Agradecemos U. Heberlein e A. Devineni para discussões de longa duração e assessoria técnica. Agradecemos também aos membros do laboratório Shohat-Ophir, A. Benzur, L. Kazaz, e O. Shalom, pela ajuda em demonstrar o método. Um reconhecimento especial vai para Eliezer Costi para o estabelecimento dos sistemas de mosca no laboratório. Este trabalho foi apoiado pelo Israel Science Foundation (384/14) e Marie Curie carreira Bolsas de Integração (CIG 631.127).

Nota: Visão geral do desenho experimental: O delineamento experimental inclui um protocolo adaptado para a supressão de corte 7-9 em que as moscas macho são expostos a experiências gratificantes e nonrewarding em 3 sessões de treino consecutivas ao longo de 4 d. No final da fase de experiência, as moscas são testados num ensaio de consumo voluntário de etanol em duas escolha para 3-4 d. O protocolo aqui inclui vários passos preparatórios, alguns dos quais pode ser efectuada previamente, para ser utilizado em mais do que uma experiência, enquanto outros devem ter lugar de uma forma atempada, antes do início da experiência (Tabela 1). 1. Passos preparatórios <ol><li> Preparando o sistema de alimentação capilar <ol><li> Aquece-se uma agulha G 27, e usá-lo para perfurar pequenos orifícios ao longo de um frasco (Figura 1). </li><li> Cortar o bujão do frasco de metade (transversalmente), utilizando uma lâmina de barbear. Mark quatro pontos sobre a superfície do bujão, criando um square forma a posicionar os suportes em capilares. Utilize uma agulha de 18 G para fazer orifícios 4 através do tampão (Figura 1b). </li><li> Usar uma lâmina de barbear para cortar micropipetas de modo que eles podem segurar firmemente capilares de vidro 5? L, que servem como adaptadores. </li><li> Insira 4 adaptadores capilares nos plugues preparadas. </li><li> Marque a posição dos 2 etanol- e dois capilares contendo nonethanol sobre a ficha. Nota: Recomenda-se manter as posições dos 2 tipos de capilares consistentes em todos os frascos. Prestar atenção ao tamanho dos furos, como grandes furos permitem a fuga de moscas fora dos frascos. Além disso, é recomendável usar o lado mais liso da ficha (normalmente oposto ao lado de corte) como o lado que está voltado para baixo quando inserida para dentro do frasco, como o corte do tampão cria algumas fibras pequenas, soltas que as moscas podem ficar presos em . </li><li> Preparar um grande número de tubos de ensaio e adaptadores a serem usados ​​para o sistema de alimentação capilar (CAF)experiências descritas no passo 2.3. </li></ol></li><li> Preparando frascos de alimentos em pequena vidro <ol><li> Um dia antes de coletar as moscas (passo 1.4), arranjar 200 frascos de vidro em prateleiras tubo de microcentrífuga. Melt voar alimentos (de acordo com a receita melaço de farinha de milho, consulte a Tabela de Materiais), utilizando um forno de microondas. Despeje 2 mL de alimentos voar em frascos de vidro (tentar não manchar a comida nas paredes do frasco). Deixe a endurecer comida, e cobrir os frascos com filme plástico. NOTA: Os frascos de vidro contendo o alimento pode ser mantida a 4 ° C durante várias semanas. </li><li> No dia da coleta de mosca, dê os frascos fora da geladeira e deixá-los chegar RT antes de usá-los para abrigar moscas. NOTA: Se frascos de alimentos são várias semanas de idade, certifique-se de que a comida ainda está intacto e não separado do frasco, como as moscas podem ser presos nas fendas entre a comida e o vidro. </li></ol></li><li> Fazendo solução estoque de alimentos para o ensaio de alimentação capilar <ol><li> para prépare a solução estoque de alimentos (5% de sacarose e 5% de extracto de levedura), dissolve-se 5,88 g de extracto de levedura e 5,88 g de sacarose em 100 ml de água destilada. Nota: A solução estoque é altamente propenso à contaminação. Portanto, recomenda-se a autoclave lo (121 ° C, 30 min, e sem um ciclo de secagem) e alíquota de 850 uL em que alíquotas de trabalho para ser mantida a 4 ° C até uso posterior. A concentração de ingredientes na solução estoque é 5,88% e irá atingir a concentração final de 5% após a adição de 15% de etanol ou de água (150 uL em 850 uL de solução de alimentos premade) imediatamente antes da sua utilização no passo 2.3. </li></ol></li><li> Coletando moscas experimentais <ol><li> Colete 200 moscas macho naive usando uma almofada de CO 2. Nota: Use qualquer estirpe de laboratório relevante para a questão experimental. 