1. A dissociação de células <ol><li> Um fluxograma descrevendo o protocolo é mostrado é a Figura 1. Para obter os números de catálogo dos reagentes específicos utilizados ao longo deste protocolo, consulte a Tabela 1. Dissecar a retina num banho de PBS. Durante a dissecção, é melhor para remover o vítreo e da lente desde mantendo-os com a retina pode impedir a dissociação. Nem sempre é criticamente importante para remover todo o epitélio pigmentado da retina (RPE) e, em alguns casos, pode ser impossível de removê-la completamente. No entanto, para as experiências de células únicas de perfis de fotorreceptores, o RPE deve ser removido. A falha para remover o RPE pode levar à contaminação dos perfis da haste de células com RPE genes expressos. Isto é provavelmente devido à ligação entre os fotorreceptores e do RPE. Para a dissociação, inteiros adultos retinas de murino são incubadas a 37 ° C durante 10 min em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 20uL activado papaína, 20 mM de cisteína uL 25 em 5 mM de EDTA, e 360 ​​uL da solução de Hank (HBSS) suplementada com 10 mM de HEPES. Dicas filtro de ponta de pipeta são usadas para todas as etapas de todo o protocolo para minimizar a contaminação potencial. A concentração de papaína e do tempo de incubação pode variar de acordo com a idade e da natureza do tecido. Por exemplo, para dissociar o desenvolvimento de retinas isoladas no dia pós-natal 0 (P0), incubar a retina em 10 uL activado papaína, 10 Cisteína mM uL 25 em 5 mM de EDTA, e 380 uL de Hank Solução Salina Equilibrada (HBSS) suplementada com 10 mM de HEPES durante 10 min a 37 ° C. Retinas de diferentes espécies também exigir condições ligeiramente diferentes. Retinas de galinha são mais finas do que a maioria das retinas de ratos em estágios de desenvolvimento. Usando 10 uL activado papaína, 10 mM de cisteína uL 25 em 5 mM de EDTA, e solução de Hank 380 uL de (HBSS) suplementado com HEPES 10 mM durante 5 min a 37 ° C é suficiente para dissociar tstas retinas. </li><li> Bata levemente o tubo para retirar as células se estabeleceram, em seguida, triturar suavemente 10-20 vezes com uma pipeta p1000. Incubar durante um adicional de 10 min a 37 ° C, se grandes aglomerações de tecido persistir e depois re-triturar 10-20 vezes. </li><li> Adicionar 5 ul de DNase I (10 U / ul) e incubar durante 5 min à temperatura ambiente. Triturar suavemente com uma pipeta p1000. O número exacto de vezes terá de ser determinada empiricamente, mas geralmente situa-se entre 10-20. </li><li> Centrifugar numa centrífuga de bancada a 3000 rpm durante 3 min Remover o sobrenadante, deixando 100-200 uL de líquido na parte inferior, e toque no tubo para desalojar o sedimento. Adicionar 1 ml de HBSS e ressuspender o sedimento com trituração suave. Tocando o tubo é crítica aqui simplesmente como ressuspender o pellet com lisar muitas das células da retina. Isto é especialmente verdade com adultos retinas de ratinho. </li><li> Centrifugar a 3000 rpm durante 3 min Remover cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender em 450 ul de PBS contering BSA a 0,1%. É importante remover o máximo de sobrenadante quanto possível para minimizar a presença de ARNm a partir de células lisadas e quaisquer produtos da dissociação que poderiam inibir reacções futuras. </li></ol> 2. Coleta de células individuais <ol><li> Preparar dois pratos 6 cm contendo 5 ml de PBS suplementado com BSA a 0,1%. Placa as células dissociadas em um único prato e permitem que as células que se contentar com pelo menos 5 min. A densidade de células utilizado depende em grande medida da natureza das células individuais a ser perfilados. Por exemplo, para as células muito raros marcadas com um marcador fluorescente, tais GFP um, inteiros retinas dissociadas são plaqueadas em um único prato 6 cm. Para as células que são um pouco mais abundante, menos células são inicialmente semeadas a tornar mais fácil para colher um (ou muito perto de um) da célula com o primeiro micropipeta. </li><li> Colocar a placa de células dissociadas sobre um microscópio invertido. Usamos o modelo IMT-2 do Olimpo. Usando