We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.

<html> 1. Cultura celular (24-48 h antes da transfecção) <ol><li> 24-48 h antes da transfecção as sementes uma quantidade suficiente de células HEK293T com base no número de placas de 96 poços a ser transfectada. NOTA: Para transfecções consistentes, as células em placas a uma densidade suficiente para favorecer a divisão rápida, ainda não estar em mais do que 70-90% de confluência no momento da transfecção. </li><li> Cada placa de 96 poços requer 9 x 10 6 células (75.000 células por poço, e 120 poços por placa para ter em conta o uso de reservatório e pipeta multicanal). Calcular o tempo de duplicação de células HEK293 (tipicamente ~ 20 h), e semear o número adequado de células para se obter, pelo menos 9 x 10 6 células no momento da transfecção. Uma placa de cultura de 145 milímetros circular é tipicamente suficiente para três transfecções de 96 poços em que cresceram para ~ 90% de confluência, com ~ 10% de células restantes para propagar novamente uma nova placa. </li></ol> 2. Preparação antes da transfecção _content &quot;&gt; NOTA: A preparação de tampões e de DNA plasmídeo em 2,0-2,2 passo deve ser realizado no dia antes da transfecção, uma vez a preparação destes reagentes pode ser demorado. <ol><li> Clones 3&#39;UTR humanos que são compatíveis com o ensaio 3&#39;LIFE estão disponíveis através de um repositório plasmídeo público 30. Purifica-se o plasmídeo de ADN manualmente ou com robôs de manipulação de líquidos. Usar um grau de lise alcalina mini-prep de transfecção de 96 poços kit e seguir as instruções do fabricante. Ressuspender os vectores purificadas a ~ 100 ng / mL por poço. NOTA: O sinal da luciferase insuficiente resultará se a concentração de plasmídeo cai abaixo de 40 ng / ul. </li><li> Obter o pLIFE-miRNA vetores 30 ou clone usando o pipeline na Figura 1B 24. Ressuspender os vectores a uma concentração de 500 ng / mL para cada miARN e plasmídeos de controlo em branco. </li><li> Devido à sensibilidade das condições de tampão nucleofection, assegurar queo volume total de materiais transfectadas (incluindo células e plasmídeos) não excede 10% do total de líquido em cada poço da placa de transfecção de 96 poços. Para conseguir isso, concentra-se o plasmídeo da pLIFE-miARN a uma concentração de pelo menos 500 ng / ul. </li><li> Prepare 10x tampão reagentes luciferase de pirilampo (Tabela 1), e os reagentes tampão 1x Renilla luciferase (Tabela 2), que podem ser armazenadas por até 6 meses. NOTA: O DTT no tampão de luciferase de pirilampo deve ser armazenada em solução a -20 ° C em alíquotas de uso único. </li></ol> 3. Prepare Seguindo itens imediatamente antes da transfecção <ol><li> Preparar tampão de transfecção contendo PBS, 1,5% de HEPES, pH 7,0. Preparar esta fresco, embora possa ser armazenado durante até um mês a 4 ° C sem diminuições visíveis na eficiência de transfecção. Na formulação de volumes de tampão e de DNA plasmídeo, assumir 120 reacções para cada placa de 96 poços para sufficiently responsáveis ​​por erros de pipetagem e volume perdido usando reservatórios líquidos e pipetas multicanal. Alíquota de 18 ul por tampão de transfecção bem (120 poços / placa de 96 poços = 2,16 ml por placa), e reserve. NOTA: O dispositivo de célula de electroporação é extremamente sensível às condições de tampão utilizadas para transfectar as células. Precisão quando preparando buffers irá garantir um desempenho consistente do equipamento. Extra cuidado deve ser tomado quando da realização do ensaio para evitar a evaporação de tampões, especificamente através da minimização do tempo que o tampão é deixada descoberta em tubos de microcentrífuga, placas de 96 