Thermo Scientific</td>
			<td>2402-0500</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic signaling activation in zebrafish embryos

As vias de sinalização orquestram processos biológicos fundamentais, incluindo desenvolvimento, regeneração, homeostase e doença. Métodos para manipular experimentalmente a sinalização são necessários para entender como a sinalização é interpretada nesses contextos abrangentes. Ferramentas optogenéticas moleculares podem fornecer manipulações reversíveis e ajustáveis da atividade da via de sinalização com alto grau de controle espaço-temporal e têm sido aplicadas in vitro, ex vivo e in vivo. Essas ferramentas combinam domínios de proteínas responsivos à luz, como o domínio de detecção de luz-oxigênio-voltagem (LOV) homodimerizante da luz azul, com efetores de sinalização para conferir controle experimental dependente da luz sobre a sinalização. Este protocolo fornece diretrizes práticas para o uso da proteína morfogenética óssea (BMP) baseada em LOV e ativadores de sinalização nodal bOpto-BMP e bOpto-Nodal no embrião de zebrafish precoce opticamente acessível. Descreve dois experimentos de controle: um ensaio rápido de fenótipo para determinar condições experimentais apropriadas e um ensaio de imunofluorescência para avaliar diretamente a sinalização. Juntos, esses experimentos de controle podem ajudar a estabelecer um pipeline para o uso de ferramentas optogenéticas em embriões de peixe-zebra. Essas estratégias fornecem uma plataforma poderosa para investigar os papéis da sinalização no desenvolvimento, saúde e fisiologia.

