A principal vantagem deste protocolo é que ele é menos trabalhoso e demorado do que o método tradicional de contagem de unidades formadoras de colônias para estimar o crescimento intracelular do Mycobacterium tuberculosis. Essa técnica torna mais fácil para os pesquisadores rastrear rapidamente os medicamentos aprovados pela FDA com o objetivo de reaproveitá-los como terapias direcionadas ao hospedeiro para tratar a tuberculose. O método é muito simples e direto.
O conhecimento básico das técnicas de cultura de micobactérias e células T portadoras de EO seria suficiente para seguir o protocolo passo a passo. Para começar, transfira de seis a oito mililitros de cultura micobacteriana atenuada H37Ra do frasco de T25 para um tubo de polipropileno de 15 mililitros. Centrifugar o tubo em uma centrífuga de bancada.
Depois de remover cuidadosamente o tubo, transfira o tubo para o gabinete de segurança biológica e aguarde um minuto para que as bactérias se instalem. Despeje o sobrenadante no recipiente de descarte do desinfetante. Em seguida, recapeie o tubo e suspenda as bactérias no meio restante, batendo suavemente no lado do tubo e permitindo que as bactérias se depositem por um minuto.
Adicione e misture dois mililitros de RPMI completo pré-aquecido e transfira para um tubo cônico de 50 mililitros. Para ressuspender as micobactérias, desenhe a suspensão em uma seringa de cinco mililitros equipada com uma agulha de calibre 25. Em seguida, ejete muito suavemente a parede lateral do tubo para minimizar a produção de aerossóis e repita o processo de seis a oito vezes.
Descarte a agulha e a seringa em um recipiente de objetos cortantes no armário de biossegurança. Transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros e centrífuga para abaixar quaisquer aglomerados restantes. Devolva o tubo ao armário de segurança e deixe que as bactérias se instalem por um minuto.
Transfira o 1 a 1,5 mililitros superiores do sobrenadante para um novo tubo. Rejeitar o tubo original no balde de resíduos que contém o desinfectante. Misture bem e adicione várias quantidades da suspensão micobacteriana às duas lâminas da câmara de vidro do poço e incube as lâminas por três horas a 37 graus Celsius.
Depois de pipetar para cima e para baixo três vezes para desalojar bactérias não fagocitadas, remova o meio da lâmina da câmara de vidro. Lave uma vez com dois mililitros de PBS. Descongelar as alíquotas de 4%PFA em PBS armazenadas a menos 20 graus Celsius.
Diluir a alíquota a 2%PFA e adicionar dois mililitros a cada alvéolo. Depois de incubar por 10 minutos à temperatura ambiente, remova a lâmina do armário de segurança para coloração. Descarte o PFA no recipiente de resíduos químicos PFA e lave o escorregador sob um fluxo suave de água da torneira.
Usando uma pipeta de transferência de plástico, dispense auramina suficiente para cobrir as células na lâmina e incube a lâmina por um minuto à temperatura ambiente no escuro. Lave o excesso de corante da lâmina com água da torneira e adicione o quencher por um minuto no escuro. Depois de lavar o excesso de quencher, incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente com a mancha Hoechst no escuro.
Em seguida, lave a mancha Hoechst. E depois de drenar o excesso de água, adicione uma gota de antifade e um deslizamento de cobertura. Examine a lâmina seca ao ar sob o microscópio fluorescente usando a objetiva de óleo de 100x.
As micobactérias fluorescerão em verde sob o filtro Fitz e os núcleos fluorescerão em azul sob o filtro DAPI. Conte o número de micobactérias fagocitadas por célula e a porcentagem de células infectadas para determinar o MOI. Calcule o volume de suspensão de micobactérias necessário para atingir o MOI necessário com base na área de superfície de um poço na placa.
Depois de misturar a suspensão de micobactérias, adicione o volume calculado às células em placas de 12 poços para obter o MOI desejado. Incubar a placa a 37 graus Celsius por três horas para permitir que as micobactérias sejam fagocitadas. Em seguida, remova as bactérias extracelulares lavando os poços com RPMI quente várias vezes.
