We would like to thank Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui, and Collin R. Berry. This work was supported by NIH NIDCR grants R01DE016124, R01DE018039, and R01DE023304 to J.P. Lewis.
Microscopy was performed at the VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility, supported, in part, with funding from NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).

Os seguintes protocolos vai descrever métodos para a cultura e estudar a invasão pelas espécies anaeróbicas, P. gingivalis; No entanto, estes protocolos podem ser utilizados para uma série de agentes patogénicos anaeróbios. Embora HUVECs são usados, este protocolo pode ser usado para outras células eucarióticas tanto imunes e não-imunes. 1. Anaerobic Chamber Uso e Manutenção Nota: P. gingivalis é um anaeróbio sensível aos níveis normais de oxigénio encontradas no ar ambiente. Um ambiente anaeróbio controlado é vital para o cultivo de P. gingivalis. <ol><li> Aqui, manter uma atmosfera artificial designado como gás anaeróbico misto (80% de N2, 10% de H 2, 10% de CO 2) numa câmara anaeróbia de vinilo (Figura 1A). Usar uma câmara de vácuo (Figura 1B) para a transferência de itens a partir do ambiente de laboratório para a câmara de anaerobiose. A câmara de compressão opera manualmente, twpurga de gelo com gás N2 antes de introduzir o gás anaeróbico misto. </li><li> Utilizar uma coluna de remoção de sulfureto de hidrogénio (Figura 1C) para a remoção livre de manutenção do sulfureto de hidrogénio indesejável. Coloque um desumidificador dentro da câmara para remover H2O criada pelo catalisador e aerossóis para evitar que facilitam a propagação da contaminação. Nota: Sulfeto de hidrogênio é um subproduto metabólico natural de muitas bactérias anaeróbias e sua acumulação é tóxica para bactérias e pode resultar em danos à eletrônica e diminuir o tempo de vida de um catalisador. </li><li> Utilize uma caixa de ventilador fazer circular a atmosfera da câmara, através de um catalisador de paládio, que remove o oxigénio na presença de hidrogénio (Figura 1D). Nota: Uma recirculação atmosférica (HEPA) remove os contaminantes transportados pelo ar com um tamanho de 0,22 mm ou maior. </li><li> Cultura de bactérias anaeróbicas num banho a 37 ° C incubadora que está localizado dentro do anaeróbiocâmara. Use técnicas assépticas padrão quando se trabalha dentro da câmara anaeróbia. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig1.jpg" /> Figura 1. câmara anaeróbia de vinilo e os seus componentes. (A) uma câmara anaeróbica vinilo selado completamente a partir de oxigénio atmosférico proporciona espaço de trabalho para dois indivíduos de cada vez (32 em x 78 em). Ele contém uma incubadora ajustada a 37 ° C (de volta do meio). (B) Uma câmara de compressão é utilizado para a transferência de objectos a partir do ambiente de laboratório para a câmara de anaerobiose. Na foto é uma câmara automática operada através de um controlador que pode ser programado para executar automaticamente os procedimentos de vácuo e purga necessários para criar um ambiente anaeróbico. (C) A sulfeto de hidrogênio Coluna Remoção fornece remoção de alta capacidade livre de manutenção de sulfeto de hidrogênio indesejável. (D) Duas caixas de ventilador catalisador sãocolocado ao longo da câmara anaeróbica para ajudar a circular a atmosfera da câmara, através do catalisador paládio, o qual, na presença de hidrogénio, remove o oxigénio. A câmara anaeróbia é configurado de acordo com as instruções do fabricante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 2. Preparação de bactérias anaeróbicas Nota: P. gingivalis é aerotolerant e pode ser armazenado em condições aeróbias mas não crescerão na presença de oxigénio em níveis mais elevados do que 6% 17,18. Uma câmara de anaerobiose é necessária para o cultivo adequado de P. gingivalis e outras espécies anaeróbicas (Figura 1). Formação adequada e educação sobre o uso anaeróbio câmara é necessária antes de trabalhar com microanaerobes 19. <ol><li> Equilibrar todos os meios líquidos e placas para condit anaeróbioiões durante pelo menos 12 horas antes da experimentação para remover o oxigénio residual. </li><li> Transferir P. gingivalis de -80 ° C freezer para