Signaling pathways allow cells to respond to their environment and coordinate activities at tissue- and organism-wide scales. Signals crucial for embryonic development include the TGF-beta superfamily members&#160;bone morphogenetic protein (BMP)&#160;and Nodal1,2,3. During embryogenesis, the pathways regulated by these signals and others pattern the body plan by controlling gene expression and additional processes to ensure that diverse tissues and organs develop and interface properly. Pathologies, including birth defects and cancer, can occur when signaling or responses to signaling are perturbed4,5,6,7. Despite&#160;rigorous investigation into signaling, much more remains to be discovered about how levels and dynamics are decoded in a variety of contexts8,9,10,11, especially during development12,13,14,15,16,17,18,19.
To understand how signaling is decoded, an ideal experiment would be to manipulate signaling levels, timing, and/or dynamics-with a high degree of spatial and temporal control-and assess outcomes. For example, precise spatial signaling gradients are proposed to pattern developing tissues20,21. Altering signaling gradient spatial distributions would help test this hypothesis22. Additionally, the importance of signaling dynamics in generating diverse cellular responses is becoming clearer: The same signaling pathway can instruct cells to differentiate or proliferate depending on signaling frequency, for example9,23. Experimental paradigms in which signaling dynamics can be easily manipulated will be valuable to explore the relationship between dynamics and cell fate decisions8,12,13,14,15.
Historically, multiple methods have been used to manipulate signaling in developmental contexts, leading to fundamental discoveries1,2,3. Signaling can be blocked using pathway loss-of-function mutants, ectopic inhibitor expression, or antagonist drugs. Methods to activate signaling include agonist drugs, recombinant ligands, ectopic expression of ligands or constitutively active receptors, and pathway inhibitor loss-of-function mutants. These methods range along a continuum of experimental control. For example, mutants and ectopic expression may fall on the sledgehammer side of the continuum: With these approaches, dramatic, systemic changes in pathway activity may cause early death and preclude investigations at later stages, or over time may result in pleiotropic effects that are difficult to disentangle. Additionally, it is often challenging to independently manipulate one signaling feature at a time, such as level or duration. Toward the other end of the continuum, some methods offer more precise experimental control, such as microfluidic devices that expose samples to drugs or recombinant proteins with temporal and sometimes spatial control18,24,25, or genetic methods, including heat shock-inducible and tissue-specific promoters that can offer similar benefits16,26,27. However, these methods can be difficult to execute, may not be reversible, may have relatively slow kinetics or poor resolution, and may be unavailable in some model systems.
Molecular optogenetic approaches are a powerful addition to this toolkit. These approaches use proteins that respond to different light wavelengths to manipulate biological processes, including signaling8,12,13,14,15, and have been developed over decades for use in a variety of systems from cell culture to whole animals12,13,28. Compared to historical approaches, molecular optogenetics can often offer a higher degree of spatiotemporal control over biological processes: The controller in optogenetic systems is light, and control of light wavelength, intensity, duration, and exposure frequency is relatively straightforward. With sophisticated systems such as confocal and two-photon microscopes, spatial control in the subcellular range is possible29,30,31. Tools to optogenetically manipulate signaling have been developed and applied in several systems, including those described in Johnson et al.22, &#268;apek et al.32, Krishnamurthy et al.33, and Huang et al.34. For example, exploiting the spatial control afforded by optogenetics, this strategy was recently used to modify a signaling gradient in Drosophila embryos, demonstrating that fly embryogenesis is surprisingly robust to changes in this gradient22. The reversibility and fast on/off kinetics of optogenetic signaling activators have also made them attractive tools for investigating the decoding of signaling dynamics8,12,13,14,15,34,35,36.
The early zebrafish embryo is an in vivo system well-suited for optogenetic studies because it is externally fertilized, transparent, microscopy-friendly, and genetically tractable. Light exposure is easier to deliver to embryos that develop outside of the mother, light can penetrate and access their non-opaque tissues, live zebrafish embryos tolerate imaging well (in addition to being transparent), and existing genetic methods provide straightforward opportunities for knockdown and overexpression experiments, in addition to the development of useful transgenics37.
Recently, optogenetic tools were developed to activate BMP38 and Nodal39 signaling in zebrafish embryos with blue light exposure (Figure 1). We refer to these tools as bOpto-BMP and bOpto-Nodal (b for blue light-activated and Opto for optogenetic). bOpto-BMP/Nodal are based on similar pathway activation mechanisms. The binding of BMP or Nodal ligands to their respective receptor serine-threonine kinases drives receptor kinase domain interactions that lead to the phosphorylation of signaling effectors (Smad1/5/9 for BMP and Smad2/3 for Nodal). Phosphorylated signaling effectors then translocate to the nucleus and regulate target gene expression3 (Figure 1A,D). These receptor kinase interactions can be made light-responsive by coupling receptor kinases to light-responsive dimerizing proteins: With light exposure, these chimeric proteins should dimerize, causing the receptor kinase domains to interact and activate signaling (Figure 1B,C,E,F). Importantly, in contrast to endogenous receptors, bOpto-BMP/Nodal do not contain extracellular ligand-binding domains, ensuring ligand-independent activity (Figure 1C,F). This optogenetic activation strategy was first achieved with receptor tyrosine kinases40,41,42 and then applied to receptor serine-threonine kinases.
bOpto-BMP/Nodal use the blue light-responsive (~450 nm) homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain from the algae Vaucheria fridiga AUREO1 protein (VfLOV)43,44. These constructs consist of a membrane-targeting myristoylation motif followed by either BMP or Nodal receptor kinase domains, fused to a LOV domain (Figure 1B,E). Blue light exposure should cause LOV homodimerization, resulting in receptor kinase domain interactions that lead to respective Smad phosphorylation and pathway activation (Figure 1C,F). For bOpto-BMP, a combination of constructs with the type I receptor kinase domains from Acvr1l (also known as Alk8) and BMPR1aa (also known as Alk3) and the type II receptor kinase domain from BMPR2a was found to optimally activate signaling38 (Addgene #207614, #207615, and #207616). For bOpto-Nodal, a combination of constructs with the type I receptor kinase domain from Acvr1ba and the type II receptor kinase domain from Acvr2ba is used39.
bOpto-BMP/Nodal have been introduced into early zebrafish embryos by injecting mRNA at the one-cell stage, and used to investigate the role of signaling duration in Nodal interpretation39, to determine why zebrafish lose the ability to respond to Nodal45, and to examine how BMP target genes respond to different BMP signaling levels38. It is likely that these tools will continue to be useful in a diverse range of future investigations. However, the strength of optogenetic signaling activators is also their weakness: light-sensitive samples must be treated with care to avoid inadvertent ectopic signaling activity. Exposure to room light or sunlight can activate bOpto-BMP/Nodal.
This protocol provides practical suggestions for using mRNA-encoded LOV-based BMP and Nodal activators in early zebrafish embryos. It begins by detailing one strategy to build a light box to control uniform light exposure and temperature (Figure 2, Supplementary File 1, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4, Supplementary File 5, Supplementary File 6, Supplementary File 7, Supplementary File 8). It then describes two key control experiments that determine whether an optogenetic signaling activator is behaving as expected-i.e., activating pathway activity only when exposed to light (Figure 3). The first control assay involves examining phenotypes at one day post-fertilization in light-exposed and unexposed embryos (Figure 3A). mRNA-injected light-exposed embryos, but not unexposed embryos, should phenocopy BMP or Nodal overexpression (Figure 4A,B; BMP phenotypes in particular are clearly distinguishable at this time point46). This assay provides a fast activity readout. In the second control assay, to determine whether phenotypes are caused specifically by excess BMP or Nodal signaling and to directly observe the change in signaling levels, immunofluorescence staining is used to detect phosphorylated signaling effectors (pSmad1/5/9 or pSmad2/3, respectively) after a 20 min light exposure around late blastula / early gastrulation stage, when signaling activity has been well described12,16,17,47,48,49,50 (Figure 3B and Figure 4C). (Note that, although spatially localized activation has been demonstrated for both bOpto-BMP38 and bOpto-Nodal39, this protocol only describes uniform light exposure and signaling activation strategies.) It is advisable to execute these control experiments prior to applying bOpto-BMP/Nodal to specific research questions in order to determine ideal local experimental conditions.

