1. A dissociação de células <ol><li> Um fluxograma descrevendo o protocolo é mostrado é a Figura 1. Para obter os números de catálogo dos reagentes específicos utilizados ao longo deste protocolo, consulte a Tabela 1. Dissecar a retina num banho de PBS. Durante a dissecção, é melhor para remover o vítreo e da lente desde mantendo-os com a retina pode impedir a dissociação. Nem sempre é criticamente importante para remover todo o epitélio pigmentado da retina (RPE) e, em alguns casos, pode ser impossível de removê-la completamente. No entanto, para as experiências de células únicas de perfis de fotorreceptores, o RPE deve ser removido. A falha para remover o RPE pode levar à contaminação dos perfis da haste de células com RPE genes expressos. Isto é provavelmente devido à ligação entre os fotorreceptores e do RPE. Para a dissociação, inteiros adultos retinas de murino são incubadas a 37 ° C durante 10 min em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 20uL activado papaína, 20 mM de cisteína uL 25 em 5 mM de EDTA, e 360 ​​uL da solução de Hank (HBSS) suplementada com 10 mM de HEPES. Dicas filtro de ponta de pipeta são usadas para todas as etapas de todo o protocolo para minimizar a contaminação potencial. A concentração de papaína e do tempo de incubação pode variar de acordo com a idade e da natureza do tecido. Por exemplo, para dissociar o desenvolvimento de retinas isoladas no dia pós-natal 0 (P0), incubar a retina em 10 uL activado papaína, 10 Cisteína mM uL 25 em 5 mM de EDTA, e 380 uL de Hank Solução Salina Equilibrada (HBSS) suplementada com 10 mM de HEPES durante 10 min a 37 ° C. Retinas de diferentes espécies também exigir condições ligeiramente diferentes. Retinas de galinha são mais finas do que a maioria das retinas de ratos em estágios de desenvolvimento. Usando 10 uL activado papaína, 10 mM de cisteína uL 25 em 5 mM de EDTA, e solução de Hank 380 uL de (HBSS) suplementado com HEPES 10 mM durante 5 min a 37 ° C é suficiente para dissociar tstas retinas. </li><li> Bata levemente o tubo para retirar as células se estabeleceram, em seguida, triturar suavemente 10-20 vezes com uma pipeta p1000. Incubar durante um adicional de 10 min a 37 ° C, se grandes aglomerações de tecido persistir e depois re-triturar 10-20 vezes. </li><li> Adicionar 5 ul de DNase I (10 U / ul) e incubar durante 5 min à temperatura ambiente. Triturar suavemente com uma pipeta p1000. O número exacto de vezes terá de ser determinada empiricamente, mas geralmente situa-se entre 10-20. </li><li> Centrifugar numa centrífuga de bancada a 3000 rpm durante 3 min Remover o sobrenadante, deixando 100-200 uL de líquido na parte inferior, e toque no tubo para desalojar o sedimento. Adicionar 1 ml de HBSS e ressuspender o sedimento com trituração suave. Tocando o tubo é crítica aqui simplesmente como ressuspender o pellet com lisar muitas das células da retina. Isto é especialmente verdade com adultos retinas de ratinho. </li><li> Centrifugar a 3000 rpm durante 3 min Remover cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender em 450 ul de PBS contering BSA a 0,1%. É importante remover o máximo de sobrenadante quanto possível para minimizar a presença de ARNm a partir de células lisadas e quaisquer produtos da dissociação que poderiam inibir reacções futuras. </li></ol> 2. Coleta de células individuais <ol><li> Preparar dois pratos 6 cm contendo 5 ml de PBS suplementado com BSA a 0,1%. Placa as células dissociadas em um único prato e permitem que as células que se contentar com pelo menos 5 min. A densidade de células utilizado depende em grande medida da natureza das células individuais a ser perfilados. Por exemplo, para as células muito raros marcadas com um marcador fluorescente, tais GFP um, inteiros retinas dissociadas são plaqueadas em um único prato 6 cm. Para as células que são um pouco mais abundante, menos células são inicialmente semeadas a tornar mais fácil para colher um (ou muito perto de um) da célula com o primeiro micropipeta. </li><li> Colocar a placa de células dissociadas sobre um microscópio invertido. Usamos o modelo IMT-2 do Olimpo. Usando micropipetas que foram tiradas de uma fine ponta (diâmetro interno 0,5 mm, diâmetro exterior 1,04 milímetros) (Figura 2) e, juntamente com um tubo de aspiração, colher uma única célula. As células facilmente entram na micropipeta quando é colocado perto