câmara anaeróbia, deixe descongelar. </li><li> Streak P. gingivalis em placas de ágar sangue de tripticase de soja (TSA II com 5% de sangue de carneiro). Enrole placas em parafilme e armazenar a 37 ° C numa incubadora anaeróbica durante 4-7 dias. </li><li> Inocular P. gingivalis em 3 ml de infusão cérebro coração (BHI) suplementado com hemina e menadiona, um meio líquido enriquecido não selectivos para o isolamento e cultivo de anaeróbios e microorganismos exigentes, usando loops estéreis. Nota: Para armazenamento a longo prazo, misturar culturas bacterianas preparados em BHI com glicerol ou DMSO (concentração final de 10-20%) e colocar num congelador de -80 ° C. </li><li> Prepare uma cultura inicial de P. gingivalis, fazendo uma diluição de 1:10 e permitindo que as bactérias a crescer até fase mid-log. </li></ol> Nota: A densidade óptica da BACterial de suspensão é determinada e a concentração de bactérias para cada estirpe a ser examinada é ajustado. Para P. gingivalis uma suspensão a DO660 de 0,7 corresponde à fase mid-log e 7 x 10 ~ 8 células / ml. As condições de crescimento descritas no protocolo acima são específicos para P. gingivalis e pode precisar ser adaptado para outras estirpes bacterianas. 3. endotelial Cultura de Células Nota: Compra HUVEC reunidas primárias e cultura em meio basal contendo factores de crescimento endotelial vascular (VEGF), a 37 ° C em 5% de CO 2 de acordo com as instruções do fabricante. <ol><li> HUVECs de sementes em frascos T-75 em 2.5 x 10 5 células / balão em 15 ml de mídia VEGF. Nota: Verificar a viabilidade através de uma diluição de 1: 1 com 4,0% de azul de tripano. As células com uma membrana comprometida manterá azul de tripano, as células saudáveis ​​com membranas íntegras aparece branco quando visto sob uma luz microscópio binocular. Councélulas T 100, garantir que mais de 80% das células são viáveis ​​20. </li><li> Substituir mídia a cada 2 dias com a mídia VEGF fresco pré-aquecido até que as células chegar a ~ 80% de confluência. </li><li> Lave as células uma vez com PBS, pré-aquecido. Libertar células do frasco T75 por incubação com 2 ml de tripsina-EDTA (0,25%) durante 5 min seguido de solução de 2 ml de tripsina de neutralização. </li><li> Recolhe HUVEC suspensas num tubo cónico de 50 ml. Lavar as células extras a partir de frascos T-75 com PBS e transferir para tubos de 50 ml cônico. </li><li> Centrifugar células a 200 xg durante 10 min. </li><li> Remover o sobrenadante, suspende sedimento celular em 10 ml de meio de VEGF pré-aquecido. </li><li> Determinar a concentração de células utilizando um hemocitómetro ou dispositivo de contagem de células semelhantes. </li><li> Calcular quantidade de suspensão de células para adicionar a qualquer placa de 6 poços (400.000 / poço) ou placa de 12 poços com lamelas (50.000 / poço). HUVECs estará pronto para a experimentação no dia seguinte. </li></ol> 4. Survival ensaio de invasão / Interação(Chapeamento) Nota: Quando a realização deste ensaio, preparar duas placas de 6 poços de células endoteliais semeadas a 400.000 células / poço. Uma placa será usado para avaliar bactérias aderidas para e internalizadas pelas células hospedeiras. A outra placa serão responsáveis ​​por bactérias intracelulares. A placa de 6 poços permite triplicados de duas amostras para ser executado em um experimento. Para um esboço deste protocolo por favor consulte o fluxograma ensaio de sobrevivência (Figura 2). <ol><li> Prepare bactérias anaeróbicas, como descrito acima (ver secção 1) até atingirem crescimento mid-log (DO660 0,5-0,7). </li><li> Bactérias centrifugar a 5000 xg durante 10 min. Nota: Se centrífuga é câmara anaeróbia fora, transportar amostras bacterianas em um tubo de 15 ml hermeticamente fechado, enrole a tampa com parafilme para evitar o vazamento de oxigênio. </li><li> Coloque peletizada P. gingivalis de volta na câmara, elimine o sobrenadante. Lavar com PBS, as bactérias da pelota de novo antes de ressuspensão em VEGF-media. Preparar suspensões para todas as estirpes bacterianas a ser testado em OD 660 de 0,7 o que corresponde a fase mid-log (~ 7 x 10 8 culas / ml). As bactérias estão agora prontos para a infecção. </li><li> Transferência de placas de 6 poços contendo