Autor em destaque: Manipulando a sinalização em embriões de peixe-zebra para decodificar decisões de destino celular 

Ativação da Sinalização Optogenética em Embriões de Zebrafish

To establish the embryo's body plan during development cells are thought to decode signaling intensities dynamics and combinations. We are using optogenetics to manipulate these signaling features in zebrafish embryos. This approach will help us understand how embryonic cells decode signaling to make some of the earliest sulfate decisions The optogenetic approaches discussed here use light as a remote control to activate BMP or nodal signaling rapidly and reversibly.Because light exposure is easy to direct, these approaches can offer improved experimental control over signaling. Our protocol introduces using these light sensitive tools in zebrafish embryos. With this improved temporal and spatial control, it should now be possible to perform precise signaling modifications during zebrafish developments.We expect this to deepen our understanding of how cells decode signaling to make faint decisions, which will help reveal how the embryonic body plan develops.

O objetivo dos dois experimentos de controle aqui descritos é determinar se o bOpto-BMP/Nodal ativa suas respectivas vias em resposta à exposição à luz azul sem afetar a sinalização na ausência de luz, como esperado. Use esses controles para estabelecer o fluxo de trabalho experimental apropriado em seu laboratório antes de aplicar o bOpto-BMP/Nodal às suas perguntas de pesquisa de interesse.
O ensaio de fenotipagem pode ser concluído em apenas 2 dias e fornece uma indicação útil de atividade de sinalização e fototoxicidade (Figura 3A). Embriões injetados expostos à luz azul devem fenocopiar o excesso de sinalização de BMP (ventralização46; Figura 4A, painel esquerdo) ou sinalização nodal (defeitos de desenvolvimento relacionados ao mesendoderma extra-1,3,47,57,58,59,60 (Figura 4A, painel direito)). Se injetados, os embriões expostos à luz são afentípicos, testam a qualidade do RNAm e consideram injetar mais, e verificam novamente a estratégia de exposição à luz para garantir a exposição constante à luz brilhante (~450 nm de luz com uma irradiância de 45 W/m2 deve ativar fortemente a sinalização). Em contraste, embriões injetados e não expostos devem parecer idênticos aos irmãos não injetados. Se injetados, os embriões não expostos exibem fenótipos, reduzem a quantidade de RNAm injetado e reavaliam a configuração experimental para garantir que os embriões não expostos sejam protegidos da exposição à luz. Os dados mostrados na Figura 4B mostram os resultados de experimentos típicos de fenotipagem com quantidades e condições de exposição apropriadas de RNAm: forte atividade de sinalização é evidente em embriões injetados expostos à luz, com apenas uma pequena fração de embriões injetados e não expostos exibindo fenótipos.
O ensaio de fenotipagem também oferece uma oportunidade para avaliar a fototoxicidade. Se a fototoxicidade for negligenciável, os embriões não injectados e expostos à luz devem parecer do tipo selvagem, semelhantes aos embriões não injectados e não expostos. Se embriões não injetados expostos à luz tiverem defeitos, mas não embriões não injetados e não expostos, considere diminuir a irradiância da luz. Uma irradiância de 45 W/m2 ativa robustamente a sinalização sem fototoxicidade óbvia. Os dados apresentados na Figura 4B não mostram diferenças preocupantes entre embriões não injetados, expostos à luz e não injetados, não expostos, indicando fototoxicidade desprezível.
Embora os ensaios de imunofluorescência exijam mais tempo e esforço (~1 semana) em comparação com o ensaio de fenotipagem (2 dias), a coloração de imunofluorescência fornece uma leitura direta da atividade da via de sinalização e pode revelar alterações sutis de sinalização que podem não ser refletidas pela morfologia macroscópica. A imunofluorescência é especialmente importante para avaliar as respostas ao bOpto-Nodal, pois o excesso de sinalização nodal frequentemente resulta em lise de embriões por 1 dpf - o que pode ter várias causas - em contraste com os fenótipos específicos de ventralização característicos do excesso de sinalização BMP46 (Figura 4A). Embriões injetados expostos à luz azul devem exibir um aumento uniforme na fosforilação de Smad1/5/9 ou Smad2/3 em comparação com embriões não injetados expostos à luz. Se os níveis não forem aumentados, ou apenas fracamente aumentados, teste a qualidade do mRNA e considere injetar mais, e verifique novamente a estratégia de exposição à luz. Uma exposição de 20 min à luz azul com uma irradiância de 45 W/m2 em torno de 40% de epibólio deve ativar fortemente a sinalização. Se a coloração pSmad não for uniforme, tente injetar mRNA no centro da célula (em vez da gema), o que pode resultar em uma distribuição de mRNA mais uniforme.
