이 프로토콜의 주요 장점은 결핵균의 세포 내 성장을 추정하기 위해 집락 형성 단위를 계산하는 전통적인 방법보다 노동 집약적이고 시간이 덜 많이 걸린다는 것입니다. 이 기술을 통해 연구자들은 FDA 승인 약물을 결핵 치료를위한 숙주 지시 요법으로 용도 변경하기 위해 신속하게 스크리닝 할 수 있습니다. 이 방법은 매우 간단하고 간단합니다.
마이코박테리아 및 EO 운반체 T 세포 배양 기술에 대한 기본 지식은 프로토콜을 단계별로 따르기에 충분합니다. 시작하려면 T25 플라스크에서 6-8 밀리리터의 약독 화 된 마이코 박테리아 배양 H37Ra를 15 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브로 옮깁니다. 벤치탑 원심분리기에서 튜브를 원심분리합니다.
튜브를 조심스럽게 제거한 후 튜브를 생물학적 안전 캐비닛으로 옮기고 박테리아가 정착 할 때까지 1 분 정도 기다립니다. 상청액을 소독제 폐기 용기에 붓습니다. 그런 다음 튜브를 다시 덮고 튜브의 측면을 부드럽게 두드리고 박테리아가 1분 동안 가라앉도록 하여 나머지 배지에 박테리아를 현탁시킵니다.
예열 된 완전한 RPMI 2 밀리리터를 추가하고 혼합하고 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 마이코 박테리아를 재현 탁하려면 25 게이지 바늘이 장착 된 5 밀리리터 주사기에 현탁액을 그립니다. 그런 다음 에어로졸 생성을 최소화하기 위해 튜브의 측벽 아래로 매우 부드럽게 배출하고 이 과정을 6-8회 반복합니다.
바늘과 주사기를 생물 안전 캐비닛의 날카로운 물건 용기에 폐기하십시오. 현탁액을 2밀리리터 미세 원심분리 튜브와 원심분리기로 옮겨 남은 덩어리를 펠릿으로 만듭니다. 튜브를 안전 캐비닛에 다시 넣고 박테리아가 1분 동안 가라앉도록 합니다.
상청액의 상부 1 내지 1.5 밀리리터를 새로운 튜브로 옮긴다. 소독제가 들어있는 폐기물 통에 원래 튜브를 폐기하십시오. 잘 혼합하고 다양한 양의 마이코박테리아 현탁액을 2개의 웰 유리 챔버 슬라이드에 첨가하고, 슬라이드를 섭씨 37도에서 3시간 동안 인큐베이션합니다.
포식되지 않은 박테리아를 제거하기 위해 위아래로 3회 피펫팅한 후, 유리 챔버 슬라이드에서 배지를 제거합니다. 2 밀리리터의 PBS로 한 번 씻으십시오. 섭씨 영하 20도에서 보관된 PBS에서 4%PFA의 분취량을 해동합니다.
부분 표본을 2 % PFA로 희석하고 각 웰에 2 밀리리터를 첨가하십시오. 실온에서 10분 동안 배양한 후 염색을 위해 안전 캐비닛에서 슬라이드를 꺼냅니다. PFA 화학 폐기물 용기에 PFA를 버리고 부드러운 수돗물로 슬라이드를 씻으십시오.
플라스틱 전사 피펫을 사용하여 슬라이드의 세포를 덮을 만큼 충분한 오라민을 분주하고 어두운 실온에서 1분 동안 슬라이드를 배양합니다. 수돗물로 슬라이드에서 과도한 염료를 씻어 내고 어두운 곳에서 1 분 동안 담금질을 첨가하십시오. 과량의 담금질을 씻어 낸 후, 어두운 곳에서 Hoechst 얼룩으로 실온에서 15 분 동안 배양한다.
그런 다음 Hoechst 얼룩을 씻어 내십시오. 그리고 여분의 물을 배출 한 후 페이드 방지 한 방울과 커버 슬립을 추가하십시오. 100x 오일 대물렌즈를 사용하여 형광 현미경으로 공기 건조된 슬라이드를 검사합니다.
마이코박테리아는 피츠 필터 아래에서 녹색 형광을 발하고 핵은 DAPI 필터 아래에서 파란색 형광을 발합니다. 세포당 식균된 마이코박테리아의 수와 감염된 세포의 백분율을 계산하여 MOI를 결정합니다. 플레이트에 있는 웰의 표면적을 기준으로 필요한 MOI를 달성하는 데 필요한 마이코박테리아 현탁액의 부피를 계산합니다.