Adicione 500 microlitros de tampão de lise por 10 minutos para lisar os macrófagos em um poço da amostra de três horas e colete o lisado para determinar a taxa de infecção basal. Em seguida, adicione o RPMI completo fresco e as doses de drogas necessárias, ou controle do veículo, aos poços restantes. Incubar as placas na incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por um a oito dias, dependendo do projeto do experimento.
Para determinar o tempo percentual de positividade, ou TTP, do inóculo inicial da amostra de três horas, aqueça o caldo de Middlebrook e os frascos de cultura de instrumentos à temperatura ambiente. Transfira o meio da placa de 12 poços para os tubos cônicos rotulados correspondentes e adicione 500 microlitros de tampão de lise estéril a cada poço. Após 10 minutos, raspe suavemente as células do poço com um raspador estéril e combine-as com o meio no tubo cônico apropriado.
Uma vez que o poço é lavado com 0,5 mililitros de PBS estéril e combinado com o meio e lisado, quebre os aglomerados passando suavemente cada amostra através de uma seringa de agulha de calibre 25 seis a oito vezes. Diluir a amostra em caldo MB adicionando 900 microlitros de caldo MB a 100 microlitros de amostra e repetir o processo de colheita nos momentos necessários durante a incubação. Prepare os frascos do painel de instrumentos esterilizando a tampa de borracha com álcool a 70%.
Transfira suplementos nutricionais suficientes para todas as amostras em um tubo cônico e use uma agulha e seringa para injetar 0,5 mililitros de suplemento nutricional no frasco de cultura do instrumento. Em seguida, pipete 500 microlitros da amostra diluída de um em cada 10 em um tubo de um mililitro em V-bottom. Use uma agulha e seringa para injetar os 500 microlitros de amostra nos frascos de cultura do instrumento atribuídos.
Depois de transportar cuidadosamente as garrafas do armário de biossegurança para o instrumento de carregamento, pressione o botão "loading" no sistema automatizado de detecção microbiana. Digitalize os códigos de barras em garrafas de cultura de instrumentos e coloque as garrafas na incubadora do sistema de detecção a 37 graus Celsius por até 42 dias. Leia e registre o tempo necessário para alcançar a positividade a partir da tela do instrumento e calcule a porcentagem de TTP.
Um TTP positivo indica crescimento micobacteriano. O instrumento automatizado de cultura líquida monitorou os níveis de dióxido de carbono a cada 10 minutos e calculou o TTP, que é o número de dias desde a inoculação até que as culturas sejam sinalizadas como positivas. Foi ilustrada uma relação inversa entre a PTT e os valores log(10) da UFC no inóculo inicial.
Quando o crescimento intracelular de Mycobacterium tuberculosis dentro de macrófagos determinado pela enumeração da UFC foi comparado ao método de cultura automatizada descrito, obteve-se uma correlação significativa entre os resultados. O crescimento do Mycobacterium tuberculosis foi apresentado graficamente comparando-se os valores de TTB por até oito dias após a infecção dos macrófagos com o valor inicial de PTT. Uma tendência semelhante entre UFC e cultura líquida demonstrou inibição significativa do crescimento do Mycobacterium tuberculosis em macrófagos na presença de ácido retinóico totalmente trans, ou AtRA, em solução, ou a dose equivalente de AtRA encapsulada em micropartículas de PLGA.
Um experimento dose-resposta foi realizado em células THP-1 infectadas para determinar a eficácia do antibiótico Linezolida isoladamente, ou a combinação de linezolida e interferon gama. Não foi observada interação significativa entre os fármacos. A coloração AFP nos permite usar um MOI baixo para minimizar a morte celular ao infectar macrófagos e garantir que o mesmo MOI seja usado, independentemente do tratamento usado.
Seguindo esse protocolo, os medicamentos anti-TB de chumbo podem ser identificados e estudados mais a fundo para investigar sua eficácia in vivo.