Embriões injetados e não expostos devem ter níveis de pSmad comparáveis aos embriões não injetados. Curiosamente, observamos fosforilação de Smad mais vazada com bOpto-Nodal do que com bOpto-BMP. Se os níveis de pSmad forem aumentados em embriões injetados e não expostos, reduza a quantidade de mRNA injetada. Além disso, reavalie a configuração experimental para garantir que 1) embriões não expostos não sejam inadvertidamente expostos à luz e 2) a exposição à luz durante a fixação seja mínima. Durante a etapa de fixação, é fundamental permitir que não transcorram mais do que 45 s entre a remoção da caixa de luz e a imersão em formaldeído. Além disso, durante essa etapa, minimize a exposição à luz ambiente e à luz solar, fechando persianas, desligando fontes de luz branca, usando luzes vermelhas ou cobrindo fontes de luz branca com papel de filtro de gel bloqueador de luz azul (Tabela de Materiais).
Os dados da Figura 4C mostram os resultados de experimentos típicos de coloração por imunofluorescência com quantidades adequadas de RNAm e condições de exposição à luz: os níveis de pSmad são semelhantes em embriões não injetados e não expostos, enquanto embriões injetados expostos à luz exibem níveis mais altos de fosforilação de Smad.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig01.jpg"> Figura 1: Estratégia de ativação da sinalização bOpto-BMP e -Nodal . (A) A via de sinalização endógena das BMPs é ativada pela ligação dos ligantes BMP, levando à formação de um complexo receptor tipo I/II, fosforilação de Smad1/5/9 e expressão de genes-alvo de BMP. Os receptores tipo I BMPR1aa e Acvr1l também são conhecidos como Alk3 e Alk8, respectivamente. BMPR2a é um receptor tipo II. (B) construtos bOpto-BMP38. Domínios putativos de quinase de BMPR1aa e Acvr1l são fundidos com LOV; a fusão BMPR2a-LOV contém o suposto domínio da quinase e o domínio do receptor C-terminal (CTD). Todas as fusões são direcionadas à membrana com um motivo de miristoilação (Myr). Os domínios são separados por ligantes glicina-serina (GS). As construções são marcadas no CTD com uma etiqueta de epítopo HA. Essa combinação de três construtos foi encontrada para ativar de forma otimizada a sinalização BMP. (C) ativação da sinalização BMP mediada por bOpto-BMP. Quando expostos à luz azul, os domínios LOV dimerizam-se, o que é pensado para desencadear a formação de complexos e ativação de sinalização. (D) A via de sinalização nodal endógena é ativada pela ligação do ligante nodal, levando à formação de um complexo receptor tipo I/II, fosforilação de Smad2/3 e expressão de genes-alvo nodais. O receptor tipo I Acvr1ba e o receptor tipo II Acvr2ba também são conhecidos como Acvr1b e Acvr2b, respectivamente. (E) construções bOpto-Nodal39. Domínios putativos quinases de Acvr1ba e Acvr2ba são fundidos com LOV. Todas as fusões são direcionadas à membrana com um motivo de miristoilação (Myr). Os domínios são separados por vinculadores GS. As construções são marcadas no CTD com uma etiqueta de epítopo HA. (F) ativação da sinalização nodal mediada por bOpto-Nodal. Quando expostos à luz azul, os domínios LOV dimerizam-se, o que é pensado para desencadear a formação de complexos e ativação de sinalização. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig02.jpg"> Figura 2: Caixa de luz com temperatura controlada para experimentos optogenéticos . (A) Um iluminador de microplaca LED é montado na parte superior de uma incubadora usando um suporte LED personalizado. Embriões de peixe-zebra em uma placa de 6 poços na primeira prateleira são expostos à luz através de um orifício perfurado no topo da incubadora. A prateleira inferior contém um segundo conjunto de embriões de controle não expostos em uma placa de 6 poços envolta em folha de alumínio. A porta da incubadora é forrada com proteção contra intempéries para evitar a exposição inadvertida à luz ambiente ou à luz solar. (B) Detalhe do procedimento para criar um furo na incubadora usando uma broca step. O modelo de incubadora utilizado aqui possui um painel interno que exigia a perfuração de um segundo furo maior (Tabela de Materiais). (C) Detalhe do suporte LED personalizado projetado para um sistema de iluminação de três comprimentos de onda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig03.jpg"> Figura 3: Fluxo de trabalho do experimento bOpto-BMP/Nodal. Ensaio fenotípico e coloração de imunofluorescência pSmad para testar a atividade do bOpto-BMP/Nodal. Os embriões são injetados com mRNA no estágio de uma