poços, reservatórios, e placas de eléctrodos. </li><li> Reserve quatro poços para os seguintes controles, não pLIFE-3&#39;UTR (para medir fundo de ensaio de luciferase), pLIFE-SV40 3&#39;UTR (controle de destino negativo), controlo positivo para miRNA # 1, o controlo positivo para miRNA # 2. NOTA: Estes vectores estão disponíveis publicamente 30. Alternativamente, qualquer alvo previamente validadopode ser usado como um controlo positivo. </li><li> Meios quentes, tripsina (0,25%) a 37 ° C. </li><li> A cada poço da placa de 96 poços de cultura de células, adicionar 200 ul de DMEM suplementado com 10% FBS, 1% de Pen / Strep, e colocados num banho a 37 ° C incubadora para utilização após a transfecção. </li><li> Ligue todos os dispositivos eletroporação célula seguidos pelo software de suporte. Use código de pulso FF120 para células HEK293T e tampão PBS / HEPES. </li></ol> 4. Preparação do plasmídeo de DNA e da mistura de células NOTA: O protocolo a seguir pressupõe transfecção de três placas de 96 poços em um experimento para uma tela com dois miRNAs (miRNA- # 1 e # 2 miRNA-). Cada placa irá corresponder à mesma placa de 96 poços de plasmídeos pLIFE-3&#39;UTR, e ser tratado três vezes com pLIFE-miARN-branco, pLIFE-miRNA- # 1, ou pLIFE-miRNA- # 2. <ol><li> Prepare três estoques de tampão de transfecção pLIFE-miRNA + para cada miRNA. Este estoque devem responder por 50% (10 mL) de volume total de cadaassim, multiplicado por 120 poços. Assim, cada unidade deve conter 1,08 ml de tampão + 120 l DNA plasmídeo (pLIFE-miRNA). </li><li> Remover as células a partir de 145 mm Placa de cultura por meios eluindo, lavando suavemente com PBS, e o tratamento com ~ 5 ml de tripsina a 0,25% durante 5 min a 37 ° C. Neutralizar a tripsina com um volume igual de meio, e as células de pelotas a 300 xg durante 5 min. </li><li> Remover tripsina / mídia e ressuspender sedimento em ~ 5-10 ml de mídia (dependendo da densidade celular e alcance exato de contador de células). </li><li> Contagem de células utilizando um contador de células. Certifique-se de que as células são&gt; 95% viáveis ​​e dentro do alcance exato da máquina. NOTA: Uma contagem de células imprecisa pode resultar de concentrações extremamente elevadas de células (&gt; 6.0 x 10 6 / ml). Transfecção de muitas células pode reduzir drasticamente a eficiência da miARN alvo, reduzindo plasmídeo: índice de célula e / ou a diminuir a eficiência da transfecção. </li><li> Alíquotas três tubos cada um contendo 9 x 10 6 células, o que corresponde às células de required para a transfecção de uma placa de 96 poços. Rotação células a 300 xg durante 3 min. </li><li> Remova a mídia. Certifique-se de remover o máximo de mídia como possível com o mínimo de perturbação do sedimento como excesso de mídia pode afetar a eficiência de transfecção. </li><li> Ressuspender as células em tampão 1,2 ml de transfecção / mistura plasmídeo miRNA, e reserve. </li><li> Os seguintes passos detalham ressuspensão de pLIFE-3&#39;UTR plasmídeo em tampão de transfecção. Enquanto isto ocorre em placas de 96 poços, ter o cuidado de evitar a evaporação do tampão por placas de cobertura em todos os momentos. <ol><li> Usando uma pipeta de canais múltiplos, mover 32,4 ul de tampão de transfecção para cada poço de uma placa de 96 poços de PCR (9 ul [por transfecção] * [3 placas] * 1.2 [para contabilizar erro pipeta]). </li><li> Adicionar 3,6 mL (~ 100 ng / uL) preparada de mini-pLIFE-3&#39;UTR plasmídeo a cada poço e homogeneizar. </li><li> Pipetar 10 ul desta mistura em cada poço da placa de 96 poços de transfecção e da tampa. </li></ol></li></ol><ol><li> Mova 1,2 ml do primeiro / buffer / mistura plasmídeo pLIFE-miRNA celular em reservatório. Misture