A técnica ELISA é realmente útil para detectar o parasita da malária no mosquito vetor com alta sensibilidade e especificidade, e capaz de processar muitas amostras ao mesmo tempo. Essa técnica permite que os pesquisadores mantenham amostras de mosquitos até que estejam prontas para o processamento de amostras, e pode ser realizada para diferenciar espécies de Plasmodium usando anticorpos monoclonais específicos da espécie. Prepare a amostra separando a cabeça e o tórax dos mosquitos do abdômen e coloque-os em um tubo de moagem de centrífuga pré-rotulado de 1,5 mililitro.
Adicione 50 microlitros de tampão de moagem a cada tubo e homogeneize a amostra com um pilão. Enxágüe o pilão com 250 microlitros de tampão de moagem e adicione a solução ao tubo para aumentar o volume final para 300 microlitros. Prepare uma placa ELISA para proteína circunsporozoíta e preencha a planilha ELISA de esporozoíto.
Prepare a solução de anticorpos em PBS e adicione cinco mililitros da solução por placa. Pipetar 50 microlitros da solução de anticorpos em cada poço da placa ELISA. Coloque uma tampa no prato e incube por 30 minutos ou durante a noite em temperatura ambiente.
Aspire a solução no poço e bata o prato em uma toalha de papel cinco vezes para remover o líquido. Adicione 200 microlitros de tampão de bloqueio nas placas do poço e cubra com uma tampa. Incube por uma hora em temperatura ambiente e aspire o conteúdo do poço.
Novamente bata o prato em uma toalha de papel para remover o líquido. Adicione 50 microlitros de controle positivo aos poços H um e H dois. Em seguida, adicione 50 microlitros de tampão de bloqueio nos poços nas colunas um e dois das linhas C a G. Adicione 50 microlitros do controle positivo nos poços G um e G dois.
Diluir em série o controlo positivo a partir de G um e G dois, seguido de F um e F dois até C um e C dois. Adicione 50 microlitros do controle negativo aos poços A um, A dois, B um e B dois. Extraia 50 microlitros da solução homogeneizada e adicione-a a um poço desconhecido.
Cubra o prato e incube-o em temperatura ambiente por duas horas. Preparar a solução de substrato misturando os substratos A e B na proporção de um para um. Determine o volume necessário com base na adição de cinco mililitros de solução de anticorpo conjugado de trabalho a cada placa.
Avalie a atividade da peroxidase adicionando cinco microlitros da solução de anticorpo marcada com peroxidase a 100 microlitros da solução de substrato em um tubo de 1,5 mililitro. Aspire o conteúdo do poço e remova o líquido colocando o prato de cabeça para baixo sobre uma toalha de papel. Lave os poços duas vezes com 200 microlitros de PBS Tween.
Aspire o conteúdo do poço e bata na placa cinco vezes. Adicione 50 microlitros de solução de anticorpos marcados com peroxidase a cada poço. Em seguida, incube no escuro por uma hora em temperatura ambiente.
Aspire o conteúdo do poço e bata no prato em uma toalha de papel cinco vezes. Lave os poços com 200 microlitros de PBS Tween três vezes, aspire o conteúdo e bata na placa cinco vezes. Adicione 100 microlitros da solução de substrato a cada poço.
Cubra o prato e incube no escuro por 30 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, leia a absorbância em 405 a 414 nanômetros usando um leitor de placas ELISA. Rotular as amostras com absorbância com um valor acima do limite como positivo e determinar a concentração de CSP na amostra usando o padrão.
Plote os valores de absorbância versus concentração da solução para gerar uma curva padrão. Determine o melhor ajuste usando o método de regressão linear. Resolva a equação de cada valor de absorbância para uma amostra positiva para determinar a concentração de CSP.
Após 30 minutos de realização de ELISA com ABTS, a infecção por esporozoítos pôde ser detectada pelo aparecimento de uma leve cor verde no poço. O controle positivo não apresentou nenhuma mudança de cor no poço. Os valores de absorbância para os poços negativo e positivo foram determinados.
O poço positivo exibiu um valor de absorbância acima do limite de corte, enquanto os controles negativos demonstraram valores significativamente menores. Além disso, os valores de absorbância dos outros 80 poços desconhecidos também foram obtidos. A linha sólida representa a absorbância média dos alvéolos de controle negativo e a linha tracejada representa o limiar de positividade.
Usando a curva padrão, a concentração de CSP no poço A sete foi determinada em 0,35 picogramas por microlitro Esta etapa do processamento de ELISA deve ser realizada rapidamente para evitar vetores inespecíficos. Além disso, todas as amostras e soluções devem ser mantidas na geladeira para evitar o crescimento microbiano. Recomenda-se que os pesquisadores confirmem as detecções positivas por outros métodos, como PCR.
Isso melhorará significativamente a confiança, especialmente quando a única leitura for valorizada acima do limite. Essa técnica permitiu que os pesquisadores realizassem levantamentos em larga escala de possíveis infecções nos mosquitos, o que é importante para identificar o vetor principal.