célula e transferidos para uma caixa de luz no máximo 1,5 h após a fertilização (hpf). (A) Ensaio fenotípico. Embriões injetados e irmãos não injetados são criados no escuro ou expostos à luz azul uniforme a partir de 1,5 hpf até 1 dia pós-fertilização (dpf). A atividade de sinalização optogenética pode ser avaliada pontuando embriões para fenótipos consistentes com excesso de atividade da via. (B) coloração por imunofluorescência pSmad. Embriões injetados e irmãos não injetados são criados no escuro até 40% epibolia (~6 hpf). Metade dos embriões injetados e metade dos embriões não injetados são então expostos à luz azul uniforme por 20 min. Após a exposição, todos os embriões são fixados e submetidos à coloração de imunofluorescência para pSmad. Níveis elevados de pSmad1/5/9 ou pSmad2/3 refletem ativação optogenética da sinalização BMP ou Nodal, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig04.jpg"> Figura 4: Avaliação das respostas de sinalização ativada pela luz em embriões de peixe-zebra. Embriões de zebrafish foram injetados no estágio unicelular com RNAm codificando bOpto-BMP/Nodal. (A) Os embriões foram criados no escuro ou expostos à luz azul uniforme a partir de 1,5 h após a fecundação (hpf). Os fenótipos foram pontuados no 1º dia pós-fertilização (dpf). Fenótipos representativos são mostrados. O excesso de sinalização BMP leva à ventralização (painel esquerdo), enquanto o excesso de sinalização nodal causa defeitos de desenvolvimento associados ao mesendoderma extra (painel direito). Barra de escala = 500 μm. (B) Quantificação do fenótipo. Embriões injetados e irmãos não injetados foram criados no escuro a partir de 1,5 hpf (bulbo preto). Metade dos embriões injetados e metade dos não injetados foram expostos à luz azul uniforme (bulbo azul). (C) Embriões injetados e irmãos não injetados foram criados no escuro a partir de 1,5 hpf (bulbo preto). A 40% de epibolia (~6 hpf), metade dos embriões injetados e metade dos não injetados foram expostos à luz azul uniforme (lâmpada azul). Após 20 min, todos os embriões foram fixados e submetidos à coloração de imunofluorescência para Smad1/5/9 fosforilado ou Smad2/3. Intensidades de pSmad mais altas indicam aumento da sinalização BMP/Nodal, respectivamente. Barra de escala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo Suplementar 1: Montagem completa da caixa de luz. Arquivo PDF 3D mostrando uma visualização 3D do conjunto completo da caixa de luz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_1_Light_box_full_assembly_2023-08-15.PDF" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo suplementar 2: Caixa de luz explodiu vista. Arquivo PDF 3D mostrando uma visão 3D do conjunto da caixa de luz explodida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_2_Light_box_exploded_view_2023-08-15.PDF" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 3: Grande junta leve. Arquivo de desenho CAD (. DWG) para fabricar a grande junta de luz para o suporte de LED usando um cortador a laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_3_Large_light_gasket_2023-08-15.DWG" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 4: Junta leve pequena. Arquivo de desenho CAD (. DWG) para fabricar a pequena junta de luz para o suporte LED usando um cortador a laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_4_Small_light_gasket_2023-08-15.DWG" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 5: Base de plataforma acrílica. Arquivo de desenho CAD (. DWG) para fabricar a base da plataforma acrílica do suporte LED usando um cortador a laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_5_Acrylic_platform_base_2023-08-15.DWG" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 6: Plataforma de acrílico vertical. Arquivo de desenho CAD (. DWG) para fabricar a plataforma de acrílico do suporte de LED vertical usando um cortador a laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_6_Acrylic_platform_vertical_2023-08-15.DWG" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 7: Suporte de acrílico esquerdo. Arquivo de desenho CAD (. DWG) para fabricar o suporte esquerdo de acrílico do suporte LED usando um cortador a laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_7_Acrylic_support_left_2023-08-15.DWG" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 8: Direito de suporte acrílico. Arquivo de desenho CAD (. DWG) para fabricar o suporte direito de acrílico do suporte LED usando um cortador a laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_8_Acrylic_support_right_2023-08-15.DWG" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Manipulating Signaling in Zebrafish Embryos to Decode Cell Fate Decisions at JoVE.com