deles no prato. É crítico que o tubo de aspiração é nem muito longo nem demasiado curto para a distância para a fase associado com o microscópio invertido (Os tubos aspirador que usamos com o nosso microscópio invertido são 38,1 cm de comprimento). Se o tubo for demasiado longo, as células não podem ser expulsos eficientemente a partir da micropipeta para dentro do tubo de recolha. A principal razão, usamos o velho microscópio IMT-2 modelo invertido é que encontramos tem a distância ideal para o estágio para nossos tubos de aspirador de montagem. Depois de entrar na micropipeta, a célula (ou células) é expelido para uma segunda placa (placa de lavagem) para garantir que uma e apenas uma célula é colhido para o perfil de expressão do gene. Na segunda placa é muitas vezes necessário para remover as células estranhas ou com uma micropipeta novoou mover a célula de interesse para uma localização diferente para assegurar que apenas uma única célula entra na micropipeta. </li><li> Quando uma célula individual está completamente isolado a partir de células vizinhas, usar uma micropipeta nova para aspirar a célula de interesse, como na seção 2.2 e, em seguida, expulsá-lo diretamente em um tubo de 0,2 ml PCR contendo 4,5 ul de tampão de lise celular. A célula é expelido para o lado do tubo, tendo cuidado para não romper a ponta da micropipeta para dentro do tubo. As amostras podem ser fiado rapidamente numa microcentrífuga de bancada para imergir a célula em tampão de lise. Esta rotação é geralmente feito depois de cada célula 5 e, em seguida, novamente no final do collection.Tubes contendo células individuais em tampão de lise deve ser mantido em gelo durante a duração do isolamento única célula. Para melhores resultados, as células individuais são coletados dentro de uma janela de duas horas pós-dissociação. Após este tempo, é melhor para passar para a etapa de transcrição reversa desde o tempo adicional foi observed para aumentar as chances de degradação do RNA. </li></ol> 3. Transcrição reversa <ol><li> Resumidamente girar as amostras em um minicentrifuge de bancada para assegurar que todas as células individuais são imersos no tampão de lise celular. Para promover a lise das células, incubar a amostra a 70 ° C durante 90 seg. num termociclador. Imediatamente colocar os tubos de volta em gelo. </li><li> Deixar os tubos em gelo durante 2 min. Para todas as adições de reagentes, usar pontas de filtro-ponteira para evitar contaminação. Para realizar a transcrição reversa, adicionar 0,33 uL Superscript III (200 U / ul), 0,05 ul de ARNase Inibidor (40 U / ul), e 0,07 ul de T4 gene 32 de proteína. Incubar a mistura de reacção durante 50 min a 50 ° C num termociclador. Inactivar a enzima a 70 ° C durante 15 min e colocar no gelo. </li><li> Para remover o iniciador livre, adicionar 0,1 Tampão Exonuclease ul (10X), 0,8 ul dH 2 0 (grau de biologia molecular), e 0,1 ul Exonuclease I (20 U / ul). Incubar a 37 ° C durante 30 min emum termociclador. Inactivar a enzima por incubação da reacção a 80 ° C durante 25 min e, em seguida, colocando os tubos em gelo. </li></ol> 4. Rejeitos e Single-Cell PCR <ol><li> Adicionar 6 uL da mistura de reacção tailing e usar um termociclador a incubar a amostra a 37 ° C durante 20 min, 70 ° C durante 10 min, e mantenha a 4 ° C </li><li> Adicionar 10 ul da amostra de cauda para a mistura de reacção de PCR e realizar a síntese da segunda cadeia e amplificação por PCR usando as seguintes condições: <ol><li> 95 ° C durante 2 min </li><li> 37 ° C durante 5 min </li><li> 72 ° C durante 16 min </li><li> 93 ° C durante 40 seg </li><li> 67 ° C durante 1 min </li><li> 72 ° C durante 6 min, a adição de 6 segundos por ciclo </li><li> Vá para a etapa 4 34 vezes </li><li> 72 ° C durante 10 min </li><li> Mantenha a 4 ° C </li></ol></li></ol> 5. Rotulagem de chips Affymetrix <ol><li> Ug rótulo 10-20 de ADNc (a concentração do resultado de ADNc amplificadoing a partir de uma única célula é usualmente ~ 1 ug / uL) para se obter um sólido de hibridação em microarrays Affymetrix. Primeiro, o fragmento de ADNc por adição de 10-20 ul do ADNc de uma única célula de 8 uL 1X One-Phor-All tampão e 1 uL de diluídos (1:10 em 1X One-Phor-All tampão) DNaseI em um 80 uL reacção. Incubar em um termociclador de 13 min a 37 ° C. Inactivar a ADNase I durante 15 min a 100 ° C e colocar em gelo. </li><li> Adicionar 