O ensaio de proteção de enzimas permite estudar a extensão da internalização do Estafilococo áureo e sua capacidade de sobreviver dentro de células aderentes, bem como a eficácia do composto antimicrobiano. O ensaio de proteção de enzimas melhorado simplifica muito o manuseio técnico e permite recuperar bactérias internalizadas de células e células fracamente aderentes em suspensão. Demonstrando o procedimento estará Josselin Rigaill, médica médica e doutoranda do meu laboratório.
Dois dias antes do ensaio de infecção, as células epiteliais A549 seed a uma densidade de 2,0 vezes 10 para as quintas células por mililitro por poço de uma placa de 24 poços e incubar as células por 48 horas a 36 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono, até atingirem 100% de confluência. No dia do ensaio, remova e descarte o meio de cultura gasto dos três poços dedicados à contagem das células A549, e adicione um mililitro de meio completo de infecção contendo cinco microgramas por mililitro de Hoechst 33342 e um micrograma por mililitro de iodeto de propidium. Incubar as células por 30 minutos, então, usando um microscópio de fluorescência de campo largo, contar o número de células e calcular a viabilidade celular.
Para preparar a suspensão bacteriana, dispense 25 mililitros de meio completo de infecção em um tubo, e pré-ataque a 36 graus Celsius. Em seguida, ajuste a suspensão staphylococcus aureus para um OD de 0,5 em um meio completo de infecção usando um medidor de densidade celular, em seguida, prepare 20 mililitros de suspensão bacteriana para inoculação celular diluindo a cultura em um meio completo de infecção para obter um MOI de um de acordo com o número de células por poço. Em seguida, usando um plater espiral automático, determine a carga staphylococcus aureus da suspensão bacteriana diluída a ser usada para a etapa de inoculação celular, e incubar as placas de ágar por 18 a 24 horas a 36 graus Celsius.
No dia seguinte, conte o número de colônias com um contador de colônias para calcular o MOI preciso para cada cepa testada. Antes da inoculação celular, observe cada poço da placa de 24 poços por microscopia de baixa ampliação para garantir que as células estejam saudáveis e crescendo como esperado, depois remova e descarte o meio de cultura celular gasta da placa de 24 poços e adicione 500 microliters da suspensão bacteriana a cada poço contendo células 100% confluentes. Incubar as células por duas horas a 36 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.
Para quantificar as bactérias intracelulares com o ensaio de proteção enzimático melhorado, prepare o tampão de 4x lysis, 2%Triton X-100, trippsin-EDTA e estoque de lysostaphin em soluções de trabalho como mencionado no manuscrito do texto. Em seguida, prepare 6,25 mililitros de meio completo de infecção suplementado com linsstalfina adicionando seis mililitros de infecção completa de meio a 250 microliters da solução de trabalho de lysostaphin. Em seguida, adicione 250 microliters do meio completo de infecção suplementados com linfofina em cada poço e agitar suavemente a placa girando a placa à mão.
Para permitir que a linfotaphina mate as bactérias extracelulares, incubar as células por uma hora a 36 graus Celsius em dióxido de carbono de 5%, e inativar a linfotina adicionando 10 microlitradores de proteinase K a 20 microgramas por mililitro em cada poço e incubando as células por dois minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 250 microliters de tampão de 4x lysis para lise as células por choque osmótico, e incubar as células por 10 minutos a 36 graus Celsius. Após a incubação, pipeta a célula lise para cima e para baixo várias vezes para garantir que as células estejam totalmente líricas e homogeneizadas, em seguida, use um plater espiral automático para determinar a carga staphylococcus aureus de cada poço e incubar as placas de ágar por 18 a 24 horas a 36 graus Celsius.
No dia seguinte, conte o número de colônias com um contador de colônias para calcular a carga intracelular staphylococcus aureus de cada poço. A internalização de duas cepas de Staphylococcus aureus por células epiteliais A549 é retratada aqui. Utilizando o ensaio de proteção enzimática que inclui lavagens para remover a lisostaphina, as cargas intracelulares médias foram de 4,46 e 0,49 log cfu por mililitro para o tipo selvagem SF8300 e o mutante isogênico sem os genes fnbA e B, respectivamente.
Utilizando o melhor ensaio de proteção enzimática que usa proteinase K para inativar a linsstalfina, as cargas foram de 4,53 e 0,56 log cfu por mililitro, respectivamente. A atividade intracelular de vancomicina, rifampicina e levofloxacina contra Staphylococcus aureus medido usando ensaio de proteção enzimeta é retratada aqui. As cargas intracelulares médias foram de 4,57 log cfu por mililitro para controle, 4,51 para vancomicina, 3,03 para rifampicina e 2,91 para levofloxacina.
Lavagens intensivas para remover a enzima tendem a desprender as células mais infectadas, o que pode dar resultados imprecisos e apoiar o uso do protocolo melhorado. O ensaio de proteção de enzimas melhorado facilita o estudo da internalização do Staph aureus com organoide, e pode ser facilmente adaptado em sistema de triagem de alto conteúdo que é usado pela colocação
