Mosquito midgut abriga uma comunidade complexa de micróbios que afetam o metabolismo hospedeiro, reprodução, aptidão e competência veterinária. Com cada micróbio intestinal é um efeito diferente. Este vídeo introduz o procedimento para estudar o respectivo papel de cada cepa de bactérias ou fisiologia hospedeira.
Para adquirir uma cultura de colônias bacterianas intestinais, disseque o mosquito midgut sob condição estéril. Aterrar o meio-boca dissecado, serotologinado, e espalhe sobre a placa de ágar. Escolha colônias únicas da placa, e identifique as espécies de bactérias através de sua sequência genética de 16 SRNA.
Alimente os mosquitos com COD Emboss contendo antibióticos por três dias consecutivos para remover microbiota intestinal. A eficácia do tratamento com antibióticos pode ser confirmada dissecando o midgut do mosquito asséptico para ensaio da unidade de formação de colônias antes dos extremistas subsequentes. Em seguida, reintroduzir espécies de bactérias específicas que anteriormente se isolaram do intestino do mosquito através do ensaio de alimentação oral.
O efeito das bactérias na fisiologia hospedeira poderia ser avaliado comparando os mosquitos não tratados, mosquitos tratados com antibióticos e os mosquitos reintroduzidos com restrição específica. Dissecção midgut e o isolamento de bactérias cultivadas. Para começar, recolher os mosquitos na gaiola com um aspirador e célula dos mosquitos na caixa de coleta.
Anestesiar os mosquitos submetendo-se a uma temperatura de 4 graus por três a cinco minutos. Mantenha os mosquitos anestesiados colocando-os em uma placa de Petri gelada. Desinfetar o banco, dissecando microscópio e fórceps pulverizando 75% de etanol para evitar contaminação por bactérias do meio ambiente.
A superfície esteriliza o mosquito gravando e sacudindo-os em 75% de etanol por três minutos e enxágue duas vezes com tampão PBS. Bissecte o mosquito separadamente em uma lâmina de vidro estéril contendo sua gota de PBS. Remova cuidadosamente as pernas, asas e a cabeça do mosquito usando fórceps.
Prender o peito do mosquito e a última seção do abdômen foi fórceps e se separar para isolar o trato digestivo. Use fórceps para remover a cultura e o tubo malpighiano do trato digestivo. A cultura é posicionada no pnterior de midgut e protuberâncias após a ingestão de água de açúcar.
Tubos malpighianos são um grupo de tubos excretórios finos na junção de midgut e hindgut. Coloque a maquiagem dissecada no tubo EP com 200 microliters estéreis tampão PBS e moer com o pastor de moagem estéril no banco limpo. Cereal para carregar o homogeneizar para três delírios tempo em 50 microliters de cada ilusão para a placa de ágar LB e placa desesperada.
Incubar a placa como 37 graus por um a dois dias até que colônias únicas sejam viáveis. Escolha colônias simples em um frasco cônico de 150 mililitros contendo 50 mililitros de sutiãs lb. agitar a bactéria a 37 graus durante a noite.
Identificação de espécies. Extrair DNA TOTO por kit de construção de DNA genômico bacteriano e amplificar 16 SRDNA por PCR. Recuperação e purificação de fragmentos de DNA de produtos PCR por eletroforese de gel ambrose e o kit de recuperação de dirigir.
Realizou sequenciamento de DNA nos fragmentos de DNA purificados para ter uma sequência de cadeia de bactérias alcançadas. Execute a pesquisa de explosão para uma consulta a sequência genética de 16 SRNA de identificar as bactérias contra as bactérias e o archaea e banco de dados. A identificação ao nível da espécie foi definida como maior ou igual a 99%16 de sequência SRDNA similaridade à entrada de banco de equipe mais próxima.
O isolado foi atribuído ao gênero correspondente, quando é 16 sequência SRDNA, a semelhança foi inferior a 99% e maior ou igual a 95% de tratamento antibiótico e reintrodução de bactérias. pesar a quantidade necessária de penicilina de sacarose e estreptomicina para nos preparar solução de 10% de sacarose, incluindo tentar 20 unidades de penicilina e 20 microgramas de estreptomicina por mililitro. Infiltrar as bolas de algodão na solução de sacarose contendo antibióticos e colocá-lo sobre o topo do copo de papel contendo mosquito.
Cubra a bola de algodão com uma placa de Petri de 10 centímetros para evitar que uma orla evapore. Substitua as bolas de algodão duas vezes por dia e alimente o mosquito por três dias consecutivos. Os mosquitos são divididos em dois grupos.
O primeiro grupo foi colocado em um copo de mosquito sem qualquer tratamento, qualquer médico de bolas de algodão com 10% Então, a cruz era dada diariamente. O segundo grupo foi tratado com antibióticos e serviu por três dias. Em cada grupo, os mosquitos Sergei foram dissecados.
O Mika foi extraído para extração total de DNA e o QPCR foi realizado utilizando primers universais de bactérias, figura 1 mostra a expressão de 16 SRNA no grupo controle e grupo de tratamento de antibióticos. Os resultados mostram que o custo ou realização da penicilina e estreptomicina foi bem sucedido. preparar solução bacteriana, mede uma solução de bactérias no vírus com um espectrofotômetro, adicione uma suspensão de bactérias OT no tubo EP.
Centrifugar a suspensão a 5.000 RCA por cinco minutos a quatro graus Descarte o supernascedor, lave a paleta bacteriana com tampão PBS estéril. Suspenda a palete bacteriana com 200 microliters tampão PBS estéril Adicione 600 microliter, solução de 10% de sacarose, 200 microliter ATP e 200 microliter suspensão bacteriana em um novo tubo AP e misture bem. Alternativamente, as bactérias podem ser re-suspensas no calor para ativar seu sangue.
Preparação de aquecimento ativou sangue. coágulo sangue fresco com tubo anticoagulante, tome de dois a três mililitros de sangue fresco. centrífuga a 1000 por 10 minutos a 4 graus para separar plasma e células sanguíneas.
Colete o plasma em um novo tubo EP e aqui ativar ativado a 56 graus por uma hora. Lave a casa de explosão através de seus tempos com tampão PBS estéril. Enxágüe a casa de explosão suspensa com plasma ativado de aquecimento.
Montar membrana e sistema de alimentação. Puxe a doença do filme ao máximo. fix com o anel de plástico e parafilm local de trabalho para evitar o vazamento lentamente adicione a solução bacteriana preparada à unidade alimentadora, ao máximo da carteira.
Para evitar que a bolha caísse de uma direção e selasse a unidade alimentador. Conecte a fonte de alimentação. Aguarde até que a temperatura atinja 37 graus Instale a unidade alimentador com solução de bactérias no alimentador.
Antes de alimentar os mosquitos das bactérias deve ser interrompido por 24 horas para metabolizar antibióticos. Para a unidade de alimentação no copo de papel com mosquitos, em seguida, deixe a alimentação por 90 minutos. Mosquitos totalmente encorajados poderiam ser escolhidos para estudos posteriores.
Resultados representativos. A figura dois nos mostra o reconhecimento médio por mosquito. Após a in loção de antibiótico tratado os mosquitos vemos meningosépticos.
A Figura Três mostra a expressão de uma variante de desenvolvimento de genes relacionados 24 horas após a refeição sanguínea contendo o meningosséptico C. Os resultados mostram que não há mudança significativa na produção de ovos do grupo controle e do grupo de desbotamento. Obrigado por seu interesse por bactérias ou uma redação de alimentação com mosquitos tratados com antibióticos.