células HUVEC incubadora de cultura de tecidos a partir de dentro da câmara anaeróbia. Remova a mídia e lavar três vezes com PBS anaeróbio. Adicionar 2 ml de meio anaeróbio VEGF a cada poço e colocar as placas a 37 ° C na incubadora anaeróbica durante 20 minutos para equilibrar a temperatura durante a infecção. Nota: as bactérias da placa em placas de agar de sangue para garantir que as utilizadas para a infecção são homogêneas e não contaminada por infecção. </li><li> Infectar as células hospedeiras com as bactérias a uma multiplicidade de infecção (MOI: bactérias hospedeiras) de 100: 1. Nota: o número de células HUVEC é determinada através da realização de um teste de exclusão de tripano num único poço antes da infecção. O número de células bacterianas é determinada por meio da densidade óptica (por exemplo, OD de 0,5 x 10 5 = 8 células / mL). Bacterial concentração é ajustada para MOI adequado com base na concentração HUVECs 21. </li><li> Coloque placas de 6 poços com células HUVEC infectados na incubadora anaeróbica e permitir que as bactérias para interagir com as células hospedeiras durante 30 min. </li><li> Prepare saponina em BHI (1,0% w / v) dentro da câmara de anaerobiose e filtrar através de um filtro de 0,2 um. </li><li> A sobrevivência de ambas as bactérias aderidas e internalizadas. <ol><li> Retirar as placas do incubador, meios aspirado, lavar três vezes com PBS e anaeróbio adicionar 2 ml de filtrado de 1,0% de saponina (preparada tal como descrito no passo 4.8). Incubar durante 15 min para permitir a lise da célula hospedeira. </li><li> Raspe fundo de cada poço com raspador de células. Recolhe-se a mistura de células de cada poço e fazer uma diluição a 1: 1 em BHI. </li><li> Proceder para fazer diluições em série das amostras. Dependendo da espécie e da concentração bacteriana, ajustar as diluições em série. Comece com 1: 100 ou 1: 1.000 diluições. </li><li> Placa 200 ul de diluição desejada em placas de agar sangue. Envoltório tele placas em parafilme e lugar na incubadora anaeróbica a 37 ° C. </li><li> Na sequência de sete dias de incubação a 37 ° C, retire as placas e contagem de unidades formadoras de colónias (CFUs) usando uma caixa de luz para contar manualmente colônias. Nota: as UFC são enumerados. Para maiores quantidades de CFUs, as imagens podem ser tomadas e software de computador pode ser utilizado para facilitar a contagem de CFU. </li></ol></li><li> A sobrevivência das bactérias internalizadas. <ol><li> Retirar as placas do incubador. Lavar três vezes com PBS e anaeróbio adicionar 2 ml de VEGF meios suplementados com antibióticos (300 ug / ml de gentamicina e 400 ug / ml) de metronidazol. </li><li> Incubar durante 1 h. Certifique-se de testar os antibióticos assim que eles são 100% eficaz em matar a estirpe bacteriana desejada e certifique-se de que eles não penetram células do hospedeiro 22,23. </li><li> Aspirar a mídia, adicione 2 ml de filtrado 1,0% de saponina. Incubar durante 15 min para permitir a lise da célula hospedeira. </li><li> Raspe fundo de cada poçol com raspador de células. Recolhe-se a mistura de células de cada poço e fazer diluição 1: 1 em BHI. </li><li> Preparar diluições em série da amostra (1: 100, 1: 1000). </li><li> Placa 200 ul de diluição desejada em placas de agar sangue. Embrulhe em filme plástico e placas lugar na incubadora anaeróbica. </li><li> Depois de sete dias de incubação a 37 ° C, remover as placas e contagem de UFC. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig2.jpg" /> Figura 2. Representação esquemática de um protocolo usado para a sobrevivência de bactérias anaeróbias com células eucarióticas. Ambos os ensaios para a sobrevivência bacteriana total e sobrevivência de bactérias internalizadas pode ser realizada ao mesmo tempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 5. Interiorização de bactérias em Ce Anfitriãolls (Microscopia fluorescente) Nota: P. gingivalis é rotulado com 2 &#39;, 7&#39;-bis- (2-carboxietil) -5- (e-6) -Carboxyfluorescein, éster acetoximetílico (BCECF-AM). BCECF-AM é um corante não fluorescente membrana permeável; a sua conversão em BCECF fluoresceína através da acção de esterases intracelulares pode indicar a viabilidade