bem. </li><li> Adicionar 10 ul desta mistura na primeira placa de 96 poços de transfecção já contendo 10 ul de tampão de transfecção / pLIFE-3&#39;UTR. Misture bem, pipetando cima e para baixo várias vezes. NOTA: Igual suspensão de células no mesmo tampão assegurará completa e passagem de corrente eléctrica através da cuvete e maximizar a eficiência da transfecção. </li><li> Coloque placa de 96 poços de transfecção no dispositivo de electroporação de células e iniciar a transfecção. </li><li> Uma vez que a transfecção é completa, adicionar 100 uL de meio de pré-aquecido a partir de placa de 96 poços de cultura de cada poço da placa de transfecção de 96 poços e misture bem. Mova 100 uL de cada poço na placa de cultura de 96 poços. </li><li> Misturar as células em placa de cultura com uma pipeta posicionado verticalmente no centro do poço, enquanto as células tendem a agregar nos lados do well a menos misturado adequadamente. </li><li> Repita 5,1-5,5 para os restantes duas placas. </li><li> Limpeza placa de transfecção de 96 poços <ol><li> As placas de transfecção de 96 poços podem ser reciclados por lavagem com etanol 70% para garantir que não haja transição de ácidos nucleicos entre experimentos. Execute duas lavagens de 70% EtOH utilizando um frasco de spray para encher completamente cada poço, seguido por limpando o excesso de EtOH nas tiras de eletrodos (lado inferior) e permitindo que as placas de transfecção para completamente seca na capa de cultura. NOTA: Testámos a transitar contaminação de ADN por transfecção de 12 poços com 2 ug pmaxGFP cada plasmídeo em células HEK293T, seguido por uma única lavagem com EtOH a 70%, e uma segunda transfecção com plasmídeo sem DNA. Com esta concentração extremamente elevada de plasmídeo, extremamente brilhante repórter, e uma única lavagem, não havia nenhuma fluorescência observável em qualquer um dos 12 transfecções em duplicado. </li></ol></li><li> Células de cultura durante 48-72 horas a 37 ° C, seguido pela dupla Lucifapagar ensaio. </li></ol> 6. Lisado celular Preparação de Ensaio de Luciferase <ol><li> Diluir tampão de lise com água 4 partes, uma parte de 5x tampão de lise passivo em um reservatório. Calcular 26 ul / poço, acrescentando ~ 20 volumes adicionais para contribuir para uma perda no reservatório. NOTA: Tampão é armazenado a -20 ° C e pode ser extremamente viscoso, ou seja, antes de permitir que o tampão 5x para aproximar temperatura ambiente irá melhorar a precisão de pipetagem. </li><li> Analisar cada poço para a eficiência de transfecção utilizando a microscopia de fluorescência. Nota quaisquer inconsistências em poços que não transfectar de forma eficiente (&gt; 90% de eficiência de transfecção), ou estão expressando baixos níveis de RFP indicativo de superlotação ou mídia exaustão. Remova os poços da análise. </li><li> Completamente remover a mídia a partir das células, tomando cuidado para não eluir muito rapidamente que fará com que as células de separar. NOTA: mídia restante irá diluir o ligado e causar flutuações de valores em todo experiments. </li><li> Adicionar 26 mL de tampão de lise a cada poço, e coloque em um prato shaker / balancim em velocidade baixa / moderada para ~ 20-30 min. Use esse tempo para preparar tampões de luciferase, lavar e preparar o luminómetro (s), e transferir ligado às placas de medição opacos. </li></ol> 7. Ensaio de Luciferase Duplo NOTA: Se várias placas estão sendo medidos sequencialmente em um luminómetro, criar misturas principais tampão com tudo, exceto ATP e substratos, acrescentando estes reagentes seguido por ajuste de pH imediatamente antes da utilização, com cada placa. ATP e substratos podem degradar ao longo do tempo; consistência