A manipulação optogenética de vias de sinalização pode ser uma estratégia poderosa para investigar como a sinalização é decodificada no desenvolvimento, regeneração, homeostase e doença. Este protocolo fornece diretrizes práticas para o uso de ativadores de sinalização nodal e proteína morfogênica óssea (BMP) baseados em luz-oxigênio-voltagem no embrião inicial do peixe-zebra.

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Para estabelecer o plano do corpo do embrião durante o desenvolvimento, acredita-se que as células decodificem intensidades de sinalização, dinâmicas e combinações. Estamos usando optogenética para manipular essas características de sinalização em embriões de peixe-zebra. Esta abordagem nos ajudará a entender como as células embrionárias decodificam a sinalização para tomar algumas das primeiras decisões de sulfato As abordagens optogenéticas discutidas aqui usam a luz como um controle remoto para ativar a BMP ou sinalização nodal de forma rápida e reversível.Como a exposição à luz é fácil de direcionar, essas abordagens podem oferecer melhor controle experimental sobre a sinalização. Nosso protocolo introduz o uso dessas ferramentas sensíveis à luz em embriões de peixe-zebra. Com este melhor controle temporal e espacial, agora deve ser possível realizar modificações precisas na sinalização durante o desenvolvimento do peixe-zebra.Esperamos que isso aprofunde nossa compreensão de como as células decodificam a sinalização para tomar decisões tênues, o que ajudará a revelar como o plano do corpo embrionário se desenvolve.