micropipetas que foram tiradas de uma fine ponta (diâmetro interno 0,5 mm, diâmetro exterior 1,04 milímetros) (Figura 2) e, juntamente com um tubo de aspiração, colher uma única célula. As células facilmente entram na micropipeta quando é colocado perto deles no prato. É crítico que o tubo de aspiração é nem muito longo nem demasiado curto para a distância para a fase associado com o microscópio invertido (Os tubos aspirador que usamos com o nosso microscópio invertido são 38,1 cm de comprimento). Se o tubo for demasiado longo, as células não podem ser expulsos eficientemente a partir da micropipeta para dentro do tubo de recolha. A principal razão, usamos o velho microscópio IMT-2 modelo invertido é que encontramos tem a distância ideal para o estágio para nossos tubos de aspirador de montagem. Depois de entrar na micropipeta, a célula (ou células) é expelido para uma segunda placa (placa de lavagem) para garantir que uma e apenas uma célula é colhido para o perfil de expressão do gene. Na segunda placa é muitas vezes necessário para remover as células estranhas ou com uma micropipeta novoou mover a célula de interesse para uma localização diferente para assegurar que apenas uma única célula entra na micropipeta. </li><li> Quando uma célula individual está completamente isolado a partir de células vizinhas, usar uma micropipeta nova para aspirar a célula de interesse, como na seção 2.2 e, em seguida, expulsá-lo diretamente em um tubo de 0,2 ml PCR contendo 4,5 ul de tampão de lise celular. A célula é expelido para o lado do tubo, tendo cuidado para não romper a ponta da micropipeta para dentro do tubo. As amostras podem ser fiado rapidamente numa microcentrífuga de bancada para imergir a célula em tampão de lise. Esta rotação é geralmente feito depois de cada célula 5 e, em seguida, novamente no final do collection.Tubes contendo células individuais em tampão de lise deve ser mantido em gelo durante a duração do isolamento única célula. Para melhores resultados, as células individuais são coletados dentro de uma janela de duas horas pós-dissociação. Após este tempo, é melhor para passar para a etapa de transcrição reversa desde o tempo adicional foi observed para aumentar as chances de degradação do RNA. </li></ol> 3. Transcrição reversa <ol><li> Resumidamente girar as amostras em um minicentrifuge de bancada para assegurar que todas as células individuais são imersos no tampão de lise celular. Para promover a lise das células, incubar a amostra a 70 ° C durante 90 seg. num termociclador. Imediatamente colocar os tubos de volta em gelo. </li><li> Deixar os tubos em gelo durante 2 min. Para todas as adições de reagentes, usar pontas de filtro-ponteira para evitar contaminação. Para realizar a transcrição reversa, adicionar 0,33 uL Superscript III (200 U / ul), 0,05 ul de ARNase Inibidor (40 U / ul), e 0,07 ul de T4 gene 32 de proteína. Incubar a mistura de reacção durante 50 min a 50 ° C num termociclador. Inactivar a enzima a 70 ° C durante 15 min e colocar no gelo. </li><li> Para remover o iniciador livre, adicionar 0,1 Tampão Exonuclease ul (10X), 0,8 ul dH 2 0 (grau de biologia molecular), e 0,1 ul Exonuclease I (20 U / ul). Incubar a 37 ° C durante 30 min emum termociclador. Inactivar a enzima por incubação da reacção a 80 ° C durante 25 min e, em seguida, colocando os tubos em gelo. </li></ol> 4. Rejeitos e Single-Cell PCR <ol><li> Adicionar 6 uL da mistura de reacção tailing e usar um termociclador a incubar a amostra a 37 ° C durante 20 min, 70 ° C durante 10 min, e mantenha a 4 ° C </li><li> Adicionar 10 ul da amostra de cauda para a mistura de reacção de PCR e realizar a síntese da segunda cadeia e amplificação por PCR usando as seguintes condições: <ol><li> 95 ° C durante 2 min </li><li> 37 ° C durante 5 min </li><li> 72 ° C durante 16 min </li><li> 93 ° C durante 40 seg </li><li> 67 ° C durante 1 min </li><li> 72 ° C durante 6 min, a adição de 6 segundos por ciclo </li><li> Vá para a etapa 4 34 vezes </li><li> 72 ° C durante 10 min </li><li> Mantenha a 4 ° C </li></ol></li></ol> 5. Rotulagem de chips Affymetrix <ol><li> Ug rótulo 10-20 de