250 moscas podem ser facilmente coletadas de cinco garrafas de moscas na sua fase de eclosão escolha. Ao coletar as moscas, prestar muita atenção ao colmoscas onar que eclosed recentemente (moscas-olhando virgens: moscas brilhantes, com um ponto de mecônio em seu abdômen). moscas experimentais devem ser mantidos individualmente em pequenos frascos de vidro contendo alimentos e envelhecida a 3-4 d velho antes de ser utilizado na experiência. </li><li> Use tampões macios para fechar os frascos. Observação: O mesmo plugues macios será muito útil para a fase de treinamento, quando por meio de aspiração boca para inserir as fêmeas para dentro e fora dos frascos durante a fase de experiência. </li></ol></li><li> Coletando moscas instrutor NOTA: Todas as moscas recolhidos devem ser mantidos em um 12 h / 12 h de luz / obscuridade incubadora a 25 ° C e 70% de umidade relativa (UR). A 12 h / 12 h de luz / escuro de ciclo pode ser alterado para um tempo de partida conveniente. <ol><li> moscas instrutor de fêmeas virgens <ol><li> Colete 500 virgem instrutor fêmea voa a partir de um estoque WT ou um estoque virginator para uso como fêmeas receptivas virgens. Mantenha as moscas fêmeas em grupos de 25 por de tamanho regular frasco alimentos, e todosow-los à idade de 3-4 d idade antes de os utilizar no experimento. </li></ol></li><li> Acasaladas moscas instrutor do sexo feminino <ol><li> Colete 300 moscas fêmeas virgens de um estoque WT ou um estoque virginator se submeter acasalamento antes da fase de treinamento (passo 1.6.1). NOTA: moscas fêmeas são mantidos em grupos de 10 fêmeas por frasco de tamanho regular de alimentos e envelhecida a 3-4 d velho antes de ser utilizado na experiência. </li></ol></li><li> moscas macho usado para gerar moscas instrutor do sexo feminino acasalados <ol><li> Colete 150 moscas macho (não necessariamente virgem). NOTA: As moscas são mantidos em grupos de 15 machos por frasco de alimentos de tamanho regular e envelhecido ao 3-4 d idade antes de ser emparelhado com a fêmea virgem voa para criar as fêmeas acasaladas instrutor. </li></ol></li></ol></li><li> Gerando moscas fêmea instrutor acasaladas <ol><li> Para gerar feminina acoplado voa para ser usado como formadores, grupos de pares de 10 do sexo feminino virgem voa com 15 do sexo masculino voa lançando um frasco contendo macho em uma fêmea-Containing frasco 16-18 h antes da fase de treinamento (passo 2.1) 10. NOTA: Este deve normalmente ter lugar na noite antes da sessão de treino. A 1.5: 1 relação entre o macho voa para moscas fêmeas assegura que todas as mulheres será acoplado. </li><li> No dia da experiência, separar as fêmeas acasaladas dos machos por aspiração os machos para fora do frasco utilizando um aspirador de boca. Realizar esse direito antes do início de cada dia de treinamento. </li></ol></li></ol> 2. Passos Experimentais <ol><li> Configurando a fase de experiência <ol><li> Iniciar a experiência o mais próximo possível para o início da fase de luz na incubadora. Coloque as fêmeas instrutor (ambos virgens e acasaladas) na câmara de comportamento. NOTA: Recomenda-se a realizar o experimento em uma câmara de comportamento, ou em qualquer ambiente isolado que é calmo e definido para 25 ° C e 60 - 65% RH. Mantendo a umidade acima de 50% é muito importante, uma vez que o comportamento de corte e acasalamentos depender de detecção de feromonas, que é conhecido por ser sensível à humidade. </li></ol></li><li> Expondo moscas macho para experiências gratificantes e nonrewarding <ol><li> Disponha os frascos de vidro contendo as moscas macho individuais em prateleiras de microcentrífuga, posicionando os frascos ao longo das margens do rack. NOTA: Este acordo permite o experimentador de observar facilmente os pares de moscas que se submetem a cópula sem levar os frascos fora do rack. </li><li> Prepare (conforme descrito na etapa 2.2.1) 2 grupos de 100 frascos de vidro contendo único macho voa em prateleiras separadas para homens submetidos a experiências de acasalamento gratificantes e nonrewarding (ou seja rejeitado e acasaladas). </li><li> fêmeas instrutor aspirado e adicioná-los a cada frasco contendo as moscas macho. Definir o temporizador para 1 h. Começando com o grupo rejeitado, adicionar uma fêmea acoplado a cada frasco. Em seguida, passar para os machos a serem acasaladas e adicionar uma fêmea virgem a cada frasco. </li><li> Observe atentamente os encontros de acasalamentopara certificar-se de que os machos que interagem com fêmeas virgens acasalar com sucesso dentro da primeira hora e que os machos que interagem com as fêmeas acasaladas anteriormente não acasalar. Para monitorar a coorte rejeitada no decurso de 1 h, defina um segundo temporizador durante 15 min e assistir os machos a cada 15 min. </li><li> Descarregar os machos da coorte rejeitou que conseguiu acasalar e os homens da coorte acoplado que não terminou até o acasalamento até o final da primeira sessão de treinamento. </li><li> Terminar a primeira sessão de treinamento, aspirando os formadores do sexo feminino anteriormente acasalados em um frasco regulares mosca comida, e mantê-los para a próxima sessão condicionado. Siga este passo, aspirando suavemente as fêmeas do grupo masculino acoplado. </li><li> Deixe as moscas descansar por 1 hora. </li><li> Repita os passos 2.2.3 - 2.2.7 duas vezes. </li><li> Repita o treino nas etapas 2.2.3 - 2.2.8 todos os dias por mais 3 d. </li></ol></li><li> Gravação de consumo (CAFE) <ol><li> No final do último EstadoEmg sessão (quarto dia), aspirar os homens solteiros e