celular. P. gingivalis é marcado com o corante BCECF-AM e então utilizado para infectar as células eucarióticas. Após a infecção, as células são fixadas e marcadas com DAPI e TRITC-faloidina. A mancha DAPI utilizado para corar o núcleo da célula eucariótica também irá rotular núcleo da célula bacteriana, que fornece uma contra-medida para identificar as bactérias não-viáveis ​​que podem não se apegam metabolicamente BCECF-AM. As células hospedeiras são realçadas com TRITC-phalloidin, um corante vermelho actina. <ol><li> Lamelas autoclave. Adicionar assepticamente lamelas para placas de 12 poços antes de semear as células endoteliais a 5 x 10 4 células / poço. (Preparado dia antes da experiência) </li><li&gt; têm células endoteliais preparadas em 18 mm de espessura (# 1.5) lamelas circulares em placas de 12 poços como descrito acima. </li><li> Prepare bactérias anaeróbias cultivadas até à fase semi-log (OD 660 = 0,5-0,7), conforme descrito na seção 1. </li><li> Lavar 2x com bactérias anaeróbias PBS por centrifugação a 5.000 xg e suspensão da pelota em PBS a 5-7 x 10 8 células / ml. </li><li> Adicionar 20 uL de 0,2 mM de BCECF-AM a 2 ml de suspensão bacteriana (5-7 x 10 8 culas / ml) para uma concentração final de BCECF-AM 2 uM de. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 30 min no escuro. </li><li> Placas de transferência com células endoteliais semeadas em 18 mm (# 1.5 espessura) lamelas circulares de cultura de tecidos incubadora na câmara anaeróbia. Lavar com PBS e intercâmbio com a mídia VEGF anaeróbia. Nota: Verifique se HUVECs são saudáveis ​​sob um microscópio de luz. HUVECS deve ser ~ 80% confluentes, morfologia devem ser comparáveis ​​aos fabricantes. </li><li> Centrífuga marcado bactérias na5.000 xg durante 10 min para remover o corante BCECF-AM residual. Suspender em 2 ml de mídia VEGF anaeróbia. </li><li> Infectar células hospedeiras com bactérias marcadas na MOI de 100: 1 (bactérias: host). </li><li> Incubar em câmara anaeróbica a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Após infecção de células de lavagem três vezes com PBS e fixar em recém-preparado 4,0% de paraformaldeído durante 10 min. Nota: Depois de consertar as células, experimento pode ser realizado fora da câmara de anaerobiose. </li><li> Lavar lamelas com PBS três vezes. </li><li> Adicionar 1 ml de 0,2% de Triton X-100 durante 10 min. </li><li> Lavar lamelas com PBS três vezes. </li><li> Adicionar 50 ul de TRITC-faloidina (50 ug / ml) para lamelas durante 45 min. </li><li> Wash lamelas três vezes, remover da placa de 12 poços e coloque em um slide com soft-set meio de montagem contendo DAPI. Selar os lados com unha polonês. Nota: As lâminas podem ser armazenadas por um par de meses no escuro. Evite a exposição à luz para evitar a foto-branqueamento. </li><li> Visualização de diapositivosutilizando um microscópio confocal. <ol><li> Aqui, use um sistema de 34 canais espectrais (detector de conjunto de 32 canais e dois detectores PMT lado, além de um detector de luz transmitida) configurado em torno de um AxioObserver (invertido) estar com um palco motorizado XY. O sistema tem cinco lasers de diodo: azul (405 nm), multi-line Argon (458, 488, 514 nm), diodo verde (561 nm), HeNe vermelho (633 nm) e um laser pulsado nm 440. Equipar um sistema de imagem Lifetime fluorescência com 2 detectores GaAsP híbridos (para FRET-FLIM). </li><li> Detectar a fluorescência a partir de DAPI e TRITC em um canal utilizando um filtro de banda dupla, com comprimentos de onda de excitação de 340-380 nm e 540-560 nm, e um filtro de emissão de 435-485 nm e 570-590 nm, respectivamente. Detectar a fluorescência de BCECF-AM, utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 440-500 nm e um filtro de emissão de 510-590 nm. Nota: Os controles para BCECF-AM deve ser feito em cada estirpe bacteriana sendo estudadas para garantir uma rotulagem adequada de bactérias viáveis. Em primeiro lugar validar que nonviable bactérias são DAPI-positivas e BCECF-negativo. Em segundo lugar, garantir que as bactérias vivas pode metabolizar BCECF-AM em fluoresceína BCECF. Concentrações variáveis ​​de as bactérias ou corante BCECF-AM podem precisar de ser testado para rotulagem óptima. </li></ol></li></ol>