ADNc (a concentração do resultado de ADNc amplificadoing a partir de uma única célula é usualmente ~ 1 ug / uL) para se obter um sólido de hibridação em microarrays Affymetrix. Primeiro, o fragmento de ADNc por adição de 10-20 ul do ADNc de uma única célula de 8 uL 1X One-Phor-All tampão e 1 uL de diluídos (1:10 em 1X One-Phor-All tampão) DNaseI em um 80 uL reacção. Incubar em um termociclador de 13 min a 37 ° C. Inactivar a ADNase I durante 15 min a 100 ° C e colocar em gelo. </li><li> Adicionar 20 ul de tampão TdT 5X, 2,5 Biotina uL N6-ddATP (Enzo Biosciences), e 1 uL TdT (diluído 1:08 em tampão de TdT). </li><li> Incubar durante 90 min a 37 ° C, em seguida, 5 min a 65 ° C. Armazenar a -20 ° C ou hibridizar imediatamente a um microarray Affymetrix. A hibridação é realizada utilizando protocolos padrão Affymetrix. </li></ol> 6. Os resultados representativos Para avaliar a qualidade do ul, ADNc 10 da amostra de cDNA foi carregado num gel de agarose a 1%. O cDNA é principalmente julgado por o intervalo de tamanho (500-2000 pb)e da intensidade da mancha de ADNc (Figura 1 e Figura 3a). No gel representado na Figura 1, cada outra pista mostra uma mancha de cDNA a partir de células da retina isolado E16.5. As pistas entre mostram os esfregaços resultantes quando os meios apenas é aspirado para dentro da agulha e depositado dentro do tubo de PCR. Estas faixas nunca são completamente desprovidos de um esfregaço de fraco, mas eles não mostram quaisquer resultados quando iniciadores gene-PCR específicos são utilizados para amplificar os genes a partir deles. Além disso, a intensidade da mancha de cDNA pode variar um pouco (comparar com a figura 1 e figura 3a). Nas pistas Figura 3A a, f, g, eh conter robustos esfregaços de cDNA enquanto as pistas b, c, d, ee são consideravelmente menos robusto. Gene-PCR específica é usado como um ecrã secundário da qualidade do cDNA a partir de uma única célula. Os cDNAs na Figura 3 foram isolados a partir fluorescentes células ganglionares da retina e eram Tested utilizando iniciadores de PCR para a células ganglionares da retina marcadores Brn3b e Pax6. Para este ensaio, 1 uL do cDNA foi submetido a PCR para 30 ciclos. Em tempo real PCR quantitativo seria um ensaio preferível, mas pode ser proibitivamente caro e não é necessário para meramente avaliar a qualidade de cDNA. Todos os 8 das células individuais testou positivo para Brn3b e 6 8 para fora Pax6 (Figura 3b). Mesmo as manchas de cDNA que eram menos robustos bandas produzidas para Brn3b e Pax6. Apesar destes resultados da PCR, é nossa experiência que esfregaços de cDNA, tais como aqueles em pistas b, c, d, ee não produzem hibridações robustos em matrizes Affymetrix e são geralmente evitados. Gene PCR específica para o marcador de fotorreceptores Crx foi utilizado para determinar o nível de contaminação nos cDNAs única célula (Figura 3b). Um marcador de fotorreceptores foi escolhido porque estas células formam a maioria da retina (~ 70%) e, portanto, qualquer lise celular que ocorreu seria mais provável envolver haste photoreceptors. Houve apenas uma quantidade fraco do presente Crx nestas preparações de ADNc, mesmo após 30 ciclos de PCR. Finalmente, esta tela baseado em PCR pode ser utilizado para começar a determinar quais os subconjuntos de um tipo particular de célula dos cDNAs foram derivadas de antes sujeitando-os a um perfil de microarray completa. Isto pode ajudar a dar prioridade as células que são perfiladas, como este é o passo mais caro do processo. Por exemplo, foram identificados os subconjuntos de células ganglionares da retina por rastreio-los para a presença do gene Tachykinin1 (Figura 3b). A partir do ecrã baseado em PCR pequeno, particular as células individuais são escolhidos e as suas cDNAs hibridado com uma microarray Affymetrix. Os dados de microarrays é comparado e padrões podem ser descobertos, utilizando algoritmos de agrupamento padrão. Heatmaps, tais como na Figura 4, são geradas para representar graficamente os dados. Existem duas principais conclusões sobre os dados de célula única de perfil na Figura4. Primeiro, os genes expressos em tipos