Este protocolo permite a fabricação de análogos ósseos sem a necessidade de aquecimento ou produtos químicos tóxicos. Desta forma, as estruturas ósseas são formadas com o potencial de reparar um defeito ósseo em ambientes clínicos usando as próprias células de um paciente. A principal vantagem da técnica é que a tinta óssea pode ser impressa com células vivas para formar qualquer estrutura óssea complexa e direcionar a diferenciação para a linhagem formadora óssea.
Além disso, as drogas podem ser carregadas na tinta do osso para melhorar simultaneamente a cicatrização de feridas, a regeneração óssea e tratar patologias como o câncer. Demonstrando o procedimento estarão Gagan Jalandhra, um candidato a PhD no meu laboratório, e a Dra. Sara Romanazzo, que trabalhou comigo e com a Dra. Jalandhra em vários projetos, incluindo o desenvolvimento dessa tecnologia. Comece adicionando a mistura de hidrogenofosfato de cálcio e carbonato de cálcio em pó a um cadinho de zircônia de tal forma que não esteja mais do que 75% cheio.
Transfira o cadinho para um forno, aqueça-o a 1.400 graus Celsius a uma taxa de cinco graus Celsius por minuto e segure por três horas. Apague a reação removendo o cadinho do forno e deixando em um topo de bloco refratário. Deixe esfriar completamente antes de manusear.
Use uma argamassa e pilão para quebrar e moer o bolo de fosfato alfa-tricálcico de tal forma que os grânulos resultantes tenham um tamanho máximo de 200 micrômetros. Adicione três bolas de zircônia estabilizadas por ítria milimétrica à mistura moída, seguidas de etanol a 100%. Prenda a tampa e triture por duas horas a 180 rotações por minuto.
Recolha a suspensão e separe as esferas, utilizando etanol a 100% para a lavagem. Seque a suspensão em forno a 120 graus Celsius por 24 horas. Adicione o pó seco aos frascos de moagem com bolas de zircônia de um milímetro e etanol a 100% nas mesmas proporções de peso do primeiro estágio.
Moer por duas horas a 180 rotações por minuto. Em seguida, separe e seque no forno. Retire a amostra do forno.
Para fazer a tinta óssea, adicione 630 microlitros de glicerol e 130 microlitros de polissorbato 80 a um frasco de bola mil. Em seguida, adicione 100 miligramas de fosfato de amônio dibásico e dois gramas de pó de fosfato alfa-tricálcico à solução e mexa continuamente com uma espátula para combinar. Adicione uma bola de zircônia de 25 milímetros, prenda a tampa e coloque-a dentro de um moinho planetário por 60 minutos a 180 rotações por minuto, parando no meio do caminho para raspar as laterais do frasco com uma espátula usando uma espátula.
Carregue a tinta numa seringa de um mililitro. Fazer uma solução a 10% de gelatina tipo A em PBS 1X conforme descrito no manuscrito do texto. Colocar o balão cónico no agitador.
Em seguida, adicione 5.796 mililitros de anidrido metacrílico e continue mexendo no escuro a 50 graus Celsius por 90 minutos. Apagar a reacção diluindo o conteúdo dos frascos cónicos duas vezes com PBS. Decant em tubos de 50 mililitros e remover o anidrido metacrílico não reagido por centrifugação a 3000 RCF à temperatura ambiente durante três minutos e recolha do sobrenadante.
Dialise o sobrenadante dentro de tubos de diálise de celulose de corte de 14 quilodalton contra água deionizada a 40 graus Celsius por cinco dias enquanto mexe suavemente. Substitua a água deionizada todos os dias. Prepare-se para o armazenamento decantando em tubos de 50 mililitros, prendendo a tampa e colocando-a na geladeira por 12 horas.
Em seguida, congele as amostras usando nitrogênio líquido e imediatamente liofilize por cinco dias a menos 54 graus Celsius e 0,4 milibares. Armazene a espuma resultante em um freezer a menos 20 graus Celsius. Para sintetizar microgéis GelMA, faça uma solução GelMA a 10% a peso em PBS pesando o GelMA liofilizado, adicionando-o a um tubo com PBS e aquecendo em banho-maria a 50 graus Celsius até ficar totalmente hidratado.