마이코박테리아 현탁액을 혼합한 후 계산된 부피를 12웰 플레이트의 세포에 추가하여 원하는 MOI를 달성합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양하여 마이코박테리아가 식균될 수 있도록 합니다. 그런 다음 따뜻한 RPMI로 우물을 여러 번 씻어 세포 외 박테리아를 제거하십시오.
500 마이크로리터의 용해 완충액을 10분 동안 첨가하여 3시간 샘플의 한 웰에서 대식세포를 용해시키고, 용해물을 수집하여 기준선 감염률을 결정하였다. 그런 다음 새로운 완전한 RPMI와 필요한 약물 용량 또는 비히클 제어를 나머지 웰에 추가합니다. 실험 설계에 따라 섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터에서 플레이트를 1일에서 8일 동안 배양합니다.
3시간 샘플의 초기 접종물의 양성 시간 또는 TTP까지의 백분율을 결정하려면 Middlebrook 국물과 기기 배양 병을 실온으로 따뜻하게 합니다. 12웰 플레이트에서 해당 라벨이 부착된 원추형 튜브로 배지를 옮기고 각 웰에 500마이크로리터의 멸균 용해 완충액을 추가합니다. 10 분 후, 멸균 스크레이퍼로 웰에서 세포를 부드럽게 긁어 내고 적절한 원추형 튜브의 배지와 결합하십시오.
일단 웰이 0.5 밀리리터의 멸균 PBS로 세척되고 배지 및 용해물과 결합되면, 25 게이지 바늘 주사기를 통해 각 샘플을 6-8 회 부드럽게 통과시켜 덩어리를 끊습니다. 100 마이크로리터의 샘플에 900 마이크로리터의 MB 브로스를 첨가하여 MB 브로스에서 샘플을 희석하고, 배양 중 필요한 시점에 수확 과정을 반복한다. 고무 캡을 70 % 알코올로 멸균하여 계기판 병을 준비하십시오.
모든 샘플에 충분한 영양 보충제를 원추형 튜브로 옮기고 바늘과 주사기를 사용하여 0.5ml의 영양소 보충제를 기기 배양 병에 주입합니다. 이어서, 희석된 시료 10분의 1 500 마이크로리터를 1 밀리리터 v 바닥 튜브에 피펫팅한다. 바늘과 주사기를 사용하여 500마이크로리터의 샘플을 지정된 기기 배양 병에 주입합니다.
적재를 위해 생물 안전 캐비닛에서 기기로 병을 조심스럽게 운반 한 후 자동 미생물 검출 시스템의 로딩 "버튼을 누릅니다. 기기 배양 병의 바코드를 스캔하고 병을 섭씨 37도의 검출 시스템 인큐베이터에 최대 42일 동안 두십시오. 기기 화면에서 양성에 도달하는 데 걸린 시간을 읽고 기록하고 백분율 TTP를 계산합니다.
TTP 양성은 마이코박테리아 성장을 나타냅니다. 자동화된 액체 배양 기기는 10분마다 이산화탄소 수준을 모니터링하고 접종 후 배양이 양성으로 표시될 때까지의 일수인 TTP를 계산했습니다. 초기 접종물에서 TTP와 CFU의 log(10)값 사이의 반비례 관계가 설명되었습니다.
CFU를 열거하여 결정된 대식세포 내 결핵균의 세포내 성장을 설명된 자동 배양 방법과 비교했을 때 결과 간에 상당한 상관관계가 얻어졌습니다. 결핵균 성장은 대식세포 감염 후 최대 8일 동안의 TTB 값을 초기 TTP 값과 비교하여 그래픽으로 제시하였다. CFU와 액체 배양 사이의 유사한 경향은 용액 중 모든 트랜스 레티노산 또는 AtRA의 존재 또는 PLGA 미세입자에 캡슐화된 AtRA의 동등한 용량의 존재 하에 대식세포에서 결핵균 성장의 유의한 억제를 입증했습니다.
항생제 리네졸리드 단독 또는 리네졸리드와 인터페론 감마의 조합의 효능을 확인하기 위해 감염된 THP-1 세포에서 용량 반응 실험을 수행했습니다. 약물간에 유의 한 상호 작용은 관찰되지 않았다. AFP 염색을 통해 낮은 MOI를 사용하여 대식세포를 감염시킬 때 세포 사멸을 최소화하고 사용된 치료에 관계없이 동일한 MOI가 사용되도록 할 수 있습니다.
이 프로토콜에 따라 납 항 결핵 약물을 식별하고 생체 내 효능을 조사하기 위해 추가로 연구 할 수 있습니다.