celulares específicos são encontrados quase exclusivamente nos tipos de células após o protocolo única célula é executada. Na maioria dos casos em que genes marcadores de um tipo de célula são encontrados também em um segundo tipo de célula, tal como a observação de que células bipolares expressar algumas &quot;rod&quot; genes em níveis mais baixos, esta expressão no tipo de célula segundo é prontamente confirmada por quer in situ hibridação ou de coloração de anticorpos. Em segundo lugar, no amácrinas mais diversificada e perfis de células ganglionares, a heterogeneidade da expressão do gene é imediatamente aparente. Pou4f1 só é expressa em cerca de 1/4 das células ganglionares em desenvolvimento, enquanto que Nr4a2 e Scube2 são dois exemplos de genes heterogeneamente expressas em diferentes células amácrinas. Na verdade, os genes mostrados na heatmap são apenas uma pequena amostra como várias centenas de genes foram identificados e confirmado como marcadores de células ganglionares de desenvolvimento ou como marcadores de diferentes populações de células amácrinas 2,4. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxograma do método de célula única de perfil. Retinas Primeiro são isolados e dissociados em células individuais usando papaína. Em segundo lugar, as células individuais são colhidas com uma agulha de vidro puxado e depositado em tubos de PCR. As células são lisadas eo cDNA amplificado utilizando transcrição inversa seguida por PCR. A qualidade de ADNc resultante é avaliada com um gel de agarose, tais como a mostrada. Após a escada de DNA na pista em primeiro lugar, as pistas mostram esfregaços de cDNA a partir de células individuais (indicado pelos parênteses vermelhos) alternando com produtos de amplificação a partir de controlos de multimédia. Esfregaços desta qualidade (colchetes vermelhos) são cruzados para microarrays Affymetrix. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig2.jpg" /> Figura 2. Fotografias das agulhas e conjunto de tubo de aspiração. Células individuais são isolados utilizando a acção capilar de umapuxado vidro micropipeta (diâmetro interno 0,5 mm, diâmetro exterior 1,04 milímetro) e são transferidos pela pressão de sopro para o aspirador. É importante que o tubo de aspiração é tanto tempo suficiente para manipular facilmente e suficientemente curto para fiavelmente descarregar células individuais. Um close-up do tubo capilar puxado para dentro de uma agulha é mostrado em B. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig3.jpg" /> Figura 3. Exemplo representativo de esfregaços de células únicas de cDNA e PCRs de genes específicos. Para determinar a qualidade da célula única de ADNc após amplificação, 10 uL de cada amostra única célula foram executados em um gel de agarose a 1%, juntamente com um controlo negativo (A). Uma mancha deve aparecer entre 500-2000 pb. Rastreio baseado em PCR adicional para genes específicos pode ajudar a identificar / confirmar o tipo de célula que foi isolado ea quantidade de contaminação presente na amostra (B). Primers específicos para o de células ganglionares da retina marcadores Brn3be Pax6 foram testados para confirmar a identidade destas células (linhas 1 e 2). Para avaliar a quantidade de contaminação de fotorreceptores na preparação, primers específicos para o marcador de fotorreceptores Crx foram utilizados (linha 3). Subconjuntos de células ganglionares também podem ser identificadas através do rastreio de marcadores, tais como Tachykinin1 (linha 4). <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig4.jpg" /> Figura 4. Expressão única célula de genes marcadores. Os resultados para os genes seleccionados microarray expressas em 22 distintos de células individuais são mostrados em um formato heatmap. As intensidades dos sinais microarray foram dimensionadas para corresponder com a intensidade da cor vermelha. Negro indica a ausência de sinal no microarray. As células ganglionares da retina (RGC) precursores mostrados foram isoladas a partir de pontos de tempo embrionárias, enquanto que as outras células foram isoladas a partir de retinas de adultos.