agrupá-los em frascos de alimentação capilar. Use um plug macio para cobrir o frasco de alimentação capilar ao inserir as moscas, e substituí-lo rapidamente com o capilar plugue alimentador de ready-made, após ter sido inserido todas as moscas. Grupo 6 - 8 moscas de cada um dos grupos experimentais para um frasco, criando não menos do que 8 frascos por condição. </li><li> Molhar os tampões suavemente adicionando 5 ml de água para a parte superior do obturador. Tenha cuidado ao adicionar a água para evitar o derramamento nos frascos. Adicionar igual volume de água a cada frasco. NOTA: Este passo é feito para reduzir a evaporação dos capilares. Portanto, é repetida todos os dias durante o resto da experiência. Dependendo da humidade relativa, os dias seguintes podem requerer menos água a ser adicionada para as velas. </li><li> Preparar duas soluções alimentares separadas por adição de etanol ou água para as alíquotas de estoque de alimentos para criar uma concentração final de 15%. </li><li> Para preencher o capillAries com as duas soluções de alimentos, criação de 5 uL de alimentos líquidos em gotas uma tira de filme de laboratório e permitir que a solução para encher o capilar até que ele atinja a marca de 5 uL. Certifique-se de usar o fim claro do capilar, que é perto da linha de marca preta 5 mL. NOTA: Para encher vários capilares de uma só vez, é possível ligar 6 - 8 adaptadores capilares em conjunto e utilizá-los como uma inserção para segurar os capilares. </li><li> Toque os capilares suavemente na faixa de parafina para posicionar a solução alimentar exatamente na marca preta. Selar os capilares por imersão do final de cada capilar em pequenas gotas de óleo mineral. Este passo minimiza o potencial de evaporação da solução de alimentação. </li><li> Inserir dois capilares contendo etanol e dois capilares nonethanol contendo através dos adaptadores 4 / detentores na ficha até os lados expostos dos capilares apenas espreitar a partir do interior do frasco (1 mm ou menos a partir da superfície do bujão). NOTA:Manter a abertura dos capilares perto do plugue molhada reduz a evaporação e permite fácil acesso aos alimentos, como moscas normalmente sentar-se sobre as fichas e desça na capilar exposto para se alimentar. </li><li> Além de frascos que contêm moscas experimentais, prepare um frasco simulada sem moscas. Este controlo serve para avaliar evaporação natural. NOTA: Tente manter relativamente igual posicionamento da abertura capilar em comparação com as velas, como as diferenças podem levar à evaporação variável e enganosa dados de consumo. Manter a umidade adequada durante o experimento e posicionar as aberturas capilares, tanto quanto possível para o plug molhado, como baixa umidade e grande distância entre o plug molhado pode tanto resultar em evaporação descontrolada. </li><li> Grave a posição relativa do líquido em cada um dos vasos capilares no que diz respeito à linha de marca negra em milímetros com uma régua, e escrever esses valores para baixo. NOTA: Se a solução está posicionada exatamente no l pretoINE, o valor deve ser igual a zero, e se ele for superior ou inferior, que deve ser valores positivos ou negativos, respectivamente. Os níveis iniciais do líquido definir os pontos de referência para os valores de consumo final, o / n. </li><li> Definir os frascos de volta na incubadora durante 24 h. Substituir os capilares numa altura constante ao longo de toda a experiência. </li><li> Remover os capilares suavemente a partir dos frascos e medir os níveis de líquido no que diz respeito à linha de marcação preta. </li><li> Verifique cuidadosamente o nível do líquido no frasco simulada. NOTA: Se os níveis caíram mais de 2 mm, isso indica que a evaporação é alta e os níveis de consumo não são confiáveis. </li><li> Amortecer as fichas cuidadosamente com 2 ml de água e inserir um novo conjunto de capilares, como indicado nos passos 2.3.3 - 2.3.10. Definir os frascos de volta na incubadora durante 24 h. </li></ol></li><li> determinando preferências <ol><li> Calcule o consumo total de cada capilar subtraindo-se o nível final do inível nitial no ponto de partida. </li><li> Combinar os valores de ambos os capilares com o mesmo alimento (isto é, nonethanol capilares separadamente dos capilares contendo etanol). </li><li> Calcular preferência etanol, subtraindo a quantidade consumida a partir dos capilares não-etanol a partir da quantidade consumida a partir dos capilares contendo etanol e dividir o valor por os valores de consumo total de todos os capilares do mesmo frasco. </li><li> Calcular a média dos índices de preferência de todos os frascos do mesmo grupo experimental. <img alt="equação1" src="/files/ftp_upload/54910/54910equation1.jpg" /> NOTA: Nonethanol 1 (NE1), Nonethanol 2 (NE2), Etanol 1 (E1), Etanol 2 (E2), nonethanol Total (NE Total) = NE1 + NE2, etanol Total (E Total) = E1 + E2, soma total Índice de consumo (total Soma) = total NE + total e, e Etanol preferência (PI) </li></ol></li></ol>