20 ul de tampão TdT 5X, 2,5 Biotina uL N6-ddATP (Enzo Biosciences), e 1 uL TdT (diluído 1:08 em tampão de TdT). </li><li> Incubar durante 90 min a 37 ° C, em seguida, 5 min a 65 ° C. Armazenar a -20 ° C ou hibridizar imediatamente a um microarray Affymetrix. A hibridação é realizada utilizando protocolos padrão Affymetrix. </li></ol> 6. Os resultados representativos Para avaliar a qualidade do ul, ADNc 10 da amostra de cDNA foi carregado num gel de agarose a 1%. O cDNA é principalmente julgado por o intervalo de tamanho (500-2000 pb)e da intensidade da mancha de ADNc (Figura 1 e Figura 3a). No gel representado na Figura 1, cada outra pista mostra uma mancha de cDNA a partir de células da retina isolado E16.5. As pistas entre mostram os esfregaços resultantes quando os meios apenas é aspirado para dentro da agulha e depositado dentro do tubo de PCR. Estas faixas nunca são completamente desprovidos de um esfregaço de fraco, mas eles não mostram quaisquer resultados quando iniciadores gene-PCR específicos são utilizados para amplificar os genes a partir deles. Além disso, a intensidade da mancha de cDNA pode variar um pouco (comparar com a figura 1 e figura 3a). Nas pistas Figura 3A a, f, g, eh conter robustos esfregaços de cDNA enquanto as pistas b, c, d, ee são consideravelmente menos robusto. Gene-PCR específica é usado como um ecrã secundário da qualidade do cDNA a partir de uma única célula. Os cDNAs na Figura 3 foram isolados a partir fluorescentes células ganglionares da retina e eram Tested utilizando iniciadores de PCR para a células ganglionares da retina marcadores Brn3b e Pax6. Para este ensaio, 1 uL do cDNA foi submetido a PCR para 30 ciclos. Em tempo real PCR quantitativo seria um ensaio preferível, mas pode ser proibitivamente caro e não é necessário para meramente avaliar a qualidade de cDNA. Todos os 8 das células individuais testou positivo para Brn3b e 6 8 para fora Pax6 (Figura 3b). Mesmo as manchas de cDNA que eram menos robustos bandas produzidas para Brn3b e Pax6. Apesar destes resultados da PCR, é nossa experiência que esfregaços de cDNA, tais como aqueles em pistas b, c, d, ee não produzem hibridações robustos em matrizes Affymetrix e são geralmente evitados. Gene PCR específica para o marcador de fotorreceptores Crx foi utilizado para determinar o nível de contaminação nos cDNAs única célula (Figura 3b). Um marcador de fotorreceptores foi escolhido porque estas células formam a maioria da retina (~ 70%) e, portanto, qualquer lise celular que ocorreu seria mais provável envolver haste photoreceptors. Houve apenas uma quantidade fraco do presente Crx nestas preparações de ADNc, mesmo após 30 ciclos de PCR. Finalmente, esta tela baseado em PCR pode ser utilizado para começar a determinar quais os subconjuntos de um tipo particular de célula dos cDNAs foram derivadas de antes sujeitando-os a um perfil de microarray completa. Isto pode ajudar a dar prioridade as células que são perfiladas, como este é o passo mais caro do processo. Por exemplo, foram identificados os subconjuntos de células ganglionares da retina por rastreio-los para a presença do gene Tachykinin1 (Figura 3b). A partir do ecrã baseado em PCR pequeno, particular as células individuais são escolhidos e as suas cDNAs hibridado com uma microarray Affymetrix. Os dados de microarrays é comparado e padrões podem ser descobertos, utilizando algoritmos de agrupamento padrão. Heatmaps, tais como na Figura 4, são geradas para representar graficamente os dados. Existem duas principais conclusões sobre os dados de célula única de perfil na Figura4. Primeiro, os genes expressos em tipos celulares específicos são encontrados quase exclusivamente nos tipos de células após o protocolo única célula é executada. Na maioria dos casos em que genes marcadores de um tipo de célula são encontrados também em um segundo tipo de célula, tal como a observação de que células bipolares expressar algumas &quot;rod&quot; genes em níveis mais baixos, esta expressão no tipo de célula segundo é prontamente confirmada por quer in situ hibridação ou de coloração de anticorpos. Em segundo lugar, no amácrinas mais diversificada e perfis de células ganglionares, a heterogeneidade da expressão do gene é imediatamente aparente. Pou4f1 só é expressa em cerca de 1/4 das células ganglionares em desenvolvimento, enquanto que Nr4a2 e Scube2 são dois exemplos de genes heterogeneamente expressas em diferentes células amácrinas. Na verdade, os genes mostrados na heatmap são apenas uma pequena amostra como várias centenas de genes foram identificados e confirmado como marcadores de células ganglionares de desenvolvimento ou como marcadores de diferentes populações de células amácrinas 2,4. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxograma do método de célula única de perfil. Retinas Primeiro são isolados e dissociados em células individuais usando papaína. Em segundo lugar, as células individuais são colhidas com uma agulha de vidro puxado e depositado em tubos de PCR. As células são lisadas eo cDNA amplificado utilizando transcrição inversa seguida por PCR. A qualidade de ADNc resultante é avaliada com um gel de agarose, tais como a mostrada. Após a escada de DNA na pista em primeiro lugar, as pistas mostram esfregaços de cDNA a partir de células individuais (indicado pelos parênteses vermelhos) alternando com produtos de amplificação a partir de controlos de multimédia. Esfregaços desta qualidade (colchetes vermelhos) são cruzados para microarrays Affymetrix. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig2.jpg" /> Figura 2. Fotografias das agulhas e conjunto de tubo de aspiração. Células individuais são isolados utilizando a acção capilar de umapuxado vidro micropipeta (diâmetro interno 0,5 mm, diâmetro exterior 1,04 milímetro) e são transferidos pela pressão de sopro para o aspirador. É importante que o tubo de aspiração é tanto tempo suficiente para manipular facilmente e suficientemente curto para fiavelmente descarregar células individuais. Um close-up do tubo capilar puxado para dentro de uma agulha é mostrado em B. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig3.jpg" /> Figura 3. Exemplo representativo de esfregaços de células únicas de cDNA e PCRs de genes específicos. Para determinar a qualidade da célula única de ADNc após amplificação, 10 uL de cada amostra única célula foram executados em um gel de agarose a 1%, juntamente com um controlo negativo (A). Uma mancha deve aparecer entre 500-2000 pb. Rastreio baseado em PCR adicional para genes específicos pode ajudar a identificar / confirmar o tipo de célula que foi isolado ea quantidade de contaminação presente na amostra (B). Primers específicos para o de células ganglionares da retina marcadores Brn3be Pax6 foram testados para confirmar a identidade destas células (linhas 1 e 2). Para avaliar a quantidade de contaminação de fotorreceptores na preparação, primers específicos para o marcador de fotorreceptores Crx foram utilizados (linha 3). Subconjuntos de células ganglionares também podem ser identificadas através do rastreio de marcadores, tais como Tachykinin1 (linha 4). <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig4.jpg" /> Figura 4. Expressão única célula de genes marcadores. Os resultados para os genes seleccionados microarray expressas em 22 distintos de células individuais são mostrados em um formato heatmap. As intensidades dos sinais microarray foram dimensionadas para corresponder com a intensidade da cor vermelha. Negro indica a ausência de sinal no microarray. As células ganglionares da retina (RGC) precursores mostrados foram isoladas a partir de pontos de tempo embrionárias, enquanto que as outras células foram isoladas a partir de retinas de adultos.

<ol>
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U.S.A. 106, 9495-9500 (2009).</li><li>Roesch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptome+of+retinal+Muller+glial+cells.">The transcriptome of retinal Muller glial cells.</a> J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (2008).</li><li>Ramos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+diversity+in+transcriptional+profiles+of+single+hematopoietic+stem+cells.">Evidence for diversity in transcriptional profiles of single hematopoietic stem cells.</a> PLoS Genet. 2, e159 (2006).</li><li>Chiang, M. K., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcript+analysis+of+pancreas+development.">Single-cell transcript analysis of pancreas development.</a> Dev. 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Não há conflitos de interesse declarados.