Authors have nothing to disclose.

Todos os métodos acima podem ser utilizados para conceber ensaios específicas para avaliar a interacção de bactérias anaeróbicas com células eucarióticas. No entanto, há várias considerações para realizar com sucesso experiências. Primeiro são as estirpes microbianas para ser utilizados num estudo. É crucial para a comparação de duas estirpes com ambos o ensaio de sobrevivência, bem como por análise de microscopia de que eles estão em fases de crescimento semelhantes e at...

As bactérias anaeróbicas colonizar quase todas as superfícies do corpo humano. Embora predominante na flora do trato intestinal e genito-urinário, onde as concentrações de oxigênio são baixos, eles também existem em níveis elevados na pele, boca, nariz e garganta 1. As bactérias anaeróbicas são uma causa comum de infecções endógenas e frequentemente são isoladas de sítios doentes. No entanto, devido à sua natureza fastidiosa, anaeróbios podem ser difíceis de isolar e cultivar. Estudos envolvendo bactérias anaeróbias deve ser feito sob condições restritas. Técnicas anaeróbio-cultura moderna permitem aos pesquisadores para imitar as configurações anaeróbias necessárias para estudar muitas cepas laboratoriais anaeróbia ou mesmo isolados clínicos 2,3. Bactérias anaeróbicas patogénicas têm desenvolvido uma relação dinâmica e co-evolução com as células hospedeiras em que residem. A maioria dos anaeróbios são susceptíveis à morte pela resposta imunitária do hospedeiro antes de atingir infectiníveis OUs. No entanto, algumas bactérias patogénicas desenvolveram mecanismos para escapar ou subverter a resposta imune do hospedeiro. Eles alcançar este objetivo através de mecanismos como a evasão de reconhecimento imunológico, neutralização de mediadores do sistema imunológico, alteração de imunidade mediada por células, invasão de células hospedeiras, e alteração da imunológico sinalizando 4. Porphyromonas gingivalis, uma bactéria anaeróbia Gram-negativo implicado em ambos oral e doenças extra-orais, é um exemplo de um agente patogénico bacteriano altamente adaptado capaz de causar alterações patogénicas no hospedeiro 5-7. Bolsões de biofilme placa acumulado em fendas profundas formadas entre os dentes e tecido da mucosa gengival pode abrigar bactérias anaeróbias que são protegidos de oxigênio atmosférico 8. Estas bolsas periodontais servir como um nicho para vários patógenos anaeróbicos, como P. gingivalis 9. P. gingivalis é um agente patogénico da distorção que é capaz de remodelaçãoing a comunidade microbiana oral, de forma a promover o desenvolvimento e progressão de doenças periodontais 10. Ela produz um grande número de fatores de virulência que são ativos contra um amplo espectro de proteínas do hospedeiro e fornece mecanismos para a evasão de defesas do hospedeiro 11. É também capaz de invadir epiteliais, endoteliais, fibroblastos e células do ligamento periodontal in vitro e in vivo 12-14 15. Por eficazmente invadir as células hospedeiras, P. gingivalis pode escapar imunidade do hospedeiro. Invasão efectiva de células hospedeiras não só permite que a bactéria de escapar defesas do hospedeiro, mas também serve como um reservatório para o futuro re-infecção, bem como a célula hospedeira altera. São necessários estudos dos mecanismos moleculares envolvidos na adesão e internalização da bactéria por células hospedeiras. Pesquisa em vários laboratórios está focada na compreensão dos eventos moleculares associados com a internalização de P. gingivalis pelas células hospedeirasbem como os mecanismos utilizados para suprimir e sequestrar a resposta imune e sobreviver a mecanismos de defesa do hospedeiro hostis. Existem muitos ensaios capazes de identificar e caracterizar agentes patogénicos que são capazes de invadir as células hospedeiras. No entanto, estudos in vitro com agentes patogénicos anaeróbios apresentam muitos problemas experimentais para o investigador, principalmente porque é difícil realizar estudos que dependem de instrumentos volumosos, na ausência de oxigénio. Esta situação é agravada pelo fato de que as células eucarióticas necessitam de oxigênio para crescer e, portanto, deve ser preparado separadamente em incubadoras de cultura de tecidos. Uma maneira de evitar tais obstáculos seria realizar os estudos sob o oxigénio atmosférico, mas que iria tornar o crescimento de bactérias anaeróbicas impossível. Outro método seria a utilização de bactérias mortas por calor para infectar e estudar interacções célula-hospedeiro. No entanto, existem diferenças entre as bactérias mortas pelo calor e viáveis ​​que diminuem a relevância do interacti patógeno-hospedeirono dia 16. Ele é central para estudar bactérias viáveis ​​com expressão inalterada interagindo com células hospedeiras; Assim, os métodos para a cultura de P. gingivalis em um ambiente anaeróbico são dadas. Além disso, dois protocolos de baixo custo simples são demonstrados para avaliar a capacidade do P. gingivalis para ser internalizada pelas células endoteliais humanas da veia umbilical (HUVEC). O primeiro protocolo baseia-se no ensaio de protecção de antibiótico populares. Embora o ensaio é simples, as considerações ao usar microrganismos anaeróbios são dadas. O segundo protocolo requer a utilização de um microscópio de varrimento de fluorescência para visualizar a interagir e internalizado P. gingivalis. Cada ensaio tem as suas limitações e vantagens que serão discutidos para fornecer o pesquisador um esboço para estudar a invasão de bactérias anaeróbicas. Embora o manuscrito atual estuda P. gingivalis e HUVEC, estes protocolos podem ser utilizados para muitos outros tipos de bactérias anaeróbicas, bemcomo para outros tipos de células hospedeiras.

<table><tbody><tr><td>Vinyl Anaerobic Chamber-Type B</td><td>Coy Laboratory Products</td><td></td><td>Model 2000 incubator&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood</td><td>BBL</td><td>221261</td><td></td></tr><tr><td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool</td><td>LifeLine Technology</td><td>FC-0044</td><td></td></tr><tr><td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td><td>LifeLine Technology</td><td>LL-0003</td><td></td></tr><tr><td>TrypKit</td><td>LifeLine</td><td>LL-0013</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Riedel-de Haen</td><td>16109</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Sulfate Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-1264</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3761</td><td></td></tr><tr><td>BCECF-AM</td><td>LifeTechnologies</td><td>B1150</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Phalloidin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>18 mm Circular Coverslips</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72222-01</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

porphyromonas gingivalis as a model organism for assessing interaction of anaerobic bacteria with host cells

