Agradecemos Drs. Anthony Cornel e Laura Norris na UC Davis e Dr. Katharina Kreppel na Universidade de Glasgow para a prestação de espécimes de mosquitos da Tanzânia. Agradecemos Ms. Smita Das e Dr. Douglas Norris da Johns Hopkins School of Public Health para a partilha de amostras de mosquitos da Zâmbia. Agradecemos também o Sr. Lee V. Millon do Laboratório de Genética Veterinária para o treinamento no projeto ensaio. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Saúde conceder R01AI 078.183 e R21AI062929.

1. Amplificação por PCR <ol><li> Misturar todos os iniciadores de PCR (Ver Tabela S1 suplementar) em um microtubo de 1,5 mL. Cada SNP tem dois iniciadores (directo e inverso). Certifique-se de que a concentração de estoque de cada um dos iniciadores de PCR é mantida a 100 uM. Faça a mistura de iniciadores suficiente para 500-1.000 reações para reduzir pipetagem erro e tempo no banco (ver Tabela S2 suplementar). Se desejado, preparar alíquotas de 100-200 reacções por tubo, e armazenar a -20 ° C. </li><li> Prepare PCR cocktail como descrito no protocolo do fabricante (Tabela 1). O volume para 96 ​​reacções inclui um excesso de 20%. Vortex o tubo contendo o cocktail de PCR ligeiramente e centrifugar durante 30 segundos a 2000 x g. </li><li> Dispensar 3 ul do cocktail de PCR em cada poço de um não-contornado placa de 96 poços. A pipeta repetidora pode economizar tempo para este processo. </li><li> Adicionar 2 ul de DNA genómico adequada de mosquitos em cada poço. NOTA: Processo de obtenção de ADN genómico a partir de m<html> tecidos osquito (cabeça / tórax, abdômen ou do corpo inteiro) é descrito em outras literaturas 29-32. Escolha um protocolo de extração de DNA adequado para diferenciar aqueles com Plasmodium no sangue (abdómen) de mosquitos infecciosos (Plasmodium na cabeça / tórax). Normalmente usamos DNA extraído de partes do corpo (cabeça / tórax ou abdômen) de mosquitos, por isso, concentração de DNA varia de 0.05-2ng / l. Embora a entrada de DNA total é menor do que a recomendação do fabricante (5-10ng / rxn), que costuma ter robusto SNP chamadas de 98% das amostras de DNA sem amplificação do genoma inteiro. </li><li> Selar a placa, misture delicadamente ou vortex, e centrifugar por 1 min a 370 x g. </li><li> Usar o seguinte protocolo termociclador para realizar a amplificação por PCR: (1) 94 ° C durante 2 minutos, (2) 94 ° C durante 30 segundos, (3) 56 ° C durante 30 segundos, (4) 72 ° C durante 1 min , (5) repetir o passo (2) - (4) por 45 ciclos, (6) 72 ° C durante 1 min, 4 ° C e preensão. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. O tratamento da SAP <ol><li> Preparar a solução de enzima SAP em uma placa de 96 poços (Ver Tabela 2). Processar 96 amostras em uma placa. O volume para 96 ​​reacções inclui um excesso de 20%. </li><li> Vortex o tubo de solução de enzima SAP levemente e centrifugar por 30 segundos a 2.000 x g. Dispensar 2 ul da solução de enzima SAP em cada poço. Mais uma vez, um repetidor pipeta pode economizar tempo para este processo. </li><li> Selar a placa, misture delicadamente ou vortex, e centrifugar por 1 min a 370 x g. Incubar a placa como se segue: (1) 37 ° C durante 40 minutos, (2) 85 ° C durante 5 min, para inactivar a enzima, (3) a 4 ° C preensão. Ao terminar este passo, a placa de armazenar a -20 ° C antes de continuar. Processar a placa armazenado dentro de 2 semanas. </li></ol> 3. SNP Extension <ol><li> Se a placa de amostra é congelado após o tratamento SAP, deixe-o descongelar à temperatura ambiente antes de prosseguir. </li><li> Preparar a mistura de extensão do primer (Tabela Suplementar S2). Cada SNP tem uma extension iniciador. Manter a concentração estoque de cada iniciador de extensão em 500 M. Opcionalmente, alíquota de 100-200 reacções por tubo e armazenar a -20 ° C. </li><li> Preparar