Um número cada vez maior de estudos estão revelando variabilidade célula-célula robusta em populações que se acreditava serem mais homogêneas no que diz respeito à sua expressão gênica 6,8. Em pelo menos um exemplo, este gene expressão &quot;ruído&quot; tem sido demonstrado que desempenham uma função importante biológica 13. Diferenças de expressão gênica entre as células individuais são obscurecidos usando os tradicionais métodos de todo tecido. Essas experiências geram o per...

Reaction mixtures:
Cell Lysis buffer
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &mu;</td>
			<td>10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.23 &mu;l</td>
			<td>10% NP-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.23 &mu;l</td>
			<td>0.1M DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05 &mu;l</td>
			<td>RNase Inhibitor (40 U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05 &mu;l</td>
			<td>SUPERase-In (20U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.13 &mu;l</td>
			<td>Modified Oligo d(T) primer 
			(TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.09 &mu;l</td>
			<td>dNTPs (2.5 mM each)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.27 &mu;l</td>
			<td>dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tailing Reaction Mixture
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.18 &mu;l</td>
			<td>100 mM dATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 &mu;l</td>
			<td>10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.62 &mu;l</td>
			<td>dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 &mu;l</td>
			<td>TdT (400 U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 &mu;l</td>
			<td>RNase H (2 U/&mu;l)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
PCR Reaction Mixture
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 &mu;l</td>
			<td>10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l</td>
			<td>2.5 mM dNTPs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &mu;l</td>
			<td>Modified Oligo d(T) primer (10 &mu;g/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &mu;l</td>
			<td>Ex-Taq HS Polymerase (5U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>68.8 &mu;l</td>
			<td>dH2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
10X One-Phor All Buffer
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M</td>
			<td>Potassium acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M</td>
			<td>Tris acetate (pH 7.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M</td>
			<td>Magnesium acetate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Solutions:
10X Phosphate buffered saline (1 liter)
80g NaCl 
2g KCl 
14.4 g Na2PO4 
2.4 g KH2PO4 
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical needle puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 750</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0674</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assembly</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning filter tips (100-1000 &mu;l</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-265</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank's balanced salt solution (1X)</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>10-508F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer (1M)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>091688449</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04716728001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS03126</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>AM2682</td>
			<td>These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase-In</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>AM2694</td>
			<td>These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Oligo d(T) primer (gel purified)</td>
			<td>Oligos ETC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 gene 32 protein</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0300L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TdT</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3 333 574</td>
			<td>As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase H</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18021-014</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex-Taq HS Polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR006A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin N6-ddATP</td>
			<td>Enzo Biosciences</td>
			<td>42809</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Specific reagents and equipment.