<ol>
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V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addiction-like+behavior+in+Drosophila.">Addiction-like behavior in Drosophila.</a> Commun Integr Biol. 3, 357-359 (2010).</li><li>Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+deprivation+increases+ethanol+intake+in+Drosophila.">Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila.</a> Science. 335, 1351-1355 (2012).</li><li>Devineni, A. V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+ethanol+consumption+in+Drosophila+models+features+of+addiction.">Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction.</a> Curr Biol : CB. 19, 2126-2132 (2009).</li><li>McBride, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mushroom+body+ablation+impairs+short-term+memory+and+long-term+memory+of+courtship+conditioning+in+Drosophila+melanogaster.">Mushroom body ablation impairs short-term memory and long-term memory of courtship conditioning in Drosophila melanogaster.</a> Neuron. 24, 967-977 (1999).</li><li>Ejima, A., Smith, B. P., Lucas, C., Levine, J. D., Griffith, L. 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V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+Drosophila+melanogaster+as+a+model+for+alcohol+research.">The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 121-138 (2013).</li><li>Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIC:+high-throughput,+continuous+analysis+of+feeding+behaviors+in+Drosophila.">FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila.</a> PloS one. 9, 101107 (2014).</li><li>Itskov, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+monitoring+and+quantitative+analysis+of+feeding+behaviour+in+Drosophila.">Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila.</a> Nat Commun. 5, 4560 (2014).</li><li>Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Taste+Circuit+that+Regulates+Ingestion+by+Integrating+Food+and+Hunger+Signals.">A Taste Circuit that Regulates Ingestion by Integrating Food and Hunger Signals.</a> Cell. 165, 715-729 (2016).</li><li>Peru, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting,+experience-dependent+alcohol+preference+in+Drosophila.">Long-lasting, experience-dependent alcohol preference in Drosophila.</a> Addict Biol. 19, 392-401 (2014).</li><li>Dus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+Sensor+in+the+Brain+Directs+the+Action+of+the+Brain-Gut+Axis+in+Drosophila.">Nutrient Sensor in the Brain Directs the Action of the Brain-Gut Axis in Drosophila.</a> Neuron. 87, 139-151 (2015).</li><li>Anderson, D. J., Adolphs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+studying+emotions+across+species.">A framework for studying emotions across species.</a> Cell. 157, 187-200 (2014).</li><li>Gibson, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+responses+to+a+repetitive+visual+threat+stimulus+express+a+persistent+state+of+defensive+arousal+in+Drosophila.">Behavioral responses to a repetitive visual threat stimulus express a persistent state of defensive arousal in Drosophila.</a> Curr Biol. 25, 1401-1415 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Here, we illustrate the details of an integrated approach to measure alterations in reward-seeking behavior, based on previous work described by Devineni et al.6 and Shohat-Ophir et al5. The first section of the protocol uses different types of sexual interactions as the experience input, and the second section uses a two-choice feeding assay to assess the effect of experience on the preference to consume ethanol.
As shown by Devineni et al.<sup...