optogenetic-signaling-activation-in-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

1.5K visualizações.  NIH. Para estabelecer o plano do corpo do embrião durante o desenvolvimento, acredita-se que as células decodificem intensidades de sinalização, dinâmicas e combinações. Estamos usando optogenética para manipular essas características de sinalização em embriões de peixe-zebra. Esta abordagem nos ajudará a entender como as células embrionárias decodificam a sinalização para tomar algumas das primeiras decisões de sulfato As abordagens optogenéticas discutidas aqui usam a luz como...

Vídeo: Autor em destaque: Manipulando a sinalização em embriões de peixe-zebra para decodificar decisões de destino celular 

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally manipulate signaling are required to understand how signaling is interpreted in these wide-ranging contexts. Molecular optogenetic&#160;tools can provide reversible, tunable manipulations of signaling pathway activity with a high degree of spatiotemporal control and have been applied in vitro, ex vivo, and in vivo. These tools couple light-responsive protein domains, such as the blue light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain, with signaling effectors to confer light-dependent experimental control over signaling. This protocol provides practical guidelines for using the LOV-based bone morphogenetic protein (BMP) and Nodal signaling activators bOpto-BMP and bOpto-Nodal in the optically accessible early zebrafish embryo. It describes two control experiments: A quick phenotype assay to determine appropriate experimental conditions, and an immunofluorescence assay to directly assess signaling. Together, these control experiments can help establish a pipeline for using optogenetic tools in early zebrafish embryos. These strategies provide a powerful platform to investigate the roles of signaling in development, health, and physiology.

Optogenetic manipulation of signaling pathways can be a powerful strategy to investigate how signaling is decoded in development, regeneration, homeostasis, and disease. This protocol provides practical guidelines for using light-oxygen-voltage sensing domain-based Nodal and bone morphogenic protein (BMP) signaling activators in the early zebrafish embryo.