a mistura de extensão como descrito na Tabela 3. O volume de reacção 96 inclui uma saliência de 20%. </li><li> Vortex o tubo de extensão cocktail levemente e centrifugar por 30 segundos a 2.000 x g. Dispensar 2 ul do cocktail de extensão em cada poço. Mais uma vez, um repetidor pipeta pode economizar tempo para este processo. </li><li> Selar a placa, misture delicadamente ou vortex, e centrifugar por 1 min a 370 x g. Thermocycle da placa, como mostrado na Figura 1. Neste momento, proceder à espectrometria de massa ou armazenar a placa à temperatura de -20 ° C até 2 semanas. </li></ol> 4. Condicionado o SNP extensão do produto para otimizar Análise Espectrometria de Massa <ol><li> Se a placa de amostra é congelado após a extensão SNP, deixe-o descongelar à temperatura ambiente antes de prosseguir. </li><li> Transferir 15 mg de resina a partir da sua Container na placa covinha usando uma colher alongada. Use o raspador para espalhar resina para os poços da placa de covinha. Varrer o raspador de lado a lado ao longo da placa para espalhar a covinha resina. Verifique se há resina em cada poço. </li><li> Raspe o excesso de resina da placa covinha usando o raspador. Deixe que a resina de suporte na placa de ondulação para a, pelo menos, 20 min. Enquanto a resina deixando ficar na placa de ondulação, adicionar 41 ul de água para HPLC a cada poço da placa de amostra. </li><li> Delicadamente, coloque a placa de amostra de cabeça para baixo, sobre a placa covinha. Certifique-se de repor a placa de amostra contra o pequeno posto arredondada da placa covinha, que alinha os poços na placa de amostra com os poços da placa covinha. </li><li> Segurando a placa de amostra ea placa covinha juntos, lançá-los suavemente sobre modo a resina cai para fora da placa covinha nas cavidades da placa de amostra. Toque na placa covinha de modo a resina cai na placa de amostra. Certifique-se de toda a resina no diplaca mple cai nos poços da placa de amostra. Centrifugar a placa a 3200 xg durante 30 seg. </li><li> Girar a placa de amostras num rotor durante 5 min à TA. Rotator deve girar a placa de amostra de 360 ​​° sobre o eixo longitudinal. </li><li> Centrifuga-se a amostra na placa de 3.200 xg durante 5 min. Após este passo, armazenar a placa de amostra a -20 ° C até 2 semanas antes de prosseguir para o próximo passo. </li></ol> 5. MALDI-TOF Espectrometria de Massa <ol><li> Transferir o produto da extensão do SNP condicionado para um bioarray tais como SpectroCHIP conforme as instruções do fabricante. Usamos MassARRAY Nanodispenser para este passo. </li><li> Assim que a transferência for concluída, definir a forma como os ensaios e as placas estão a ser criado no banco de dados do ensaio. Nome do ensaio e placas de tal forma que cada placa tem identificador único que liga ao design ensaio específico (Tabela Suplementar S3). </li><li> Depois de ensaio e placa foram definidos, adquirir espectros usando um espectrômetro de massa. </li></ol><ol><li> Realizar análise de dados utilizando uma análise em tempo real PCR software de interpretação de dados, como Tipos Analyzer ou TyperViewer (Sequenom). Obter dados em formato .xml que contém o layout da amostra, espectrograma de massa para cada bem, as informações marcador incluindo nome, massa esperada para cada variante do SNP correspondente, e qualquer erro ou mensagens de aviso associado a cada reação. Ver Figura 2 para o espectrograma de massa resultante. </li><li> Realizar análise do genótipo SNP agrupamento, definindo o limite de detecção (magnitude ou sinal-ruído) e tolerância / variação permitida para cada genótipo. A Figura 3 mostra um exemplo de uma 04707-KDR # 2 clusters genótipo SNP. </li><li> Exportar os resultantes chamadas genótipo SNP em um programa de planilha. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