Modificação do comportamento em resposta à experiência permite animais para ajustar seu comportamento às mudanças no seu ambiente 1. Durante este processo, os animais integrar o seu estado fisiológico interno com as condições variáveis ​​do ambiente externo e, posteriormente, escolher uma ação sobre o outro para aumentar suas chances de sobrevivência e reprodução. Sistemas de recompensa evoluído para motivar comportamentos que são necessários para a sobrevivência dos indivíduos e das espécies, reforçando comportamentos que aumentam a sobrevivência imediata, como comer ou beber, ou aqueles que garantir a sobrevivência a longo prazo, tais como o comportamento sexual ou cuidar de filhos 2. Compostos artificiais como drogas de abuso também afetam os sistemas de recompensa por vias neurais cooptação que medeiam recompensas naturais 2. Durante as duas últimas décadas, a mosca da fruta Drosophila melanogaster tem sido estabelecido como um modelo para estudar o promissor Molecular e mecanismos neuronais que estão moldando os efeitos do etanol sobre o comportamento 3,4. Anteriormente, nós identificamos um subconjunto de neurônios peptidérgicas em moscas (receptor NPF / NPF (R) neurônios) que o casal recompensas naturais, como a experiência sexual, para a motivação de obter recompensas de droga 5. expressão NPF é sensível a ambas as experiências sexuais e recompensas de drogas, tais como a intoxicação por etanol. Alterações nos níveis de expressão NPF são convertidos em alterações em etanol auto-administração 5, onde a alta NPF reduz e baixa NPF aumenta a preferência para consumir etanol. Ativando neurônios NPF é gratificante para as moscas, como eles exibem forte preferência por um odor emparelhado com a ativação, o que também é refletido pelo consumo de etanol reduzida. Mais importante ainda, a activação de neurónios NPF interfere com a capacidade das moscas de modo a formar uma associação positiva entre a intoxicação etanol e um taco de odor. O nexo de causalidade entre o NPF / Rsistema, a memória recompensa, e o consumo de etanol sugere que é possível utilizar etanol auto-administração como uma medida para alterações nos estados de recompensa 5. Nesta publicação, demonstrar uma abordagem integrada para explorar o sistema de recompensa natural, mosca e mudanças ensaiar em estados de recompensa. A abordagem consiste em duas peças separadas, um protocolo de treino para manipular experiências naturais relacionados com a recompensa, seguido por um ensaio de alimentação capilar de dois escolha (CAF) etanol para avaliar a auto-administração como uma estimativa para alterações nos estados de recompensa. O ensaio CAFE é análogo aos ensaios de escolha de dois garrafa utilizados em estudos com roedores para a droga auto-administração e foi mostrado para reflectir determinadas propriedades de comportamento de dependência, como em moscas 6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1176">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Polystyrene 25 x 95mm Vials</td>
			<td style="width:352px;">FlyStuff</td>
			<td style="width:251px;">32-109</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">narrow plastic vials flugs</td>
			<td style="width:352px;">FlyStuff</td>
			<td style="width:251px;">42-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Sterile Needle 18G and 27G&#160;</td>
			<td>can be acquired by any company</td>
			<td style="width:251px;"></td>
			<td>1.20 X 38mm (18Gx1 1/2&#34;) , 0.40 X 13mm (27Gx1/2&#34;)</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:288px;">10x75mm Borosilicate Glass Disposable Culture Tubes</td>
			<td style="width:352px;">kimble chase</td>
			<td style="width:251px;">73500-1075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">calibrated pipets 5ul (microliter)</td>
			<td style="width:352px;">VWR</td>
			<td style="width:251px;">53432-706</td>
			<td>color coded white to contain 5 microliters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral Oil&#160;</td>
			<td style="width:352px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:251px;">M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Sucrose, Molecular Biology Grade</td>
			<td style="width:352px;">CALBIOCHEM</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">573113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Yeast extract Powder for microbiology</td>
			<td>can be acquired by any company</td>
			<td style="width:251px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Ethanol</td>
			<td style="width:352px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>32221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:288px;">standard pipette Tips (micro-pipets)</td>
			<td style="width:352px;">ThermScientific</td>
			<td style="width:251px;">T114R-Q</td>
			<td>volume- 0.1-20 ul Ultra micro</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:288px;">IDENTI-PLUGS (Foam Tube Plugs)</td>
			<td>Jaece</td>
			<td>L800-A</td>
			<td>fits opening 6 to 13mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:288px;">IDENTI-PLUGS (Foam Tube Plugs)</td>
			<td>Jaece</td>
			<td>L800-D</td>
			<td>fits opening 35 to 45mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">virginator fly stock&#160;</td>
			<td style="width:352px;">bloomington drosophila stock center</td>
			<td style="width:251px;">#24638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Narrow Vials, Tray Pack (PS)</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>&#160;# 32-109BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila Media Recipes and Methods</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td colspan="2">http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">propionic acid</td>
			<td style="width:352px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:251px;">P5561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">phosphoric acid</td>
			<td style="width:352px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:251px;">W290017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Methl 4-Hydroxybenzoate</td>
			<td style="width:352px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:251px;">H3647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Agar Agar</td>
			<td>can be acquired by any company</td>
			<td style="width:251px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">corn meal</td>
			<td>can be acquired by any company</td>
			<td style="width:251px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Grandma&#39;s molasses</td>
			<td>B&#38;G Foods, Inc</td>
			<td style="width:251px;">not indicated</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">instant dry yeast</td>
			<td>can be acquired by any company</td>
			<td style="width:251px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple way to measure alterations in reward-seeking behavior using drosophila melanogaster

