Este protocolo maximiza muito o poder da microscopia como um método para rastrear a dinâmica mitocondrial dentro de células individuais durante longos períodos de aquisição. Ao contrário do lapso de tempo em um grupo fixo de células, ou em uma célula de cada vez, a normalização para uma linha de base para cada critério medido em cada célula controla a heterogeneidade entre as células. Com um microscópio equipado com plataforma automatizada e vetor viral adaptado, podemos usar este protocolo para cada tipo de células.
Comece emplacando de 20.000 a 25.000 células por centímetro quadrado em pratos multi-poços e armazene-os a 37 graus celsius sob uma atmosfera que contém 5% de dióxido de carbono para o resto do experimento. Em oito dias in vitro, adicione 0,6 gramas de pico de antígeno P24 por célula de codificação vetorial lentiviral para biosensor mitocondrial MitoTimer diluído em soro fisáfero tamponado fosfato. Aos 11 dias in vitro, realize duas lavagens com PBS estéril pré-aquecido e adicione meio de astrócito fresco sem fenol vermelho.
Avalie o sistema mitocondrial astrocítico pelo menos três a cinco dias após as infecções lentivirais com LV-G1 MitoTimer. Selecione cinco astrócitos por poço com uma rede mitocondrial expressando níveis suficientes de LV-G1 MitoTimer usando uma ampliação de 40 vezes. Tendo o cuidado de selecionar astrócitos planos e grandes o mais possível e não localizados em aglomerados de células.
Em seguida, capture imagens de fluorescência usando excitação sequencial em 490 nanômetros para o canal verde e 550 nanômetros para o canal vermelho com sinais fluorescentes verdes e vermelhos e usando uma ampliação de 150 vezes para cada coordenada. Selecione o primeiro quadro para canais vermelhos e verdes para cada sequência de imagem clicando em ND Processing e selecione quadro. Em seguida, mescle os canais vermelho e verde selecionando conversões e mesclando canal.
Para corrigir o sombreamento da imagem, selecione o pré-processamento e, em seguida, a correção de sombreamento automático. Aplique o algoritmo da bola rolando selecionando pré-processamento e bola rolando. Para gerar máscaras binárias para cada mitocôndria, selecione segmentação e limiar.
Remova todos os objetos truncados pela fronteira selecionando o processamento binário e tocando a borda. Selecione a medição e, em seguida, a área do objeto, o diâmetro do EEQ, o comprimento, a largura, a rugosidade, a circularidade ou o alongamento para medir a área da superfície, diâmetro, comprimento, largura, rugosidade, circularidade ou alongamento, respectivamente. Componha um grupo com essas medidas e renomeie-o como dados MOFO.
Em seguida, selecione a medição e selecione a intensidade média para medir as intensidades médias verde e vermelha. E proporção para medir o vermelho por razão verde. Agora, o grupo de compositores com essas medidas e renomeá-lo como dados de razão.
Por fim, exporte a tabela para um arquivo CSV selecionando referência e tabela para CSV e, em seguida, salve o script GA 3 de análise selecionando Save As.Begin abrindo o módulo de rastreamento no NIS e selecionando exibição, análise e rastreamento. Clique em definir novo ROI. Com a ferramenta de detecção automática, selecione 25 a 50 mitocôndrias na primeira imagem da sequência de imagem e, em seguida, clique na análise de ROIs detectados automaticamente.
Se necessário, exclua as faixas de ROI incorretas e exporte a tabela para um arquivo CSV. O registro manual transforma as medidas antes do processamento. Para cada análise e prazo normalizar manualmente os dados resultantes pela média obtida na aquisição de referência.
Em seguida, realize a análise estatística usando uma via de duas maneiras combinada com uma Nova. A cultura primária dos astrócitos infectados pelo LV-G1 MitoTimer exibiu redes mitocondriais equilibradas e oxidadas reduzidas com diferentes níveis de fragmentação. Antes do tratamento de peróxido de hidrogênio, os astrócitos que expressavam LV-G1 MitoTimer mostraram tamanho mitocondrial heterogêneo em várias intensidades de fluorescência verde e vermelha.
A morfologia mitocondrial das culturas de astrócito foi fragmentada após seis horas de incubação com peróxido de hidrogênio. Ficou ainda mais evidente 12 horas após o tratamento sem seus diâmetros com a redução da esfericidade. Quanto ao estado redox e à rotatividade, três horas após um tratamento de peróxido de hidrogênio, a proporção de mitocôndrias verdes aumentou em astrócitos.
Quanto à dinâmica e mobilidade três horas após o tratamento. Todos os critérios foram aumentou transitoriamente. Esta técnica é adequada para muitas questões diferentes.
Por exemplo, no contexto da doença neurodegenerativa, estamos investigando a toxicidade estrocítica de diferentes moléculas secretadas no cérebro.
