Sacaribacterias são parasitas obrigatórios que requerem co-cultura com bactérias hospedeiras apropriadas. Como sacaribacterias orais humanas podem ser facilmente isoladas para a maioria dos indivíduos usando espécies bacterianas hospedeiras conhecidas. Este protocolo permitirá que qualquer investigador ou laboratório isole suas próprias cepas na cocultura binária.
Esta técnica utiliza dispositivos e equipamentos simples presentes na maioria dos laboratórios microbiológicos e tem sido usada com sucesso para cultivar mais de 30 isolados representando seis espécies de sacaricidades. Este protocolo pode ser útil para o isolamento de outras espécies de radiação seguidas por candidatos, bem como sacaribactérias de diferentes ambientes e outros mamíferos, se os hospedeiros actinobacterianos apropriados puderem ser identificados e isolados. Demonstrando o procedimento estará Andrew Collins, um ex-pós-doutorando do meu laboratório.
Para começar, inicie culturas de bactérias hospedeiras, como a aracnia propionica, com tempo suficiente para que elas cresçam até a fase estacionária precoce. Para iniciar a cultura, inocular de dois a cinco mililitros de caldo de soja tripptic contendo extrato de levedura de 0,1% com propionica de aracnia, e incuba-lo a 37 graus Celsius por 24 horas. Em seguida, monte os suportes do filtro com membranas de filtro de 0,2 micrômetros gravadas.
Enrole-os em papel alumínio e esterilize por autoclaving, juntamente com tubos de centrífugas e conjuntos de tampas. Esterilize suprimentos extras em caso de contato acidental com superfícies não estéreis. Colete placa dentária raspando ao longo da linha de goma, usando um ponto de papel estéril, curette graciosa ou uma ponta de palito ou pipeta estéril, e transfira-a para um tampão adequado, como MRD ou PBS.
Mantenha a amostra no gelo até que esteja pronto para continuar. Resuspend a placa dentária vigorosamente usando uma combinação de vórtice e pipetação com uma pequena ponta de pipeta, em seguida, adicione a amostra de placa resuspended a um tubo contendo nove mililitros de buffer MRD. Desembrulhe cuidadosamente um conjunto de filtro estéril usando técnica asséptica.
Desembrulhar uma volta de quarto e apertar o suporte do filtro para garantir que os fios estejam bem engatilhados e que o aparelho esteja devidamente fechado. Lave a membrana passando 10 mililitros de tampão MRD através do aparelho, usando uma seringa. Para aplicar a amostra no filtro lavado, remova o êmbolo de uma seringa e conecte-a ao aparelho do filtro.
Coloque um tubo de centrífuga estéril sob o aparelho do filtro para pegar o filtrado, em seguida, despeje a amostra dentária dispersa na seringa e carregue-a no filtro. Em seguida, aplique pressão leve no êmbolo para empurrar a amostra através do filtro. Lave a membrana com mais 10 mililitros de tampão MRD e colete o fluxo através do mesmo tubo da amostra filtrada.
Em seguida, tampar o tubo asepticamente, e manter no gelo. Faça uma marca de orientação no tubo e na tampa para identificar a localização da pelota celular após a centrifugação. Coloque o tubo em uma centrífuga de alta velocidade com a marca na parte superior e centrifugar as amostras a 60.000 G por uma hora a quatro graus Celsius.
Após a centrifugação, despeje cuidadosamente o sobrenante, mantendo a pelota na parte superior do tubo. Em seguida, resuspense a pelota em um a dois mililitros de buffer MRD, vigorosamente vórtice. Prepare tubos de cultura aliquoting dois mililitros de mídia de crescimento apropriada para os tubos.
Em seguida, adicione 200 microliters de cultura noturna de organismos hospedeiros e 100 a 200 microliters de amostra filtrada resuspended a cada tubo. Incubar as amostras combinadas em condições apropriadas para o organismo hospedeiro. Transfira as células a cada dois ou três dias transferindo 200 microliters da cultura binária para dois mililitros de meio de crescimento fresco em um novo tubo.
Se as culturas passagens não mostram crescimento em 200 microliters de cultura hospedeira não infectada, ao passar as células, retornem tubos inoculados para a incubadora. Alíquota de 24 microliters do pcr master mix em um tubo PCR de 0,2 mililitro. Em um microliter de cultura infectada por sacaribacteria, coloque o tubo em um ciclo de thermo.
Defina o programa PCR conforme descrito no manuscrito do texto. Carregue e execute os produtos PCR em um gel 1%Agros. Uma banda de aproximadamente 600 bases confirmará a presença de sacaribactérias.
Para confirmar a pureza das culturas positivas, realize uma diluição serial de 10 vezes a co-cultura de sacaribacterias em um tampão estéril, e espalhe 100 microliters em uma placa de ágar. Incubar a cultura em condições adequadas de crescimento e observar para contaminar organismos. Uma banda de aproximadamente 600 bases confirmará a presença de sacaribactérias.
A detecção de PCR pode parecer negativa nas culturas iniciais de infecção devido a um baixo número de símbionts de sacaribactérias. No entanto, após algumas passagens, um produto PCR forte deve aparecer, indicando que ocorreu uma infecção estável. Testar várias espécies hospedeiros com o mesmo filtrado de sacaribacteria geralmente terá uma baixa taxa de sucesso.
Como a interação do host simbionte é muito específica. À medida que as culturas infectadas crescem, o crescimento normal do turvo deve aparecer. À medida que a simbiose se estabelece, as culturas infectadas aparecerão menos turvas do que culturas de organismos hospedeiros não infectados.
Uma cultura contaminada pode ser purificada escolhendo colônias infectadas após o revestimento. Colônias infectadas às vezes podem ser identificadas por uma forma irregular de colônia em comparação com colônias não infectadas. A proporção de colônias regulares depende do título de sacaribacterias na cultura binária.
Se o título for baixo, menos colônias parecerão irregulares, facilitando a escolha das colônias infectadas e iniciar uma cultura binária pura. Culturas podem não parecer positivas para várias passagens. Então alguns pacientes serão necessários.
Também é necessário verificar regularmente a contaminação das culturas binárias, pois isso pode desestabilizar a cultura e levar à morte das sacarictérias. A cultura binária pode ser usada para todos os tipos de experimentos de laboratório. DNA e RNA podem ser extraídos para sequenciamento de genoma e análise de transcriptome, respectivamente.
A patogenicidade também pode ser investigada usando modelos animais.