Nós descrevemos um protocolo para a medição do etanol auto-administração em moscas da fruta (Drosophila melanogaster) como um proxy para mudanças nos estados de recompensa. Nós demonstramos uma forma simples de explorar o sistema de recompensa mosca, modificar experiências relacionadas a recompensa natural, e use o consumo de etanol voluntária como uma medida de mudanças nos estados de recompensa. A abordagem serve como uma importante ferramenta para estudar os neurônios e genes que desempenham um papel nas mudanças mediada por experiência de estado interno. O protocolo é composto de duas partes distintas: expor as moscas para experiências gratificantes e nonrewarding, e ensaiando o consumo voluntário de etanol como uma medida da motivação para obter uma recompensa de droga. As duas partes podem ser utilizadas de forma independente para induzir a modulação da experiência como um passo inicial para mais ensaios a jusante ou como um ensaio de alimentação de duas escolha independente, respectivamente. O protocolo não requer uma instalação complicada e, portanto, pode ser aplicada em qualquer LABORATORY com ferramentas básicas de cultura de mosca.

FPreviously, Devineni et ai. mostrou que, quando as moscas de fruta são dadas a opção de consumir alimentos contendo etanol, eles exibem uma forte preferência por alimentos contendo etanol sobre nonethanol contendo alimentos 6. Mostrado aqui estão alguns resultados representativos que obtivemos quando se examina a preferência etanol inato de moscas macho ingênuos que não foram submetidos ao protocolo de treinamento. <p class="jove_content" fo:keep-together...