single-cell profiling of developing and mature retinal neurons

Populações altamente especializados, mas muito pequena de células desempenham um papel importante em muitos tecidos. A identificação de célula do tipo marcadores específicos e programas de expressão do gene para subconjuntos de células extremamente raras tem sido um desafio usando padrão de tecido todo de abordagens. Perfilamento gene expressão de células individuais permite um acesso sem precedentes para tipos de células que compreendem apenas uma pequena percentagem do tecido total de 1-7. Além disso, esta técnica pode ser usado para examinar os programas de expressão génica que são transitoriamente expressa em pequenos números de células durante dinâmicas transições de desenvolvimento 8. Este problema surge da diversidade celular repetidamente no sistema nervoso central (CNS) onde as ligações neuronais pode ocorrer entre as células bastante diversas 9. O número exacto de tipos de células distintas não é conhecida com precisão, mas estima-se que pode haver até 1000 tipos diferentes no i córtextself 10. A função (s) de complexos circuitos neurais podem contar com alguns dos tipos raros neuronais e os genes se expressam. Através da identificação de novos marcadores e ajudando a molecularmente classificar neurónios diferentes, a abordagem de uma única célula é particularmente útil na análise de tipos de células no sistema nervoso. Pode também ajudar a elucidar os mecanismos de desenvolvimento neural, identificando genes diferencialmente expressos e vias de genes durante os estágios iniciais de desenvolvimento neuronal progenitor. Como um tecido, de fácil acesso simples com a diversidade considerável neuronal, a retina vertebrado é um sistema modelo excelente para estudar os processos de desenvolvimento celular, diferenciação neuronal e diversificação neuronal. No entanto, como em outras partes do SNC, esta diversidade celular pode apresentar um problema para determinar os caminhos genéticos que levam progenitores da retina de adotar um destino célula específica, especialmente dado que os bastonetes compõem a maria da população total de células da retina 11. Relatamos aqui um método para a identificação dos transcritos únicos expressos em células da retina (Figura 1). A técnica de perfis de célula única permite a avaliação da quantidade de heterogeneidade presente em diferentes populações celulares da retina 2,4,5,12. Além disso, este método tem revelado uma série de novos genes candidatos que podem desempenhar um papel (s) no destino da célula de tomada de decisão processos que ocorrem em subconjuntos de células progenitoras da retina 8. Com alguns ajustes simples para o protocolo, esta técnica pode ser utilizada para muitos tecidos diferentes e tipos de células.

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Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Um método para o isolamento de um único células da retina e amplificação subsequente dos seus ADNc é descrito. Unicelulares Transcritômica revela o grau de heterogeneidade celular presente num tecido e descobre genes novo marcador de populações de células raras. O protocolo que acompanha pode ser ajustado para se adequar muitos tipos de células diferentes.

De uma única célula perfil de imaturos e maduros neurônios da retina

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

single-cell-profiling-of-developing-and-mature-retinal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.0K visualizações.  Iowa State University. Um método para o isolamento de um único células da retina e amplificação subsequente dos seus ADNc é descrito. Unicelulares Transcritômica revela o grau de heterogeneidade celular presente num tecido e descobre genes novo marcador de populações de células raras. O protocolo que acompanha pode ser ajustado para se adequar muitos tipos de células diferentes.