Adicione 37 mililitros de óleo por um mililitro de solução de GelMA a um copo, garantindo que não esteja mais do que 65% cheio. Configure um sistema de copo duplo em uma placa quente com agitação magnética, colocando o copo contendo óleo dentro de um copo maior. Aqueça a 40 graus Celsius enquanto mexe.
Carregue a solução de GelMA numa seringa e adicione-a gota a gota ao óleo de agitação através de um filtro de 0,45 micrómetros. Deixe a emulsão se equilibrar por 10 minutos. Reduza a temperatura da emulsão para 15 graus Celsius para termicamente.
Estabilize as esferas adicionando gelo triturado no espaço entre os dois béqueres. Adicione acetona à emulsão GelMA giratória. Decantar o conteúdo do copo em tubos de 50 mililitros, certificando-se de lavar as paredes do copo com acetona.
Deixe descansar por 20 minutos para permitir que os microgéis desidratados se depositem no fundo. Rejeitar o sobrenadante e lavar os microgéis duas vezes com acetona. Consolide em um tubo, recarregue com acetona e sonicate por 10 segundos.
Novamente, lave-o com acetona duas vezes. Conservar em acetona à temperatura ambiente até ser necessário para impressão. Para preparar a suspensão de microgel GelMA para impressão, formule uma solução ponderal a 1% de GelMA em DMEM conforme descrito no manuscrito do texto.
Evaporar a acetona dos microgéis desidratados e pesar o pó resultante num tubo. Adicione acetona e transfira para um ambiente estéril. Para formar a suspensão de microgel, evapore a acetona do pó dentro do gabinete de biossegurança.
Após a evaporação, adicionar DMEM, solução de 1%GelMA em DMEM e solução iniciadora de LAP a 2,5% para obter uma fração de embalagem final de 30%Deixe hidratar totalmente por pelo menos 12 horas à temperatura ambiente. Cultivar as células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo em DMEM de baixa glicose suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até ser confluente. Remover as células estaminais mesenquimais derivadas do tecido adiposo do balão de cultura de tecidos, removendo o meio e lavando com PBS estéril.
Pellet as células por centrifugação a 150 RCF à temperatura ambiente durante cinco minutos. Conte as células e calcule pelo menos 5 x 10 para as cinco células para cada mililitro de microgéis GelMA. Aloque o volume necessário da suspensão da célula a um tubo e pellet separados, conforme demonstrado anteriormente.
Retire cuidadosamente o máximo de sobrenadante possível usando uma pipeta, deixando apenas a pastilha celular. Adicione o volume necessário de suspensão de microgel ao pellet e pipete suavemente para cima e para baixo para garantir uma distribuição uniforme. Carregar a célula carregada em suspensão de microgel em um reator usando uma pipeta.
Usando uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 23, deposite a tinta óssea, faça a ligação cruzada da célula e do microgel GelMA carregado de tinta óssea com uma lâmpada reticulante UV a 405 nanômetros por 90 segundos. Transfira imediatamente a suspensão de microgel para uma placa de poço de tamanho adequado contendo DMEM completo. Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Substitua o meio de cultura após 24 horas e, em seguida, a cada 48 a 72 horas, conforme necessário. A tinta óssea foi analisada por microscopia eletrônica de varredura para determinar sua microestrutura, que mostrou a formação de cristal de hidroxiapatita após a configuração da tinta, particularmente visível em condições secas. Neste estudo, as células foram misturadas com microgéis GelMA e mantidas em cultura por até cinco dias, seja apenas em suspensão de microgel ou no sistema COBICS.
As células apresentaram boa viabilidade na presença da tinta óssea, tanto no primeiro dia quanto no quinto dia, confirmando que os produtos de lixiviação da tinta não foram prejudiciais às células. É crucial controlar a velocidade do stirrig enquanto sintetiza o microgel, pois uma ligeira mudança de agitação pode causar diferenças de tamanho. Também é importante garantir a distribuição homogênea das células dentro da suspensão de microgel.
O mesmo protocolo pode ser usado para imprimir dentro de suspensões de microgel de gelatina, que atuam como suportes de sacrifício, deixando para trás construções ósseas autônomas. Mas o uso do GelMA abre caminho para construções multifásicas de um pote, como interfaces osteocondrais ou tendinosas ósseas.
