As células aderentes exercem forças ao seu redor, e essas forças incluem as forças que as células exercem sobre o substrato, mostrado aqui em verde, e as forças que as células exercem sobre seus vizinhos, mostradas em vermelho. Essas forças podem ser medidas em monocamadas celulares usando uma técnica chamada microscopia de estresse monocamada. Resumidamente, a técnica envolve o preparo de hidrogéis contendo minúsculas contas fluorescentes, logo abaixo da superfície superior, e grandes contas fluorescentes que são coladas ao vidro.
Neste hidrogel, vemos as células e culturas delas confluência ou qualquer estado que se deseje medir forças. A medição das forças requer a imagem da monocamada celular, tirando imagens de luz transmitidas das células, e imagens de luz fluorescente das pequenas e grandes contas. Cada uma dessas imagens são adquiridas no mesmo plano vocal.
Essas imagens são adquiridas quando as células são anexadas e separadas do hidrogel. E uma comparação desses dois conjuntos de imagens nos fornece os dados necessários para quantificar todas essas forças. É aí que acTrM e AnViM entram em jogo.
Depois de emplacar as células, para você adquirir imagens exatamente no mesmo local, em qualquer instância desejada, esse protocolo é programado em AcTrM e, posteriormente, analisar esses dados e visualizar os resultados, esse é o propósito do AnViM. Nos próximos minutos, vamos levá-lo através do processo de aquisição de imagens para uma monocamada de célula de confluência. A etapa zero de ação solicita ao usuário a selecionar o tipo de aquisição.
Uma nova aquisição para iniciar um novo experimento, ou uma aquisição contínua para retomar um experimento anterior. Clique em Nova Aquisição para criar uma lista de posições. O primeiro passo da ação lista todos os seus próximos passos.
E essas ações serão tomadas na janela de lista de posições de palco aqui. Clique em Live in Micro-Manager para visualizar a amostra para ajustes manuais. Em vista ao vivo, vamos olhar para a fase.
Aqui está claro. Agora, é preciso olhar para as contas. Aqui, as contas podem ser visualizadas em fluorescência.
Então selecione o canal apropriado para as contas superiores. Também é importante que você seja capaz de ver algumas contas inferiores, então vamos olhar para um canal para as contas inferiores. O que você vê aqui é uma imagem embaçada de contas inferiores, e isso é completamente bom, desde que você possa dizer que as contas inferiores estão lá, o que você pode nesta imagem.
Lista de posições, clique em Mark. É assim que você cria uma lista de posições. Depois de criar uma lista de posições, que foi discutida no vídeo anterior, siga os passos listados na segunda etapa de ação usando a janela de aquisição multidimensional.
Digamos que queremos fazer um longo lapso de tempo. Aqui, eu vou indicar o número de imagens que queremos ser tiradas. O primeiro canal será o canal de fases.
A próxima será das contas de cima e a depois disso serão as contas inferiores. Clique em fechar na janela de aquisição multidimensional e clique em OK na etapa dois do AcTrM. A saída será salva no diretório identificado na janela de aquisição multidimensional.
A terceira etapa de ação perguntará se o experimento precisa de recuperação. A resposta normalmente será sim. Aqui pergunta o iTACS, queremos realizar uma recuperação refinada?
Esta primeira parte vai nos levar muito perto de uma recuperação refinada, mas a parte inferior vai nos levar ainda mais perto de uma maior precisão de reposicionamento. Se a recuperação for feita usando um campo de visão limitado, esta opção é oferecida, mas para este experimento, não estaremos selecionando essa opção. Neste ponto, a aquisição de um conjunto de imagens de referência está completa e o Micro-Manager pode ser fechado.
Para aquisição de imagens, iniciará o AcTrM. Selecione a ampliação e escolha o diretório que contém pastas de dados. Selecione opções para reposicionar a placa junto com o canal usado para reposicionamento.
Uma interface é fornecida para combinar o que é visto atualmente na câmera com as imagens salvas. Se houver sobreposição, as imagens exibirão uma cor vermelha e verde junto com a preta, e o ajuste manual pode ser realizado. Caso contrário, a batida aceitar, e a aquisição prosseguirá.
Agora podemos começar fiji. Selecione a primeira opção no menu suspenso MSM rotulado de pré-processamento. Em seguida, selecione a pasta que contém a pasta tnimgs.
Em seguida, teremos que definir qual canal corresponde a qual imagem. Para este exemplo, o Canal 0 é a imagem de luz transmitida que é a imagem de contraste de fase das células. A imagem inferior da conta é do Canal 2, e a imagem superior é do Canal 1.
