Основным преимуществом данного протокола является то, что он менее трудоемкий и трудоемкий, чем традиционный метод подсчета колониеобразующих единиц для оценки внутриклеточного роста Микобактерий туберкулеза. Этот метод облегчает исследователям быстрый скрининг одобренных FDA лекарств с целью перепрофилирования их в качестве методов лечения туберкулеза, направленных на хозяина. Метод очень прост и понятен.
Базовых знаний о методах культивирования микобактерий и Т-клеток носителей ЭО было бы достаточно, чтобы следовать протоколу шаг за шагом. Для начала переложите от шести до восьми миллилитров ослабленной микобактериальной культуры H37Ra из колбы T25 в 15-миллилитровую полипропиленовую трубку. Центрифугирование трубки в настольной центрифуге.
После осторожного удаления трубки перенесите трубку в шкаф биологической безопасности и подождите одну минуту, пока бактерии осядут. Вылейте супернатант в контейнер для дезинфицирующего средства. Затем повторите трубку и подвешивайте бактерии в оставшейся среде, осторожно постукивая по боковой стороне трубки и позволяя бактериям оседать в течение одной минуты.
Добавьте и смешайте два миллилитра предварительно нагретого полного RPMI и переложите в коническую трубку объемом 50 миллилитров. Чтобы повторно суспендировать микобактерии, оформите суспензию в пятимиллилитровом шприце, оснащенном иглой 25 калибра. Затем очень осторожно опустите боковую стенку трубки, чтобы свести к минимуму образование аэрозоля, и повторите процесс шесть-восемь раз.
Утилизируйте иглу и шприц в контейнере для острых предметов в шкафу биобезопасности. Переложите суспензию в двухмиллилитровую микроцентрифужную трубку и центрифугу, чтобы гранулировать оставшиеся сгустки. Верните трубку в шкаф безопасности и дайте бактериям осесть в течение одной минуты.
Переложите верхние 1-1,5 миллилитра супернатанта на новую трубку. Выбросьте оригинальную трубку в ведро для отходов, содержащее дезинфицирующее средство. Хорошо перемешайте и добавьте различные количества микобактериальной суспензии в две стеклянные камеры и инкубируйте слайды в течение трех часов при 37 градусах Цельсия.
После пипетки вверх и вниз три раза, чтобы вытеснить нефагоцитозные бактерии, удалите среду из слайда стеклянной камеры. Вымойте один раз двумя миллилитрами PBS. Разморозьте аликвоты 4% PFA в PBS, хранящиеся при минус 20 градусах Цельсия.
Разбавьте аликвоту до 2% PFA и добавьте по два миллилитра в каждую лунку. После инкубации в течение 10 минут при комнатной температуре снимите горку с предохранительного шкафа для окрашивания. Выбросьте PFA в контейнер для химических отходов PFA и промойте горку под мягкой струей водопроводной воды.
Используя пластиковую передаточную пипетку, дозируйте достаточное количество аурамина, чтобы покрыть клетки на слайде, и инкубируйте слайд в течение одной минуты при комнатной температуре в темноте. Смойте лишний краситель с горки водопроводной водой и добавьте гаситель на одну минуту в темноте. Смыв излишки канцера, инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре с пятном Hoechst в темноте.
Затем смойте пятно Hoechst. А после слива лишней воды добавьте каплю антизатухания и крышку. Осмотрите высушенный на воздухе слайд под флуоресцентным микроскопом с помощью 100-кратного масляного объектива.
Микобактерии будут флуоресцировать зеленым цветом под фильтром Фитца, а ядра будут флуоресцировать синим цветом под фильтром DAPI. Подсчитайте количество фагоцитозированных микобактерий на клетку и процент инфицированных клеток для определения MOI. Рассчитайте объем микобактериальной суспензии, необходимый для достижения требуемого МВД, исходя из площади поверхности скважины в пластине.
После смешивания суспензии микобактерий добавьте расчетный объем к клеткам на 12 пластинах лунки для достижения желаемого МВД. Инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия в течение трех часов, чтобы микобактерии были фагоцитозированы. Затем удалите внеклеточные бактерии, промыв лунки теплым RPMI несколько раз.