<ol>
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U.S.A. 106, 9495-9500 (2009).</li><li>Roesch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptome+of+retinal+Muller+glial+cells.">The transcriptome of retinal Muller glial cells.</a> J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (2008).</li><li>Ramos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+diversity+in+transcriptional+profiles+of+single+hematopoietic+stem+cells.">Evidence for diversity in transcriptional profiles of single hematopoietic stem cells.</a> PLoS Genet. 2, e159 (2006).</li><li>Chiang, M. K., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcript+analysis+of+pancreas+development.">Single-cell transcript analysis of pancreas development.</a> Dev. 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Não há conflitos de interesse declarados.

Um número cada vez maior de estudos estão revelando variabilidade célula-célula robusta em populações que se acreditava serem mais homogêneas no que diz respeito à sua expressão gênica 6,8. Em pelo menos um exemplo, este gene expressão &quot;ruído&quot; tem sido demonstrado que desempenham uma função importante biológica 13. Diferenças de expressão gênica entre as células individuais são obscurecidos usando os tradicionais métodos de todo tecido. Essas experiências geram o per...

Reaction mixtures:
Cell Lysis buffer
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &mu;</td>
			<td>10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.23 &mu;l</td>
			<td>10% NP-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.23 &mu;l</td>
			<td>0.1M DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05 &mu;l</td>
			<td>RNase Inhibitor (40 U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05 &mu;l</td>
			<td>SUPERase-In (20U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.13 &mu;l</td>
			<td>Modified Oligo d(T) primer 
			(TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.09 &mu;l</td>
			<td>dNTPs (2.5 mM each)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.27 &mu;l</td>
			<td>dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tailing Reaction Mixture
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.18 &mu;l</td>
			<td>100 mM dATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 &mu;l</td>
			<td>10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.62 &mu;l</td>
			<td>dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 &mu;l</td>
			<td>TdT (400 U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 &mu;l</td>
			<td>RNase H (2 U/&mu;l)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
PCR Reaction Mixture
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 &mu;l</td>
			<td>10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l</td>
			<td>2.5 mM dNTPs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &mu;l</td>
			<td>Modified Oligo d(T) primer (10 &mu;g/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &mu;l</td>
			<td>Ex-Taq HS Polymerase (5U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>68.8 &mu;l</td>
			<td>dH2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
10X One-Phor All Buffer
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M</td>
			<td>Potassium acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M</td>
			<td>Tris acetate (pH 7.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M</td>
			<td>Magnesium acetate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Solutions:
10X Phosphate buffered saline (1 liter)
80g NaCl 
2g KCl 
14.4 g Na2PO4 
2.4 g KH2PO4 
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical needle puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 750</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0674</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assembly</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning filter tips (100-1000 &mu;l</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-265</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank's balanced salt solution (1X)</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>10-508F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer (1M)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>091688449</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04716728001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS03126</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>AM2682</td>
			<td>These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase-In</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>AM2694</td>
			<td>These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Oligo d(T) primer (gel purified)</td>
			<td>Oligos ETC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 gene 32 protein</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0300L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TdT</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3 333 574</td>
			<td>As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase H</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18021-014</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex-Taq HS Polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR006A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin N6-ddATP</td>
			<td>Enzo Biosciences</td>
			<td>42809</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Specific reagents and equipment.