O MDA é composto por cinco etapas principais: amplificação de PCR, fosfatase alcalina de camarão (SAP) de reacção, de extensão SNP, o produto de extensão condicionado, e de matriz assistida por laser de dessorção / ionização - tempo de voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa de 33-37. O primeiro passo de amplificação de PCR amplifica ADN que flanqueia cada SNP, de modo que o ADN molde suficiente estará disponível no passo de extensão de SNP. A reação SAP neutraliza dNTPs não utilizados que...

Arabiensis Anopheles, Anopheles coluzzii e Anopheles gambiae são os principais vetores responsáveis ​​pela transmissão da malária na África 1. Estas três espécies são morfologicamente indistinguíveis 2 e só pode ser distinguido por testes moleculares 3-9. Além disso, existem muitos ensaios a jusante rotineiramente realizados para auxiliar genética epidemiológicos e populacionais estudos. Estas incluem: (1) um ensaio de genotipagem para ilhas de especiação 10-12, (2) um ensaio de genotipagem reconhecendo SNPs não sinônimas no 1014 th posição do aminoácido códon do gene para (a resistência knock-down, ou kdr, SNP) 13 -18, (3) a detecção de parasitas PCR 19-23, e (4) de triagem para DNA específica do host no intestino médio do mosquito 24,25. Foi desenvolvido um ensaio de detecção de múltiplos (MDA) que combina todos estes ensaios numa única reacção multiplex com o objetivo de umalyzing características epidemiologicamente importantes de vetores da malária em África. O ensaio MDA inclui múltiplos marcadores para a detecção (1) espécie (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii, ou outro (nenhum dos três)), (2) a resistência aos inseticidas representada em kdr SNPs (ambos L1014F e L1014S) , (3) a presença de dois grandes parasitas da malária, Plasmodium falciparum e P. vivax, e (4) a partir de uma fonte de sangue aviária e seis hospedeiros mamíferos. Tradicionalmente, estes ensaios foram realizados em reacções em cadeia de polimerase separadas. Quando todos esses ensaios são feitos usando uma plataforma PCR convencional, requer a realização de ensaios de reacção de PCR 10/08 e acompanha os passos de eletroforese em gel. Cada reação individual PCR de preparação para resultados documentando leva 4-5 horas, enquanto o método aqui apresentado MDA leva cerca de 5 horas em sua totalidade. Isto é equivalente a uma economia de 90% em custos de trabalho sozinho. O MDA apresentou aqui custa US $ 5por amostra de genotipagem de todos os 33 SNPs. Isto é consideravelmente mais barato do que as solteiras ensaios baseados em gel de agarose, que custa cerca de US $ 1,50 por amostra. Ensaios que detectam todas as características abrangidas pelo MDA requereria um mínimo de 8-10 ensaios separados baseadas em gel de agarose a um custo de $ 12-15 por amostra. Além disso, o MDA reduz grandemente a possibilidade de gerar uma falsa positiva ou negativa através da utilização de pelo menos três marcadores para cada parasita ou fonte de acolhimento de detecção. A plataforma que utilizado não está limitado a vetores da malária, mas pode ser utilizado numa ampla variedade de aplicações, tais como a medicina, e medicina veterinária, e biologia de base 26-28. Em profundidade estudos de associação ou de genética de populações estudos envolvendo um grande número (em ordem de 100s) das amostras exigem ensaios rentáveis ​​triagem para múltiplos marcadores simultaneamente. A maioria dos estudos que utilizam dois ou mais ensaios de PCR separadas poderia implementar o MDA para resultados mais rápidos a um custo menor. </p&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="588">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:87px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MassARRAY Analyzer Compact</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">MT9</td>
			<td>MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MassARRAY Nanodispenser</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">RS1000</td>
			<td>Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iPLEX Gold Genotyping Reagent Set</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">10158</td>
			<td>Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-detection assay for malaria transmitting mosquitoes

O complexo de espécies Anopheles gambiae inclui a maior mosquitos transmissores da malária na África. Porque estas espécies são de tal importância médica, várias características são tipicamente caracterizados por meio de ensaios moleculares para auxiliar em estudos epidemiológicos. Essas características incluem a identificação das espécies, resistência a inseticidas, estado de infecção do parasita, e preferência de acolhimento. Dado que as populações do complexo Anopheles gambiae são morfologicamente indistinguíveis, uma reação em cadeia da polimerase (PCR) é tradicionalmente usado para identificar as espécies. Uma vez que a espécie é conhecida, vários ensaios a jusante são rotineiramente realizados para elucidar outras características. Por exemplo, as mutações conhecidas como KDR em um gene par conferir resistência contra o DDT e piretróides. Além disso, ensaios de imunoabsorção ligados a enzima (ELISA) ou Plasmodium ensaios de PCR de detecção do DNA do parasita são usados ​​para detectar parasitas presentes nos tecidos de mosquito. Por último, uma combinaçãn de PCR e digeridos com enzimas de restrição pode ser utilizado para elucidar preferência hospedeira (por exemplo, humano versus animais de sangue) por rastreio de farinha de sangue para mosquitos de ADN específico do anfitrião. Nós desenvolvemos um ensaio de detecção de múltiplos (MDA) que combina todos os ensaios acima mencionados numa única multiplex 33SNPs genotipagem reacção durante 96 ou 384 amostras de cada vez. Porque o MDA inclui vários marcadores para as espécies, a detecção de Plasmodium, e identificação sanguíneo hospedeiro, a probabilidade de gerar falsos positivos ou negativos é muito reduzida a partir de ensaios anteriores que incluem apenas um marcador por traço. Este ensaio robusto e simples pode detectar essas características-chave do mosquito de forma rentável e em uma fração do tempo de ensaios existentes.

A identificação das espécies: Os cinco SNPs seguintes juntos identificar três espécies (A. arabiensis coluzzii A. e A. gambiae) (Tabela 4). Se a amostra não é uma das três espécies, os três SNPs (01073-213, 04.679-157 e 10313 -052) não conseguem amplificar. genótipo kdr para inferir resistência a inseticidas: A 1014 ° codão do canal de sódio p...

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A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Um ensaio para detecção multi-malária mosquitos transmissores

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

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13.0K visualizações.  School of Veterinary Medicine, University of California - Davis. Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.