As bactérias anaeróbicas longe superam os aeróbios em muitos nichos humanos, tais como o intestino, boca e vagina. Além disso, infecções anaeróbias são comuns e frequentemente de origem indígena. A capacidade de alguns agentes patogénicos anaeróbios de invadir células humanas lhes dá as medidas de adaptação para escapar imunidade inata, bem como para modular o comportamento da célula hospedeira. No entanto, assegurar que as bactérias anaeróbias são vivo durante a investigação experimental dos eventos pode representar desafios. Porphyromonas gingivalis, um anaeróbio Gram-negativos, é capaz de invadir uma variedade de células não fagocíticas eucarióticas. Este artigo descreve como para com êxito a cultura e avaliar a capacidade do P. gingivalis de invadir células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Dois protocolos foram desenvolvidos: um para medir as bactérias que podem invadir e sobreviver com sucesso dentro do hospedeiro, e a outra para visualizar as bactérias que interagem com as células hospedeiras. Estas técnicas requerem a utilização de um anaecâmara para fornecer P. Robic gingivalis com um ambiente anaeróbico para o crescimento ideal. O primeiro protocolo baseia-se no ensaio de protecção de antibiótico, que é largamente utilizada para estudar a invasão das células hospedeiras por bactérias. No entanto, o ensaio de protecção de antibiótico é limitada; apenas bactérias intracelulares que são cultiváveis ​​após o tratamento antibiótico e a lise da célula hospedeira são medidos. Para avaliar todas as bactérias interagem com células hospedeiras, tanto vivos e mortos, desenvolvemos um protocolo que utiliza a microscopia fluorescente para examinar interação patógeno-hospedeiro. As bactérias são marcado por fluorescência com 2 &#39;, 7&#39;-bis- (2-carboxietil) -5- (e-6) -carboxyfluorescein acetoximetil éster (BCECF-AM) e utilizados para infectar células eucarióticas em condições anaeróbias. Após fixação com paraformaldeído e permeabilização com 0,2% de Triton X-100, as células hospedeiras são marcados com TRITC-faloidina e DAPI para marcar o citoesqueleto da célula e do núcleo, respectivamente. Multiple images tomadas em diferentes pontos focais (Z-stack) são obtidos para visualização temporal e espacial das bactérias. Os métodos usados ​​neste estudo pode ser aplicada a qualquer bactéria anaeróbia cultiváveis ​​e qualquer tipo de célula eucariótica.

Protocolos descritas acima foram usadas no estudo de interação patógeno-hospedeiro entre P. gingivalis e células endoteliais. P. gingivalis W83 e um P. gingivalis V3150 transportando uma deleção de PG0228 foram utilizados no estudo. O PG0228 está previsto para codificar uma proteína que podem alterar os níveis de RNA e proteínas, o que pode em última análise afectar a interacção de P. gingivalis com células hospedeiras. Para investigar o efeito da PG0228 em <em...

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Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis como um organismo modelo para a Avaliação da Interação de bactérias anaeróbias com células do hospedeiro

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

26.2K visualizações.  Virginia Commonwealth University. This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type. 

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Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

Avaliação da viabilidade de um consórcio bacteriano sintético na Interface Host-micróbio em Vitro Gut

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Bioquímica

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including neoplastic, autoimmune, and chronic inflammatory diseases. Emerging evidence implicates pathogen-induced chronic inflammation in the development and progression of chronic diseases with a wide variety of clinical manifestations. Due to the complex and multifactorial etiology of chronic disease, designing experiments for proof of causality and the establishment of mechanistic links is nearly impossible in humans. An advantage of using animal models is that both genetic and environmental factors that may influence the course of a particular disease can be controlled. Thus, designing relevant animal models of infection represents a key step in identifying host and pathogen specific mechanisms that contribute to chronic inflammation.
Here we describe a mouse model of pathogen-induced chronic inflammation at local and systemic sites following infection with the oral pathogen Porphyromonas gingivalis, a bacterium closely associated with human periodontal disease. Oral infection of specific-pathogen free mice induces a local inflammatory response resulting in destruction of tooth supporting alveolar bone, a hallmark of periodontal disease. In an established mouse model of atherosclerosis, infection with P. gingivalis accelerates inflammatory plaque deposition within the aortic sinus and innominate artery, accompanied by activation of the vascular endothelium, an increased immune cell infiltrate, and elevated expression of inflammatory mediators within lesions. We detail methodologies for the assessment of inflammation at local and systemic sites. The use of transgenic mice and defined bacterial mutants makes this model particularly suitable for identifying both host and microbial factors involved in the initiation, progression, and outcome of disease. Additionally, the model can be used to screen for novel therapeutic strategies, including vaccination and pharmacological intervention.

Animal models have proven to be invaluable tools in defining host and pathogen specific mechanisms that contribute to the development of chronic inflammation. Here we describe a mouse model of oral infection with the human pathogen Porphyromonas gingivalis and detail methodologies to assess the progression of inflammation at local and systemic sites.

Um modelo de rato para induzida por patógeno inflamação crônica no local e sistêmica Sites

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Imunologia e Infecção

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically modified strains, the vast number of analyses that can be performed on harvested soft and hard tissues. However, many of these systems are subject to procedural criticisms. As an alternative, the ligature-induced model of periodontal disease, driven by the localized development and retention of a dysbiotic oral microbiome, can be employed, which is rapidly induced and relatively reliable. Unfortunately, the variants of ligature-induced murine periodontitis protocol are isolated to focal regions of the periodontium and subject to premature avulsion of the installed ligature. This minimizes the amount of tissue available for subsequent analyses and increases the number of animals required for study. This protocol describes the precise manipulations required to place extended molar ligatures with improved retention and usage of a novel rinse technique to recover oral neutrophils in mice with an alternative approach that mitigates the aforementioned technical challenges.

