As duas técnicas de peeling demonstradas aqui isolam compartimentos subcelulares individuais da haste, e podem ajudar a revelar os importantes processos fisiológicos que ocorrem em cada compartimento especializado em hastes saudáveis e doentes. Isolar diferentes compartimentos de células de vara da retina do rato pode ser um desafio. Estas técnicas simples usam materiais de laboratório baratos e comuns para isolar de forma confiável compartimentos subcelulares de haste para análise de proteínas.
Para começar, coloque um pedaço de papel filtro em uma placa de Petri cheia de tampão Ames HEPES borbulhado com 100% de oxigênio. Em seguida, usando uma pipeta de transferência de furo largo, transfira um retângulo de retina dissecado de um rato C57 Black 6J de dois a três meses de idade. Oriente a retina particionada côncave para cima e certifique-se de que os fotorreceptores estão voltados para baixo em direção ao fundo do prato.
Em seguida, usando pinças, segure levemente os lados da retina pela metade e mova-a em cima do papel filtro. Uma vez centrada na retina, mova o papel do filtro para cima para que a retina pela metade toque no papel do filtro para criar o segmento externo da haste ou ROS para filtrar a adesão do papel. Levante cuidadosamente o papel do filtro com a retina anexada do tampão Ames HEPES.
Coloque o lado inferior do papel do filtro sobre uma toalha de papel e dab duas a três vezes para secar. Adicione uma gota de Ames HEPES na lateral do papel filtro com a retina e coloque novamente o papel filtro sobre a toalha de papel para secar. Em seguida, coloque o papel filtro com a retina de volta na placa de Petri, e usando pinças, empurre suavemente todas as bordas da retina pela metade para cima e para longe do papel filtro em todos os lados.
Descasque delicadamente a retina do papel filtro, tocando apenas o perímetro extremo da retina para preservar sua integridade estrutural. Em seguida, retire o papel filtro da placa de Petri e remova o excesso de líquido em uma toalha de papel, garantindo que o lado em contato com a retina não entre em contato com a toalha de papel. Coloque o papel filtro com a camada ROS parcial em um tubo rotulado no gelo e mantenha a retina descascada submersa no tampão Ames HEPES.
Repita o processo de descascamento desta retina pela metade aproximadamente sete a oito vezes para remover toda a camada ROS. Após cada casca, coloque o papel filtro no mesmo tubo para combinar todos os ROS isolados de uma retina pela metade. Mantenha o tubo contendo todas as cascas de papel filtro da ROS isolada no gelo para uso imediato.
Usando pinças, transfira a retina descascada para um tubo devidamente rotulado e mantenha o tubo no gelo para uso imediato. Para preparar a amostra de retina para liofilização, coloque um pedaço de papel filtro e transfira uma retina pela metade em uma placa de Petri cheia de tampão de Ringer frio. Em seguida, usando pinças, vire cuidadosamente a retina para que ela seja orientada côncave para cima e mova-a para descansar em cima do papel filtro.
Levante o papel do filtro pelas bordas para cima para que o pedaço de retina pela metade toque no papel do filtro. Continue a tirar o papel do filtro da solução de Ringer. Em seguida, coloque o lado inferior do papel filtro sobre uma toalha de papel e cuidadosamente dab duas a três vezes para remover o excesso de líquido.
Em seguida, pegue o papel filtro com pinças e adicione uma gota de ringer frio na lateral do papel filtro com a retina. Novamente, coloque o papel filtro sobre a toalha de papel para remover o excesso de líquido. Armazene cada amostra de papel de retina e filtro aderido em uma placa de Petri cheia de Ringer frio até estar pronto para congelar todas as amostras.
Em seguida, usando pinças, retire cada amostra do tampão do Ringer frio, garantindo que as pinças entrem em contato apenas com as bordas do papel do filtro, evitando a retina pela metade. Coloque o lado inferior de cada papel filtro sobre uma toalha de papel para remover o excesso de líquido. Em seguida, adicione uma gota de PBS frio na lateral do papel filtro onde a retina é aderida e dab o papel filtro sobre a toalha de papel novamente.