single-cell profiling of developing and mature retinal neurons

Populações altamente especializados, mas muito pequena de células desempenham um papel importante em muitos tecidos. A identificação de célula do tipo marcadores específicos e programas de expressão do gene para subconjuntos de células extremamente raras tem sido um desafio usando padrão de tecido todo de abordagens. Perfilamento gene expressão de células individuais permite um acesso sem precedentes para tipos de células que compreendem apenas uma pequena percentagem do tecido total de 1-7. Além disso, esta técnica pode ser usado para examinar os programas de expressão génica que são transitoriamente expressa em pequenos números de células durante dinâmicas transições de desenvolvimento 8. Este problema surge da diversidade celular repetidamente no sistema nervoso central (CNS) onde as ligações neuronais pode ocorrer entre as células bastante diversas 9. O número exacto de tipos de células distintas não é conhecida com precisão, mas estima-se que pode haver até 1000 tipos diferentes no i córtextself 10. A função (s) de complexos circuitos neurais podem contar com alguns dos tipos raros neuronais e os genes se expressam. Através da identificação de novos marcadores e ajudando a molecularmente classificar neurónios diferentes, a abordagem de uma única célula é particularmente útil na análise de tipos de células no sistema nervoso. Pode também ajudar a elucidar os mecanismos de desenvolvimento neural, identificando genes diferencialmente expressos e vias de genes durante os estágios iniciais de desenvolvimento neuronal progenitor. Como um tecido, de fácil acesso simples com a diversidade considerável neuronal, a retina vertebrado é um sistema modelo excelente para estudar os processos de desenvolvimento celular, diferenciação neuronal e diversificação neuronal. No entanto, como em outras partes do SNC, esta diversidade celular pode apresentar um problema para determinar os caminhos genéticos que levam progenitores da retina de adotar um destino célula específica, especialmente dado que os bastonetes compõem a maria da população total de células da retina 11. Relatamos aqui um método para a identificação dos transcritos únicos expressos em células da retina (Figura 1). A técnica de perfis de célula única permite a avaliação da quantidade de heterogeneidade presente em diferentes populações celulares da retina 2,4,5,12. Além disso, este método tem revelado uma série de novos genes candidatos que podem desempenhar um papel (s) no destino da célula de tomada de decisão processos que ocorrem em subconjuntos de células progenitoras da retina 8. Com alguns ajustes simples para o protocolo, esta técnica pode ser utilizada para muitos tecidos diferentes e tipos de células.

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Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Um método para o isolamento de um único células da retina e amplificação subsequente dos seus ADNc é descrito. Unicelulares Transcritômica revela o grau de heterogeneidade celular presente num tecido e descobre genes novo marcador de populações de células raras. O protocolo que acompanha pode ser ajustado para se adequar muitos tipos de células diferentes.

De uma única célula perfil de imaturos e maduros neurônios da retina

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

single-cell-profiling-of-developing-and-mature-retinal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K visualizações.  Iowa State University. Um método para o isolamento de um único células da retina e amplificação subsequente dos seus ADNc é descrito. Unicelulares Transcritômica revela o grau de heterogeneidade celular presente num tecido e descobre genes novo marcador de populações de células raras. O protocolo que acompanha pode ser ajustado para se adequar muitos tipos de células diferentes.

Vídeo: Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Neurociência

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, difficult to separate and also not easily identified by their morphology. Thus, it is often difficult to analyze gene expression in a specific neuron type. Here we document a procedure that combines whole-cell patch clamp recording techniques with single-cell reverse transcription polymerase chain reaction (scRT-PCR) to profile mRNA expression in different types of neurons in the substantial nigra. Electrophysiological techniques are first used to record the neurophysiological and functional properties of individual neurons. Then, the cytoplasm of single electrophysiologically characterized nigral neurons is aspirated and subjected to scRT-PCR analysis to obtain mRNA expression profiles for neurotransmitter synthesis enzymes, receptors, and ion channels. The high selectivity and sensitivity make this method particularly useful when immunohistochemistry can not be used due to a lack of suitable antibody or low expression level of the protein. This method is also applicable to neurons in other brain areas.

Neurons are first characterized electrophysiologically. Then the cytoplasm from the recorded neuron is aspirated and subjected to reverse transcription-PCR analysis to detect the expression of mRNAs for neurotransmitter synthesis enzymes, ion channels, and receptors.

Perfil de tensão-gated Expressão mRNA canais de potássio em neurônios da substância negra usando uma única célula RT-PCR Técnicas