This article presents a protocol for establishing a ligature-induced model of murine periodontitis involving multiple maxillary molars, resulting in larger areas of the involved gingival tissue and bone for subsequent analysis as well as reduced animal usage. A technique to assess oral neutrophils in a manner analogous to human subjects is also described.

Modelo robusto induzido por ligadura de periodontite de murine para a avaliação de neutrófilos orais

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four women experience bacterial vaginosis, in which a low level of lactobacilli is accompanied by an overgrowth of diverse anaerobic bacteria. This condition has been associated with many health complications, including risks to reproductive and sexual health. While there is growing evidence showing the complex nature of microbial interactions in human vaginal health, the individual roles of these different anaerobic bacteria are not fully understood. This is complicated by the lack of adequate models to study anaerobically grown vaginal bacteria. Mouse models allow us to investigate the biology and virulence of these organisms in vivo. Other mouse models of vaginal bacterial inoculation have previously been described. Here, we describe methods for the inoculation of anaerobically grown bacteria and their viable recovery in conventionally raised C57Bl/6 mice. A new, less stressful procedural method for vaginal inoculation and washing is also described. Inoculation and viable recovery of Gardnerella are outlined in detail, and strategies for additional anaerobes such as Prevotella bivia and Fusobacterium nucleatum are discussed.

The protocol presents a mouse model of vaginal colonization with anaerobically cultured human vaginal bacteria. We focus on Gardnerella vaginalis,&#160;while including suggestions for Prevotella bivia and Fusobacterium nucleatum. This protocol can also be used as a guide for vaginal inoculations and viable recovery of other anaerobically grown bacteria.

Modelos de colonização vaginal murina por bactérias cultivadas anaerobicamente

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four ...

Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro

Recapitulating the host-pathogen interface at the epithelial or mucosal barrier in vitro remains a challenging prospect for infection biologists. While in-house grown 2D epithelial monolayers lack true representation of the in vivo situation, commercially available tissue models are often overlooked due to their cost and practicality. However, with careful planning, such models provide reproducible platforms for a vast array of different applications. Here, we report the use of epithelial models that can be utilized for a wide variety of experimental purposes to investigate host-pathogen interactions in various ecological niches, such as the oral cavity, skin, and vaginal mucosa. From simple planktonic cells to complex biofilm co-culture, epithelial models are used to assess microbial adherence and invasion, and to evaluate the host response at a transcriptional and/or protein level, with scope for more detailed profiling using different omics approaches. Furthermore, these biological systems can be used as more accurate test beds for evaluating conventional and novel antimicrobial activity in a complex host-pathogen microenvironment in vitro. The protocols described herein document how models are handled upon arrival and prepared in the laboratory for co-culture stimulation with biofilm communities. The methods detail how experimental outputs are achieved from the model systems, including the processing of tissue, the co-culture setup, and data generation. These experiments include host gene expression through single- and multiplex qPCR analyses and inflammatory protein detection using ELISAs. In conclusion, epithelial models provide useful in vitro systems for preclinical investigatory studies into simple or complex host-pathogen interactions.

The present protocol outlines the application of organotypic tissue models for investigating host-pathogen interactions in vitro. Specifically, the model system described uses a multi-layered oral epithelium exposed to microorganisms associated with biofilms (dental plaque) within the context of oral health versus disease.

Sistemas de Modelo de Tecido Organotípico para Investigação de Interações Patógeno-Hospedeiro In Vitro

Recapitulating the host-pathogen interface at the epithelial or mucosal barrier in vitro remains a challenging prospect for infection biologists. While ...

Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial diversity on earth. Novel approaches are required to culture these uncultured bacteria so that investigators can effectively study their physiology and lifestyle using the powerful tools available in the laboratory. The Candidate Phyla Radiation (CPR) is one of the largest groups of uncultivated bacteria, comprising ~15% of the living diversity on earth. The first isolate of this group was a member of the Saccharibacteria phylum, 'Nanosynbacter lyticus' strain TM7x. TM7x is an unusually small bacterium that lives as a symbiont in direct contact with a bacterial host, Schaalia odontolytica, strain XH001. Taking advantage of the unusually small cell size and its lifestyle as a symbiotic organism, we developed a protocol to rapidly culture Saccharibacteria from dental plaque. This protocol will show how to filter a suspension of dental plaque through a 0.2 &#181;m filter, then concentrate the collected Saccharibacteria cells and infect a culture of host organisms. The resulting coculture can be passaged as any normal bacterial culture and infection is confirmed by PCR. The resulting binary culture can be maintained in the laboratory and used for future experiments. While contamination is a possibility, the binary culture can be purified by either further filtering and reinfection of host, or by plating the binary culture and screening for infected colonies. We hope this protocol can be expanded to other sample types and environments, leading to the cultivation of many more species in the CPR.