Coloque todos os pedaços de papel filtro na placa de Petri, e usando papel de tecido sem fiapos, afaste qualquer excesso de líquido ao redor do papel filtro. Em seguida, enrole firmemente toda a placa com papel alumínio e certifique-se de que as bordas da folha de alumínio sejam fixas e suavemente pressionadas no fundo da placa de Petri. Puna um punhado de furos de 0,1 a 0,2 milímetros na tampa da folha de alumínio.
Em seguida, usando pinças metálicas, gradualmente reduza a placa de Petri coberta de papel alumínio em nitrogênio líquido. Mantenha as amostras em nitrogênio líquido até liofilizar. Para liofilização, coloque a placa de Petri coberta de papel alumínio em um frasco de secagem congelante e conecte-a à máquina de liofilizador seguindo o protocolo do fabricante.
Lyophilize a retina por 30 minutos. Após a liofilização, colete a haste externa e interna do segmento, colocando cuidadosamente um pequeno pedaço de fita em cima da retina liofilizada e aplicando uma leve pressão com a pinça para garantir que ela se liga à camada fotorreceptora. Retire lentamente a fita e certifique-se de que tanto o ROS quanto o RIS tenham aderido à fita.
Um filme branco e fino estará presente na superfície fraturada. Este é o RIS. Para separar este RIS, coloque outro pedaço de fita e empurre a fita para baixo na superfície fraturada.
Em seguida, coloque o pedaço de fita com apenas a camada laranja-rosa em um tubo de microcentrifuuge rotulado como ROS, e pedaços de fita com a fina camada branca em outro tubo rotulado RIS. Em seguida, usando fita, colete o tecido remanescente da retina localizado no papel do filtro descascando a camada branca e grossa. Em seguida, coloque este isolado em um tubo rotulado OIS.
Se usar no mesmo dia, armazene as camadas isoladas da retina liofilizada à temperatura ambiente. Em animais adaptados ao escuro, a distribuição de GNAT1 e ARR1 coincidiu com suas distribuições conhecidas de estado escuro, onde o sinal GNAT1 era visivelmente mais forte no isolamento ROS, e o sinal ARR1 era mais robusto no isolamento ros. A quantificação dos sinais GNAT1 e ARR1 mostrou diferenças significativas entre as condições de luz escura para GNAT1 e ARR1 em amostras ROS e ROS.
Em amostras escuras e claras, g beat 5S, citocromo C e sinais de actina são excluídos das amostras ROS, demonstrando ausência de contaminação de outras camadas celulares. Além disso, o sinal beta 5L G era claramente visível nas amostras ROS. A microscopia eletrônica de varredura das superfícies da retina linofilizada intacta e descascada mostrou que, antes de descascar com fita adesiva, a superfície da retina liofilizada intacta correspondia intimamente à ros cilíndrica característica.
Após a casca da fita inicial, o ROS e o RIS pareciam ser totalmente removidos, como evidenciado pela camada nuclear uniforme presente na superfície da retina remanescente, descascada e liofilizada. As cascas de fita subsequentes removeram ris da superfície livre da camada descascada. Esta técnica também demonstrou que a imunoreatividade GRK1 foi mais intensa em amostras de ROS em retinas expostas à luz, e ausente em amostras de OIS.
Por outro lado, amostras de ROS e RIS apresentaram um sinal fraco para pkc alfa, que é comumente não detectado em ROS ou RIS por coloração de imunofluorescência. Finalmente, o peeling de fita subótimal pode produzir amostras ligeiramente contaminadas. A amostra ris foi contaminada com alguma amostra de OIS, produzindo ambas as bandas G beta 5L e G beta 5S, e um sinal alfa PKC mais alto.
Deve-se tomar cuidado ao liofilizar a retina. Se uma técnica de liofilização inadequada for usada, a retina pode derreter, tornando impossível isolar diferentes camadas subcelulares de haste por fita. O uso deste método de descascamento de fita em conjunto com o qRT-PCR permitiu a separação de transcrições fotorreceptoras do resto da retina.