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A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

Nós descrevemos um protocolo para induzir gratificante e nonrewarding experiências em moscas da fruta (Drosophila melanogaster), utilizando o consumo de etanol voluntária como uma medida de mudanças nos estados de recompensa.

Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

a-simple-way-to-measure-alterations-reward-seeking-behavior-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

8.3K visualizações.  Bar-Ilan University.  Nós descrevemos um protocolo para induzir gratificante e nonrewarding experiências em moscas da fruta (Drosophila melanogaster), utilizando o consumo de etanol voluntária como uma medida de mudanças nos estados de recompensa. 

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Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral line-widths and allows high-resolution spectra to be obtained from extracts, intact cells, cell cultures, and more importantly intact tissue to investigate relationships between metabolites and cellular processes. In vivo HRMAS 1H-MRS studies have yet to be reported in the live fruit fly Drosophila melanogaster. Drosophila, as a simpler genetic organism, allows the multiple biological functions and various evolutionarily conserved signaling pathways to be examined at the whole organism level and it is a useful model for investigating genetics and physiology. To this end, we developed and implemented an in vivo HRMAS 1H-MRS method to investigate live Drosophila at 14.1 T. Here, we outline an HRMAS 1H-MRS protocol for the molecular characterization of Drosophila with a conventional MR spectrometer equipped with an HRMAS probe. This technique is a novel, in vivo, non-destructive Drosophila metabolite measurement approach, which enables the identification of disease biomarkers and thus may contribute to novel therapeutic development.

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

This technique enables the use of high-resolution magic angle spinning proton MR spectroscopy (HRMAS 1H-MRS) for molecular characterization of live Drosophila melanogaster with a conventional 14.1 tesla spectrometer equipped with an HRMAS probe.

Espectroscopia de Ressonância Magnética de viver Drosophila melanogaster Usando Angle Spinning Magia

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral ...

Neurociência

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Único Recordings Sensillum na Insetos Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain is correlated with that strain s ethanol preference, and therefore sedation is a highly relevant measure to study the genetics of alcohol responses and drinking. We demonstrate a simple way to expose flies to ethanol and measure its intoxicating effects. The assay we describe can determine acute sensitivity, as well as ethanol tolerance induced by repeat exposure. It does not require a technically involved setup, and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A simple assay to measure the sedating effects of ethanol on Drosophila flies, based on the loss of righting reflex, is described.

Uma maneira simples para medir a sensibilidade de etanol no Flies

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Métodos de Ensaio para Drosophila Comportamento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenética estimulação do comportamento de fuga em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

A Single-fly Ensaio para comportamento de forrageamento em<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a straightforward manner. As we previously demonstrated 1, in a two-dimensional chamber, we first force the flies to form a tight group, subsequently allowing them to take their preferred distance from each other. After the flies have settled, we measure the distance to the closest neighbor (or social space), processing a static picture with free online software (ImageJ). The analysis of the distance to the closest neighbor allows researchers to determine the effects of genetic and environmental factors on social interaction, while controlling for potential confounding factors. Diverse factors such as climbing ability, time of day, sex, and number of flies, can modify social spacing of flies. We thus propose a series of experimental controls to mitigate these confounding effects. This assay can be used for at least two purposes. First, researchers can determine how their favorite environmental shift (such as isolation, temperature, stress or toxins) will impact social spacing 1,2. Second, researchers can dissect the genetic and neural underpinnings of this basic form of social behavior 1,3. Specifically, we used it as a diagnostic tool to study the role of orthologous genes thought to be involved in social behavior in other organisms, such as candidate genes for autism in humans 4.

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The effect of genes and environment on social space of Drosophila melanogaster can be quantified through a powerful but straightforward analytical paradigm. We show here different factors that can affect this social space, and thus need to be taken into consideration when designing experiments in this paradigm.

Condições que afetam Espaço Social em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

De alta resolução Quantificação do Comportamento Odor-guiada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Usando a<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

Usando Canais Linear de agarose para o Estudo<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamento larval Crawling

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.