We demonstrate a method for isolating difficult-to-grow members of the novel bacterial phylum, Saccharibacteria, by filtering dental plaque and co-culturing with host bacteria.

Estabelecendo Culturas Binárias Estáveis de Saccharibacterias simbióticas da Cavidade Oral

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...

Biologia

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their nature would be beneficial in facilitating their characterization. Currently, most studies focus only on one specific characterization method; however, the isolation and identification of microorganisms from the host is a continuous process and usually requires several combinatorial characterization methods. Herein, we describe methods of identifying the microbial biofilm-forming ability, the microbial respiration state, and their chemotaxis behavior. The methods are used to identify five microbes, three of which were isolated from the bone tissue of Sprague-Dawley (SD) rats (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, and Enterococcus faecalis) and two from the American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923&#160;and Enterococcus faecalis V583. The microbes isolated from the SD rat bone tissue include the gram-positive microbes. These microbes have adapted to thrive under stressful and nutrient-limiting environments within the bone matrix. This article aims to provide the readers with the specific know-how of determining the nature and behavior of the isolated microbes within a laboratory setting.

Here, we present a practical method for the isolation and identification of microorganisms within the host. In this way, the physicochemical properties of microorganisms and possible ways of living in the host are clearly described.

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their ...

Anti-Infective Efficacy in Cystic Fibrosis with Aggregate Biofilm Models

Cystic Fibrosis Aggregate Biofilm Model to Study Infection-relevant Gene Expression

Standard pre-clinical testing methods for novel antimicrobial therapeutics used to treat chronic lung infections in people with cystic fibrosis do not reflect the environmental conditions of the hostile lung niche. Current reductionist testing conditions can lead to the progression of compounds along a preclinical pipeline without evidence of their activity under cystic fibrosis lung niche-appropriate conditions. Several approaches used to study traditional antimicrobials may not be suitable for antibiotic alternatives, including anti-virulence therapeutics like anti-quorum sensing agents and siderophore inhibitors. This protocol documents an aggregate biofilm model of Pseudomonas aeruginosa to compare resistance and infection-relevant gene expression in single-species and multi-species cultures (Staphylococcus aureus and Candida albicans), examining colony-forming unit (CFU) reductions and changes in gene expression, using algD as an exemplar. The model was optimized for small, static volumes of bacterial cultures to allow the study of novel compounds in the discovery phase of the drug development pipeline, where compound quantities may be limited. Single-species P. aeruginosa biofilms were formed in Synthetic Cystic Fibrosis Medium 2 (SCFM2) for 24 h before treatment with meropenem at different concentrations (1, 16, and 256 &#181;g/mL) for a further 24 h. Polymicrobial biofilms were established by growing Staphylococcus aureus and Candida albicans together in SCFM2, then inoculating with P. aeruginosa for an additional 24 h and treating with meropenem. The lack of a direct connection between compound efficacy measures in pre-clinical testing and clinical trial results has cast doubt on the applicability of current laboratory screening tools. This model allows us to understand the impact of relevant factors on P. aeruginosa gene expression, including genes contributing to resistance and virulence, thereby bridging this gap.

This study outlines a framework for developing an aggregate polymicrobial biofilm model and optimizing an RNA extraction protocol to assess Pseudomonas aeruginosa gene expression reflective of the cystic fibrosis lung environment. Applications include evaluating antimicrobial effects and studying antibiotic alternatives under conditions relevant to cystic fibrosis.

Standard pre-clinical testing methods for novel antimicrobial therapeutics used to treat chronic lung infections in people with cystic fibrosis do not ...

Visualization of Internalized Anaerobic Bacteria within Host Endothelial Cells

Source: Wunsch, C. M. et. al., <a href="https://app.jove.com/v/53408">Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate a procedure to visualize internalized Porphyromonas gingivalis, an anaerobic pathogenic bacterium, within human endothelial cells using confocal microscopy. The bacteria are stained with a fluorescent dye while the host endothelial cell actin cytoskeleton is labeled with a different fluorescent dye. The internalized Porphyromonas gingivalis inside endothelial cells are visualized using confocal microscopy.

Visualização de bactérias anaeróbicas internalizadas dentro das células endoteliais do hospedeiro

1. Internalization of Bacteria into Host Cells (Fluorescent Microscopy)
Note: P. gingivalis is labeled with ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Imunologia

Imunodiagnóstico

Imaging and Visualization Techniques

A Bacterial Infection Assay for Studying Anaerobic Bacteria-Host Cell Interactions

Source: Wunsch, C. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53408">Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates a technique for assessing the ability of Porphyromonas gingivalis, an anaerobic pathogenic bacterium, to adhere to and invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). After infecting the host cells with the bacteria, the host cells are lysed to release both adhered and internalized bacteria. When the lysate is plated in an appropriate medium, the presence of colonies indicates successful bacteria-host cell interactions.

Um ensaio de infecção bacteriana para estudar interações anaeróbicas bactérias-células hospedeiras

The following protocols will describe methods for culturing and studying the invasion by the anaerobic species, P. gingivalis; however, these protocols ...