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic transmission. Increasing evidence indicates that gap junctions not only permit electrical current flow and synchronous activity between interconnected or coupled cells, but that the strength or effectiveness of electrical communication between coupled cells can be modulated to a great extent1,2. In addition, the large internal diameter (~1.2 nm) of many gap junction channels permits not only electric current flow, but also the diffusion of intracellular signaling molecules and small metabolites between interconnected cells, so that gap junctions may also mediate metabolic and chemical communication. The strength of gap junctional communication between neurons and its modulation by neurotransmitters and other factors can be studied by simultaneously electrically recording from coupled cells and by determining the extent of diffusion of tracer molecules, which are gap junction permeable, but not membrane permeable, following iontophoretic injection into single cells. However, these procedures can be extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural tissue.
Numerous studies on electrical synapses and the modulation of electrical communication have been conducted in the vertebrate retina, since each of the five retinal neuron types is electrically connected by gap junctions3,4. Increasing evidence has shown that the circadian (24-hour) clock in the retina and changes in light stimulation regulate gap junction coupling3-8. For example, recent work has demonstrated that the retinal circadian clock decreases gap junction coupling between rod and cone photoreceptor cells during the day by increasing dopamine D2 receptor activation, and dramatically increases rod-cone coupling at night by reducing D2 receptor activation7,8. However, not only are these studies extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural retinal tissue, but it can be difficult to adequately control the illumination conditions during the electrophysiological study of single retinal neurons to avoid light-induced changes in gap junction conductance.
Here, we present a straightforward method of determining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons under different illumination conditions and at different times of the day and night. This cut-loading technique is a modification of scrape loading9-12, which is based on dye loading and diffusion through open gap junction channels. Scrape loading works well in cultured cells, but not in thick slices such as intact retinas. The cut-loading technique has been used to study photoreceptor coupling in intact fish and mammalian retinas7, 8,13, and can be used to study coupling between other retinal neurons, as described here.

An easy and convenient method to determine the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons is described. This technique enables one to investigate the function of the electrical synapses between neurons in the intact retina under different illumination conditions and at different times of the day and night.

Cut-loading: Uma ferramenta útil para examinar a extensão da Gap Coupling Tracer junção entre neurônios da retina

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

Gravações Whole-cell simultâneas de fotorreceptores e os neurônios de segunda ordem em um anfíbio Retinal Slice Preparação

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Gravação Light-provocou respostas pós-sinápticos nos neurônios em Dark-adaptados, Preparações da retina do rato fatia usando técnicas Grampo patch

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

Single-cell RNA-Seq de subgrupos definidos de células de gânglio retiniano

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Isolamento dos núcleos de adultos da medula espinhal para a sequenciação do ARN de Single-núcleo maciçamente paralelo

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing platforms process all input cells indiscriminately. Sometimes, fluorescence-activated cell sorting (FACS) is used upstream to isolate a specifically labeled population of interest. A limitation of FACS is the need for high numbers of input cells with significantly labeled fractions, which is impractical for collecting and profiling rare or sparsely labeled neuron populations from the mouse brain. Here, we describe a method for manually collecting sparse fluorescently labeled single neurons from freshly dissociated mouse brain tissue. This process allows for capturing single-labeled neurons with high purity and subsequent integration with an in vitro transcription-based amplification protocol that preserves endogenous transcript ratios. We describe a double linear amplification method that uses unique molecule identifiers (UMIs) to generate individual mRNA counts. Two rounds of amplification results in a high degree of gene detection per single cell.

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

This protocol describes the manual sorting procedure to isolate single fluorescently labeled neurons followed by in vitro transcription-based mRNA amplification for high-depth single-cell RNA sequencing.

Sequenciação do ARN de célula única de neurônios fluorescente etiquetadas do Mouse usando a classificação Manual e duplo In Vitro a transcrição com contagens absolutas sequenciamento (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

Tempo-lapso de imagem ao vivo e quantificação da dinâmica da filial dendrítica rápida no desenvolvimento de neurônios de Drosophila

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a single-cell electroporation technique that maximizes the efficiency (~80%) of in vitro gene transfection in excitatory and class-specific inhibitory neurons in mouse organotypic hippocampal slice culture. Using large glass electrodes, tetrodotoxin-containing artificial cerebrospinal fluid and mild electrical pulses, we delivered a gene of interest into cultured hippocampal CA1 pyramidal neurons and inhibitory interneurons. Moreover, electroporation could be carried out in cultured hippocampal slices up to 21 days in vitro with no reduction in transfection efficiency, allowing for the study of varying slice culture developmental stages. With interest growing in examining the molecular functions of genes across a diverse range of cell types, our method demonstrates a reliable and straightforward approach to in vitro gene transfection in mouse brain tissue that can be performed with existing electrophysiology equipment and techniques.

Presented here is a protocol for single-cell electroporation that can deliver genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice culture ages. Our approach provides precise and efficient expression of genes in individual cells, which can be used to examine cell-autonomous and intercellular functions.

Eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...