Добавьте 500 микролитров буфера лизиса в течение 10 минут, чтобы лизировать макрофаги в одной лунке трехчасового образца, и соберите лизат для определения исходной скорости заражения. Затем добавьте свежий полный RPMI и необходимые дозы препарата или контроль транспортного средства в оставшиеся колодцы. Инкубируйте пластины в инкубаторе углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного-восьми дней, в зависимости от конструкции эксперимента.
Чтобы определить процентное время до позитивности, или ТТП, исходного инокулята трехчасового образца, нагревают отвар Миддлбрука и инструментальные бутылочки для культивирования до комнатной температуры. Переложите среду с 12-луночной пластины на соответствующие меченые конические трубки и добавьте 500 микролитров стерильного лизисного буфера в каждую лунку. Через 10 минут аккуратно соскоблите клетки из лунки стерильным скребком и соедините их со средой в соответствующей конической трубке.
После того, как лунка промыта 0,5 миллилитрами стерильного PBS и объединена со средой и лизатом, разбейте сгустки, осторожно пропуская каждый образец через шприц иглы 25 калибра шесть-восемь раз. Разбавьте образец в отваре МБ, добавив 900 микролитров бульона МБ к 100 микролитрам образца, и повторите процесс сбора урожая в требуемые моменты времени во время инкубации. Подготовьте бутылки комбинации приборов, стерилизовав резиновый колпачок 70% спиртом.
Переложите достаточное количество питательных добавок для всех образцов в коническую трубку и используйте иглу и шприц, чтобы ввести 0,5 миллилитра питательной добавки в бутылку для культуры инструмента. Затем пипетка 500 микролитров разбавленного образца один из 10 в одном миллилитре v-образной трубки. Используйте иглу и шприц, чтобы ввести 500 микролитров образца в назначенные флаконы для культуры инструмента.
После тщательной транспортировки бутылок из шкафа биобезопасности к прибору для погрузки нажмите кнопку загрузки на автоматизированной системе обнаружения микробов. Отсканируйте штрих-коды на бутылках с культурой приборов и поместите бутылки в инкубатор системы обнаружения при температуре 37 градусов Цельсия на срок до 42 дней. Прочитайте и запишите время, необходимое для достижения позитивности с экрана прибора, и рассчитайте процент TTP.
Положительный ТТП указывает на рост микобактерий. Автоматизированный прибор для культивирования жидкостей контролировал уровень углекислого газа каждые 10 минут и рассчитывал TTP, который представляет собой количество дней с момента посева до тех пор, пока культуры не будут помечены как положительные. Проиллюстрирована обратная зависимость между значениями ТТП и log(10)КОЕ в исходном инокуляте.
При сравнении внутриклеточного роста Mycobacterium tuberculosis в макрофагах, определяемого путем перечисления КОЕ, с описанным автоматизированным методом культивирования получена значительная корреляция между результатами. Рост микобактерий туберкулеза был графически представлен путем сравнения значений TTB в течение восьми дней после заражения макрофагов с исходным значением TTP. Аналогичная тенденция между КОЕ и жидкой культурой продемонстрировала значительное ингибирование роста Mycobacterium tuberculosis в макрофагах в присутствии полностью транс-ретиноевой кислоты, или AtRA, в растворе или эквивалентной дозы AtRA, инкапсулированной в микрочастицах PLGA.
Эксперимент «доза-реакция» проводился в инфицированных клетках THP-1 для определения эффективности антибиотика только Линезолида или комбинации линезолида и интерферона гамма. Значимого взаимодействия между препаратами не наблюдалось. Окрашивание АФП позволяет нам использовать низкий MOI для минимизации гибели клеток при заражении макрофагов и для обеспечения того, чтобы один и тот же MOI использовался независимо от используемого лечения.
Следуя этому протоколу, свинцовые противотуберкулезные препараты могут быть идентифицированы и дополнительно изучены для изучения их эффективности in vivo.
