Estes protocolos são projetados para modelar os efeitos in vitro do uso de oxigênio suplementar no microbioma pulmonar de pacientes com fibrose cística. Esta receita de mídia é feita sob medida para espelhar a composição fisiológica da escarro para pessoas que vivem com fibrose cística. O processo de sparging introduz a capacidade de cultura em diferentes condições de oxigênio.
Alterações no meio de escarro artificial permitem imitar outras doenças pulmonares crônicas e modelar comunidades microbianas em outras condições, como diferentes concentrações de glicose em pacientes concomitantes de fibrose cística e diabetes. Uma visão geral das etapas para preparação média de escarro artificial mostra a mistura do ASCM, ASMM e ASBM preparados. O tampão de esfregões é usado para titular o pH a 6,3 e filtrar a esterilização do meio é realizada em uma sala fria em um agitador orbital.
Para começar, prepare um meio de escarro artificial adicionando 250 mililitros de ASCM ao frasco de um litro contendo ASMM. Em seguida, adicione 250 mililitros de ASBM à garrafa média. Titula o meio com um tampão de esfregões molar básico para atingir um pH de 6,3 em um papel pH.
Leve à geladeira o meio de escarro artificial a quatro graus Celsius até a filtragem. Em seguida, para iniciar o processo de filtragem, transfira 200 mililitros de meio de escarro artificial não filtrado para um sistema de filtragem de vácuo com um filtro de tamanho de poros de 0,22 micrômetros. Depois de conectar o sistema de filtragem à bomba de vácuo, ligue a bomba de vácuo e coloque a câmara em um agitador orbital, tremendo a 90 rotações por minuto em uma sala fria a quatro graus Celsius.
Altere o filtro depois que 350 mililitros de meio são filtrados para superar o problema do entupimento. Depois que uma quantidade considerável é filtrada, em um meio extra de 150 mililitros para filtração. Repita a filtragem com câmaras adicionais até que toda a mídia seja filtrada.
Visão geral da espaçamento de oxigênio demonstrando a adição de escarro do paciente ao meio de escarro artificial em uma garrafa de soro autoclaved. Em seguida, esparge a garrafa de soro selada com uma mistura de gás. Finalmente, a garrafa de soro é incubada para obter cultura Alec Watts no intervalo de 24 horas para sequenciamento meta genômico subsequente.
Para iniciar a cultura da garrafa de soro, rotule garrafas de soro autoclaved de 500 mililitros com identificadores de amostras, data e hora da inoculação e porcentagem de oxigênio alvo. Em um capô biológico, adicione 24 mililitros do meio de escarro artificial a cada garrafa de soro que está sendo configurada. Para obter um volume amostral suficiente para cada condição de cultura, se necessário, diluir a amostra com soro fisco estéril tamponado, em seguida, escória homogeneizada com uma agulha de calibre 18 e adicionar um mililitro da escarro do paciente a cada garrafa de soro.
Em seguida, usando pinças estéreis, coloque as rolhas de borracha autoclaved na parte superior de cada garrafa de soro, pressione as rolhas de borracha sem tocar na parte inferior da rolha. Depois de retirar as garrafas do capô, aplique e amasse as vedações de alumínio. Retire a peça central das focas e limpe a parte superior das garrafas com um lenço de álcool e passe o selo da garrafa através de uma chama de queimador Bunsen.
Agora conserte uma agulha estéril de calibre 18 em uma seringa de lista de êmbolo com um filtro, insira a seringa de liberação de gás afixado na garrafa primeiro. Agora conserte uma agulha estéril de calibre 18 na saída de gás do sistema e insira a agulha de saída de gás no frasco também. Encaminhe as junções T dos tanques através do monitor de oxigênio.
Após verificar a concentração de oxigênio alvo que flui através do sistema, o alvo é de aproximadamente cinco litros por minuto de fluxo de gás. Redirecione as junções T dos tanques até a saída de gás. À medida que o gás começa a fluir através do frasco de soro, preste muita atenção ao medidor de pressão, e se a pressão aumentar inesperadamente, desligue o sistema imediatamente.
Após a execução, o oxigênio atravessa a garrafa de soro por um minuto a cinco litros por minuto, as configurações permitem 10 trocas de ar e garantem que a atmosfera interna atinja a concentração desejada de 100% de oxigênio. Remova a liberação de gás, agulha calibre 18. Depois de permitir que a pressão no frasco de soro se acumule em uma atmosfera, remova imediatamente a agulha de saída de gás.
Incubar as garrafas de soro em 37 graus Celsius de agitação da incubadora a 150 rotações por minuto durante intervalos de 3, 24 horas. Alec Watts são tomados a cada intervalo de 24 horas para análise a jusante e as amostras são ressarcidos cada vez. O exemplo aqui mostra como uma cultura pode parecer antes e depois da incubação.
Os níveis de oxigênio e pH de saída foram medidos ao longo do processo de cultura para amostras de escarro mantidas a 37 graus Celsius. Com intervalos de 12 horas e 24 horas, as concentrações de oxigênio foram aproximadamente mantidas ao longo do tempo com uma queda moderada na concentração de oxigênio observada para as três condições. Os níveis de pH medidos estavam dentro da faixa fisiológica, sem alterações significativas ao longo do tempo.
A comparação da carga microbiana, diversidade e composição comunitária entre escarro não cultivado e cultivado revelou um aumento de 20 vezes na carga microbiana em escarro cultivado. Métricas de diversidade indicaram preservação da composição comunitária com diferenças globais mínimas introduzidas pelo processo cultural. A análise comparativa das 120 espécies microbianas em esputo cultivado e não cultivado foi realizada por sequenciamento meta genômico.
46 dessas espécies foram identificadas em amostras não cultivadas e cultivadas. Enquanto 35 foram identificados exclusivamente em amostras não cultivadas e 39 foram identificados exclusivamente em amostras cultivadas. Curvas de crescimento baseadas em absorventes foram geradas para patógenos pulmonares cf comuns cultivados em mídia de escarro artificial a partir de isolados de amostra de pacientes sob concentração normal de oxigênio de 21%.
Nenhuma alteração ao longo do tempo na densidade óptica em 600 nanômetros no ASM apenas o controle negativo indicou cultura livre de contaminação. Os padrões típicos de curva de crescimento observados indicando que o meio ASM pode ser usado para a geração de curvas de crescimento usando métodos ópticos. O sequenciamento metagenômico é usado aqui para descrever a composição da comunidade microbiana.
Outras técnicas como sequenciamento metatranscriômico podem ser usadas para avaliar a expressão genética ou metabolômica para avaliar a produção metabólica.