Biologia do Desenvolvimento

Injecting bOpto-BMP&#47;Nodal Constructs into Zebrafish Embryos 

Injecting bOpto-BMP/Nodal Constructs into Zebrafish Embryos   

To begin, use an incubator and an LED Microplate Illuminator to create a light box for controlling light exposure and temperature. Then, position a six well plate on the upper shelf of the incubator, and check whether the light beam evenly encompasses it. Use a sheet of paper to visualize the distribution of light coverage.Use a light meter to measure irradiance and spatial uniformity. At least one day before injections, make injection dishes and agarose-coated six well plates. Rinse an injection dish mold with embryo medium, and place gently onto molt and agarose.Once the agarose has solidified, delicately use the tab to remove the mold. Next, prepare flamed glass pipettes for immunofluorescence experiments on dechlorinated embryos. Place the end of a glass pipette into a bun and burner flame, and rotate continuously until the edges become smooth.Prepare an injection mix using the mRNAs shown here. For the phenotyping assay, introduce the needle through the corion directly into the center of the cell at the one cell stage, and inject one nanoliter of the injection mix. If conducting an immunofluorescence assay, target the center of the cell of coated embryos at the one cell stage.For both assays, prepare enough embryos for the unexposed non-injected, unexposed injected, exposed non-injected, and exposed injected embryos. Select at least 30 embryos per condition. For the immunofluorescence assay, prepare an additional dish containing non-injected embryos as a proxy to assess the progression of developmental stages.After injection, incubate the embryos in Petri dishes at 28 degrees Celsius.

Injetando bOpto-BMP/Nodal Constructs em Embriões de Zebrafish 

Light Exposure Experiment to Activate BMP or Nodal Signaling in Zebrafish

To begin, incubate the injected zebrafish embryos at 28 degrees Celsius. Around 1.5 HPF at the four to 16 cell stage, remove unfertilized and unhealthy embryos. For the phenotyping assay, wrap the unexposed control plate with noninjected and injected embryos in aluminum foil.Position the foil covered plate on the lower shelf, and the exposed plate on the upper shelf of the 28 degrees Celsius light box. After confirming that the dish cover is in place, activate the blue light, and shut the light box door to prevent unintended room light exposure. For the immunofluorescence assay around 1.5 HPF, individually wrap the exposed and unexposed dishes in aluminum foil while keeping the proxy dish unwrapped.Put all the dishes in the 28 degrees Celsius light box without activating the LED. Close the light box door to prevent inadvertent exposure to room light. At approximately five HPF, use a dissecting scope to evaluate the developmental stage of the proxy embryos.Also remove the wrapped dishes to ensure uniform temperature exposure across all dishes. Once the proxy embryos reach 40%epiboly, uncover the exposed dish and place it on the upper shelf of the light box. Keep the unexposed dish covered on the lower shelf.Immediately activate the blue light, close the door, and set a timer for 20 minutes. To prepare for fixation, eliminate as much room light as possible. Just before fixation, take tubes containing 4%formaldehyde from four degrees Celsius and position them beside the light box.After 20 minutes, open the door of the light box and remove the dish that wasn't exposed to light. Use a flamed glass pipette tip to remove the light sensitive embryos from the dish. Then to immerse the embryos in 4%formaldehyde, submerge the flamed glass pipette tip in the formaldehyde, and allow the embryos to sink into the liquid.Store fixed embryos at four degrees Celsius overnight.

Experimento de Exposição à Luz para Ativar BMP ou Sinalização Nodal em Zebrafish

Evaluation of bOpto-BMP&#47;Nodal Expressing Embryos After the Light Exposure Experiment

Evaluation of bOpto-BMP/Nodal Expressing Embryos After the Light Exposure Experiment  

For the phenotyping assay, perform the light exposure experiment on bOpto-BMP bOpto-Nodal expressing zebrafish embryos, and remove them from the light box at one day post-fertilization between 24 to 32 HPF. Using a dissecting scope, evaluate phenotypes and establish a scoring rubric. Assess embryos while they remain within the chorion for convenience.Utilize a pipette to probe to reposition embryos for viewing from different angles. For the immunofluorescence assay, after incubating embryos in 4%formaldehyde at four degrees Celsius overnight, remove the formaldehyde and rinse them three to five times with PBST. Discard the PBST and add 100%methanol.Seal the tubes and gently invert them to mix residual PBST and methanol. After washing the embryos two more times with methanol, store them at minus 20 degrees Celsius for at least two hours up to several years. Using a microscope equipped for optical sectioning, capture images of immunostained embryos.Immunofluorescent staining experiments with appropriate mRNA amounts and light exposure conditions showed that the pSmad levels were similar and non-injected in unexposed embryos, whereas injected light exposed embryos exhibited higher levels of Smad phosphorylation.