Анализ ферментной защиты позволяет изучить степень интернализации золотистого стафилококка и его способность выживать внутри адгезивных клеток, а также эффективность антимикробного соединения. Улучшенный анализ защиты ферментов значительно упрощает техническое обращение и позволяет восстанавливать интернализованные бактерии из слабоадгезивных клеток и клеток в суспензии. Демонстрировать процедуру будет Жослен Ригайл, врач и аспирант из моей лаборатории.
За два дня до анализа инфекции засевают эпителиальные клетки А549 с плотностью от 2,0 раз 10 до пятой клетки на миллилитр на лунку из 24-луночной пластины и инкубируют клетки в течение 48 часов при 36 градусах Цельсия в 5% углекислого газа, пока они не достигнут 100% слияния. В день анализа извлеките и выбросьте отработанную питательную среду из трех скважин, предназначенных для подсчета клеток A549, и добавьте один миллилитр полной инфекционной среды, содержащей пять микрограммов на миллилитр Hoechst 33342 и один микрограмм на миллилитр йодида пропидия. Инкубируют клетки в течение 30 минут, затем, используя широкоугольный флуоресцентный микроскоп, подсчитывают количество клеток и вычисляют жизнеспособность клеток.
Чтобы приготовить бактериальную суспензию, дозируйте 25 миллилитров полной инфекционной среды в пробирке и предварительно разогрейте ее при 36 градусах Цельсия. Затем отрегулируйте суспензию золотистого стафилококка до OD 0,5 в полной инфекционной среде с помощью измерителя плотности клеток, затем подготовьте 20 миллилитров бактериальной суспензии для клеточной инокуляции, разбавляя культуру в полной инфекционной среде для достижения MOI единицы в соответствии с количеством клеток в лунке. Затем, используя автоматический спиральный пломбер, определите нагрузку золотистого стафилококка разбавленной бактериальной суспензии, которая будет использоваться для этапа посева клеток, и инкубируйте агаровые пластины в течение 18-24 часов при 36 градусах Цельсия.
На следующий день подсчитайте количество колоний с помощью счетчика колоний, чтобы рассчитать точный MOI для каждого тестируемого штамма. Перед посевом клеток понаблюдайте за каждой лункой 24-луночной пластины с помощью микроскопии с низким увеличением, чтобы убедиться, что клетки здоровы и растут, как и ожидалось, затем удалите и выбросьте отработанную питательную среду клеток с 24-луночной пластины и добавьте 500 микролитров бактериальной суспензии в каждую лунку, содержащую 100% сливающиеся клетки. Инкубируйте клетки в течение двух часов при 36 градусах Цельсия в 5% углекислого газа.
Чтобы количественно оценить внутриклеточные бактерии с улучшенным анализом защиты ферментов, подготовьте 4-кратный буфер лизиса, 2%-тритон X-100, трипсин-ЭДТА и запасы лизостафина в рабочих растворах, как указано в текстовой рукописи. Далее готовят 6,25 миллилитра полной инфекционной среды, дополненной лизостафином, добавляя шесть миллилитров полной инфекционной среды к 250 микролитрам рабочего раствора лизостафина. Затем добавьте 250 микролитров полной инфекционной среды, дополненной лизостафином, в каждую лунку и осторожно перемешайте пластину, поворачивая пластину вручную.
Чтобы позволить лизостафину убивать внеклеточные бактерии, инкубируйте клетки в течение одного часа при 36 градусах Цельсия в 5% углекислого газа, затем инактивируйте лизостафин, добавляя 10 микролитров протеиназы К по 20 микрограмм на миллилитр в каждую лунку и инкубируя клетки в течение двух минут при комнатной температуре. Затем добавьте 250 микролитров 4x буфера лизиса, чтобы лизировать клетки осмотическим шоком, и инкубируйте клетки в течение 10 минут при 36 градусах Цельсия. После инкубации пипетку клетки лизатируют вверх и вниз несколько раз, чтобы убедиться, что клетки полностью лизированы и гомогенизированы, затем используйте автоматический спиральный пломбер для определения нагрузки золотистого стафилококка каждой лунки и инкубируйте агаровые пластины в течение 18-24 часов при 36 градусах Цельсия.
На следующий день подсчитайте количество колоний с помощью счетчика колоний, чтобы рассчитать внутриклеточную нагрузку золотистого стафилококка каждой лунки. Здесь изображена интернализация двух штаммов золотистого стафилококка эпителиальными клетками A549. Используя анализ защиты ферментов, который включает промывки для удаления лизостафина, средние внутриклеточные нагрузки составили 4,46 и 0,49 log CFU на миллилитр для дикого типа SF8300 и изогенного мутанта, не имеющего генов fnbA и B, соответственно.
Используя улучшенный анализ защиты ферментов, который использует протеиназу K для инактивации лизостафина, нагрузки составили 4,53 и 0,56 log CFU на миллилитр соответственно. Здесь показана внутриклеточная активность ванкомицина, рифампицина и левофлоксацина в отношении золотистого стафилококка, измеренная с помощью ферментного защитного анализа. Средние внутриклеточные нагрузки составили 4,57 log КОЕ на миллилитр для контроля, 4,51 для ванкомицина, 3,03 для рифампицина и 2,91 для левофлоксацина.
Интенсивные промывки для удаления фермента, как правило, отделяют наиболее инфицированные клетки, что может дать неточные результаты и поддержать использование улучшенного протокола. Улучшенный анализ защиты ферментов облегчает изучение интернализации золотистого стафилококка с органоидом и может быть легко адаптирован к системе скрининга с высоким содержанием, которая используется путем установки
