O ensaio alimentador de microplacos fornece um método econômico simples, de alto rendimento e econômico para medir o comportamento alimentar de Drosophila, e oferece múltiplas vantagens em relação a outros métodos mais elaborados. Quantificar o consumo medindo a absorvância com um leitor de placas elimina medições manuais e evita a entrada manual de dados. Os dados também são favoráveis à extração e processamento programáticos.
Com este ensaio de alto rendimento podemos quantificar o consumo de nutrientes solúveis em água, drogas, fármacos ou toxinas, e o sistema pode ser modificado para aplicações a uma variedade de espécies de insetos. Comece despejando a agarose derretida em um cocho de reagente e distribua 80 microliters de agarose derretida em cada poço de uma microplata de 96 poços usando uma pipeta multicanal. Leve à geladeira a sobra por até uma semana em um saco selado e remeleme-o para fazer placas adicionais.
Se as tiras de barreira estiverem muito soltas, enrole-as ao redor do dedo para dar-lhes curvatura para segurá-las nos canais. Insira as faixas de barreira nos canais de tira de barreira para preparar os acopladores. Afixe o acoplador a uma placa de fome, certificando-se de não usar o acoplador para manipular o prato, pois o acoplador pode escorregar.
Certifique-se de que o canto angular do acoplador corresponde ao canto angular da microplaca para manter a orientação correta. Sob anestesia de CO2, tipo moscas de três a cinco dias de idade. Carregue moscas individuais por coluna na placa de fome.
Feche cada coluna enquanto ela preenche ajustando sua faixa de barreira à posição fechada. Grave cuidadosamente o layout da amostra dentro da microplacão. Uma vez que a placa de fome é preenchida, permita que as moscas se recuperem espontaneamente depois de remover o CO2, e esfomeá-las por seis horas a partir de seu tempo inicial de anestesia.
Prepare 10 mililitros de alimentos líquidos em um tubo cônico de 15 mililitros dissolvendo 0,4 gramas de sacarose e 0,1 grama de extrato de levedura em 10 mililitros de água destilada. Vórtice do tubo até que os sólidos se dissolvam completamente. Adicione 40 microliters de solução de estoque de corante e transfira o alimento líquido para uma seringa de 10 mililitros com um filtro de 0,45 micrômetros.
Filtre aproximadamente 1,5 mililitros da solução de cada vez em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro. Coloque a seringa contendo a solução de lado e filtre a solução adicional conforme necessário durante a preparação da placa de alimentação. Prepare uma placa alimentadora selando a parte inferior de uma microplacão de 1536 poços com uma máquina de selar.
Use uma remada de vedação para aderir bem ao filme. Em seguida, corte o excesso de filme das bordas esquerda e direita com uma lâmina de barbear. Distribua 10 microliters da coluna de alimentos líquidos filtrados no poço superior esquerdo para cada conjunto de quatro poços da microplacão de 1536 poços.
Uma vez que todos os poços estejam cheios, aplique uma película de vedação na parte superior da placa, seguindo os mesmos passos usados para selar a parte inferior da microplaca. Repita para o número desejado de placas. Centrifugar as placas a 200 vezes G por 10 segundos para liquidar o fluido.
Não permita que a placa seja resfriada, pois isso pode causar o acúmulo de condensação nos poços, ocultando leituras de absorvência. Perfure os poços na superfície superior da placa com a ferramenta da sonda agulha equipada com uma agulha de 0,25 milímetros de diâmetro, utilizando a mesma ordem para perfurar como foi usada na dispensa das soluções. Limpe a agulha entre as soluções para evitar a contaminação cruzada.
Vire a placa e perfure os poços na parte inferior. Leia a absorção da placa em 630 nanômetros sem tampa. Coloque uma tampa interna na película de vedação superior para garantir que os anéis de condensação circundem os poços perfurados e coloque a tampa externa na placa.
Coloque a placa alimentadora de frente para cima no acoplador de tal forma que as guias alinhem os orifícios apropriados da placa alimentadora e da placa de fome. Certifique-se de que o acoplador e as placas estão corretamente orientados. Uma vez que todas as placas alimentadoras são carregadas sobre os acoplamentos, abra os poços para as placas ajustando as faixas de barreira no acoplador.
Coloque o acoplador e as montagens de placas no recipiente secundário. Coloque a metade inferior de uma caixa de pipeta contendo toalhas de papel encharcadas em cada recipiente secundário para fornecer umidade. Feche a tampa do recipiente secundário e transfira-a para um ambiente controlado.
Deixe as moscas consumirem por 22 horas. Após as 22 horas de exposição, verifique cada placa se há moscas mortas e atualize o layout da placa de acordo. Depois que todas as placas forem verificadas, anestesia as moscas em massa, bombeando CO2 dentro do recipiente secundário.
Após aproximadamente 60 segundos, certifique-se de que todas as moscas estão imobilizadas. Bata suavemente as moscas na placa de fome e substitua as tiras de barreira de plástico. Remova as placas alimentadoras para leitura.
Releia a absorvância da placa em 630 nanômetros. Repita o processo até que todas as placas tenham sido lidas. A evaporação foi quantificada para cada poço e foi encontrada para determinar se existem correlações entre os poços de placas individuais.
Coeficientes de correlação de Pearson para evaporação versus linhas e evaporação versus colunas foram calculados para avaliar tendências entre evaporação e locais de poços. O consumo de moscas Canton-SB de três a cinco dias de idade foi quantificado para estabelecer a validade do protocolo. As moscas foram escolhidas entre uma solução de 4% de sacarose com extrato de levedura de 1% e uma solução de 4% de sacarose complementada com 15% de etanol e extrato de 1% de levedura.
Tanto os machos quanto as fêmeas mostraram uma preferência esmagadora pela solução com extrato de etanol e levedura. É essencial manter a consistência na construção das placas alimentadoras, garantindo que cada mosca seja apresentada com um cenário de consumo idêntico em relação ao volume alimentar, evaporação e acesso. Essa técnica permitirá que pesquisadores da área de Drosophila realizem ensaios de alto rendimento para comportamentos de consumo e preferência com maior rendimento e a menor custo em comparação com os métodos tradicionais.