E então, é perguntar onde as células se cruzam e qual lado da imagem. Neste caso, as células são uma monocamada avançando em direção à borda direita, então vamos desmarcar a direita, e continuar. Aqui uma pequena região de contas superiores, localizada longe da monocamada, servem ao mesmo propósito que as imagens de contas inferiores que parecem mais esparsas e maiores do que as mostradas aqui.
Agora está nos perguntando se queremos mudar o brilho e o contraste para que as contas apareçam com destaque. Assim, ajustamos usando as barras de controle deslizante no menu, e uma vez que as contas aparecem proeminentes clique EM OK. E agora, faremos correção de posição. Se houver alguma mudança, ele vai se livrar dele.
E depois que for feito, criará a pasta de análise. Dentro da pasta de análise, ele criará a pasta de posição, P0, e as escolhas que fizemos nos menus anteriores de pré-processamento são armazenadas em escolhas de análise, como quais bordas foram cruzadas, tamanho do pixel e qual imagem é contraste de fase e outras. No microscopia de estresse da monocamada, ou menu suspenso MSM, selecione deformação de gel MSM.
A partir daqui, vamos selecionar a opção que é adequada para a nossa distribuição de contas. E como os dados estão sendo processados, você pode ver que uma nova pasta de deslocamento apareceu na pasta de posição. Este será o lugar onde todos os arquivos de saída serão armazenados.
Isso indica que a análise está completa. Vamos ver como calcular as forças que são exercidas através da junção célula-ECM e junção célula-célula e também o citoesqueleto de células individuais da monocamada. Para isso, selecione a terceira opção.
E um vai escolher o diretório que contém tnimgs e a pasta de análise, o que significa que se selecionará o diretório de exemplo em vez de qualquer um desses diretórios. Aperte select, e ele vai perguntar-lhe, qual é o módulo de cisalhamento deste gel? O módulo de cisalhamento é de 1250 e a espessura do hidrogel neste exemplo é de 118 mícrons.
O nível de ruído antecipado é fornecido aqui. Então, há um deslocamento médio é bandeira zero, que não é verificado neste caso. Selecione OK, e a implementação que calcula a tração é executada através de uma função MATLAB, que é como ela é implementada nesta versão do AnViM.
Agora está pronto para fazer o cálculo para células celulares ou forças citoesqueléticos. E a primeira pergunta a se fazer é: a monocamada é confluente? Neste caso em particular, temos uma monocamada avançando e não há uma região celular no lado direito da moldura.
Então a resposta é que a monocamada não é confluente, então vamos dizer não. Agora nos pedem para desenhar um polígono em torno do maior objeto não celular. Selecionamos os métodos apropriados para segmentação.
Aqui está nos pedindo para indicar a cor das células nos métodos três e quatro, então aqui as células são pretas, então vamos escolher preto. A segmentação produzida a partir desses diferentes métodos termina com alguns buracos na monocamada celular e algumas regiões brancas na área sem células. Aqui podemos escolher, preencher vagas automaticamente e acertar OK.So agora todas as vagas estão preenchidas na monocamada e sem área celular.
E então, vamos calcular os estresses mecânicos na monocamada celular. Já realizamos a primeira parte onde segmentamos as células da região sem células, então começamos essa etapa com a parte dois que é a segmentação das células individuais e das imagens. Um deles vai selecionar segmentação para células individuais.
E aqui está nos pedindo para escolher o diretório de posições. E há mais informações dadas aqui para esses parâmetros. Então ele pede para desenhar um polígono em torno da menor célula normal.
Então o que você desenha aqui é usado para calcular área e vai estipular que qualquer coisa menor do que isso não é definido como uma célula. E depois pede a maior célula. Então desenhamos um polígono em torno da maior célula normal, e então ele pergunta, qual é mais brilhante?
A interface celular é mais brilhante ou os centros celulares são mais brilhantes? Então, neste caso, a interface célula-célula é mais brilhante, então eu vou selecionar interface celular-célula. Então isso indica que o cálculo foi concluído.
Vamos começar selecionando mapas sobre intensidades de células. Primeiro, o iTACS pede ao usuário para selecionar o diretório de posições, que também é conhecido como pasta P0. Quando terminar, clique em Selecionar.
Em seguida, o usuário é perguntado se ele ou ela quer iTACS para detectar divisão celular ou quantificar fluorescência celular. Neste caso, não temos proteínas fluorescentes dentro da célula, então é por isso que optaremos por detectar a divisão celular. O slide seguinte permite que o usuário defina o tamanho da região vizinha, esta é uma análise única que o AnViM realiza onde olha para as propriedades de células individuais, bem como as propriedades das células vizinhas.
Aqui, o usuário pode escolher a largura de uma região vizinha de células. Neste caso, definimos as regiões vizinhas com 60 pixels. A primeira caixa de seleção pergunta se queremos que o iTACS colete propriedades das células, sim nós fazemos, e esta caixa de seleção pergunta se queremos que o iTACS recolham propriedades dos vizinhos, sim, queremos que o iTACS faça isso também.
Abaixo dessas caixas de seleção, o iTACS fornece mais informações sobre as caixas de seleção se o usuário quiser mais detalhes sobre cada caixa de seleção. Isso indica que a análise está completa. Novamente, o iTACS pede ao usuário para selecionar o diretório de posições.
Em seguida, o usuário tem a opção de mapear dados de força, criar imagens dos dados de força, mapear dados de velocidade e criar imagens dos dados de velocidade. É importante notar que criar imagens leva tempo, para que se possa optar por fazê-lo agora ou esperar para fazê-lo mais tarde. É por isso que o usuário tem a opção de selecionar as escolhas ou não.
Aqui, o iTACS pede ao usuário que determine o tamanho da região vizinha novamente, e você pode usar o mesmo tamanho que determinou para mapear intensidades, que era de 60 pixels, no nosso caso. E novamente, o usuário é solicitado a coletar propriedades das células, bem como de sua região vizinha. Isso indica que a análise está completa.
Na microscopia de estresse da monocamada, ou menu suspenso do MSM, selecione os dados de faixa de resultados. Primeiro, o iTACS pede ao usuário para selecionar o diretório de posições, que também é conhecido como pasta P0. Quando terminar, clique em Selecionar.
Aqui, o iTACS pergunta a qual número de quadro o usuário deseja que o iTACS comece a rastrear dados. É bastante seguro começar a rastrear a partir do quadro número dois, porque a velocidade não pode ser determinada para o quadro número um. Aqui, o iTACS pede ao usuário que indique o número máximo de parcelas para preencher simultaneamente.
E essencialmente, esta é uma maneira de agilizar o rastreamento de dados. Quando terminar, clique em OK e as opções para escolher variáveis durante o rastreamento são apresentadas de forma semelhante às opções de geração de mapas de calor. As propriedades comuns de interesse são fornecidas na caixa de texto na parte superior da janela.
Mas se você quiser personalizar suas variáveis, basta excluir tudo na caixa de texto e selecionar as propriedades específicas listadas abaixo. No microscopia de estresse da monocamada, ou menu suspenso MSM, selecione o gráfico de resultados. Depois disso, o iTACS pergunta ao usuário se o usuário quer limitar a plotagem para células com faixa ininterrupta.
Se você não quiser limitar a plotagem para faixas ininterruptas, clique em No.Mas se você quiser limitar a plotagem para células com faixas ininterruptas, clique em Sim Aqui iTACS pergunta quantas variáveis o usuário quer que o programa plote. O iTACS é capaz de traçar até três variáveis, e neste caso, vamos traçar apenas duas variáveis para ver a relação entre esses fatores. Na microscopia de estresse da monocamada, ou menu suspenso msm, selecione a imagem dos resultados.
Aqui está o diretório de posição e, quando concluído, clique em Selecionar. O iTACS então nos pede para escolher o quadro inicial. Aqui, selecionamos o quadro número dois.
As opções para fazer mapas térmicos são apresentadas de forma semelhante às opções para traçar faixas de tempo de células individuais. Com isso, concluímos como fazer um mapa de calor. Aqui representa o traço de tempo da velocidade celular na tensão citoesqueleta para a célula número um.
As propriedades são mostradas em um eixo vertical compartilhado e o eixo horizontal indica o número da instância de tempo, onde os quadros são adquiridos em intervalos de 15 minutos. A segunda saída é uma matriz de mapas de calor uma hora após o experimento. As propriedades aqui mostradas incluem área de disseminação, orientação, circularidade, velocidade, direção de movimento, orientação de tensão máxima, tensão citoesqueletal, traçãos substratos e anisotropia de tensão de células individuais.
Então isso é um vislumbre de um conjunto de experimentos. Existem várias outras situações experimentais em que o AnViM e o AcTrM podem ajudar o usuário a fazer o experimento de forma reprodutível e esses contatos estão listados no manuscrito. Algumas das principais características do iTACS incluem automação do protocolo experimental, análise automatizada de dados e nenhum fundo de engenharia é necessário.