na quantidade de tempo que estes reagentes estão no buffer irá melhorar a consistência entre vários pratos. <ol><li> Prepare tampões luciferase 1x (Tabela 1): <ol><li> Enrole dois tubos (tipicamente 15/50 ml tubos de centrífuga) contendo o vaga-lume e buffers Renilla com folha de alumínio, como substratos pode ser sensível à luz. </li><li>Prepare tampão luciferase 1x Firefly. Adicionar 1 ml de cada um dos cinco 10x reagentes luciferase de pirilampo, a adição de EGTA a última, a 5 ml de H 2 0 a uma concentração final de 1x. <ol><li> Adicionar 0,025 g ATP para 10 ml de 1x tampão de pirilampo. Misture invertendo várias vezes. Manter em gelo ATP em todos os momentos. ATP irá degradar, por isso, se medindo mais de uma placa sequencialmente, buffer deve ser feita no início desta etapa para cada placa adicional. </li><li> Adicionar 100 ul de luciferina 100 besouro (substrato) (Tabela 1) Tampão devem mudar a cor amarelada com base no pH. </li></ol></li><li> 1x tampão de luciferase de Renilla reconstituição: Por placa de 96 poços, uma alíquota de 10 ml de um &quot;tampão de Renilla&quot;. <ol><li> Adiciona-se 100 ul de BSA (44 mg / ml de stock). </li><li> Se o rastreio mais de uma placa, mix principal separado em 10 ml alíquotas. </li><li> Adicionar 100 ul de tampão de coelenterazina (previamente divididos em alíquotas e armazenado a 100x conc.) </li></ol></li> &lt;li&gt; Ajustar o pH de 1x tampão de pirilampo para 8,0, seguido de tampão 1x a Renilla para 5,0 usando NaOH e HCl. NOTA: A actividade de cada tampão, e a capacidade da memória intermédia de Renilla para extinguir a actividade da luciferase do pirilampo é altamente dependente do pH. Para obter resultados consistentes ser extremamente precisos nesta etapa. </li><li> Levar o volume de cada tampão (correspondente a uma placa de 96 poços) a 10,5 ml de acomodar para luminómetro escorva. </li></ol></li><li> Transferir o lisado para placas brancas opacas: Neste ponto, as células devem ser em tampão de lise durante ~ 20 min. Pegue 25 ul de cada poço utilizando uma pipeta multicanal, certifique-se de pipeta cima e para baixo cuidadosamente para quebrar os aglomerados de células e homogeneizar o ligado. </li><li> Prepara-se o luminómetro. Ligue o luminómetro e selecione o protocolo na pasta DLR, chamado de &quot;DLR com duas injeções&quot;. Outros formatos não são compatíveis com o pipeline de análise de dados (abaixo). <ol><li> Selecione os poços para ser tresse (todos os poços é o padrão). </li><li> Estender o &quot;Atraso antes da medição &#39;configuração para 5 segundos, com um tempo de medição de 10 segundos (ver 29 para explicação). </li><li> Capilares passos de lavagem: 3x água, EtOH 3x 3x, água, 3x seco. Buffers Prime uma vez para o lixo, e então primeiro pela segunda vez de volta para os tubos de tampão para assegurar a mistura. Injectar o buffer vaga-lume primeiro e principal-lo no capilar esquerda, seguido de Renilla no capilar direita. </li></ol></li><li> Iniciar o ensaio de luciferase. Cada placa deve ter ~ 48 min de ler. Após a conclusão salvar o arquivo primeiro e, em seguida, repita os passos de lavagem e desligar o luminómetro. NOTA: Vários pratos podem ser lidos e os dados armazenados no mesmo arquivo excel, no entanto questões podem ser encontradas com placa de várias leituras onde o programa luminï¿½etro irá falhar. Certifique-se de salvar todos os dados entre as medições e tirar screenshots se programa trava antes de save é possível. <ol><li> Substitua buffers velhoscom o novo, certificando-se de primordial pelo menos duas vezes com novos amortecedores antes de iniciar a nova placa. </li></ol></li></ol> Análise 8. Dados <ol><li> Utilize tabelas do Excel &quot;3&#39;LIFE - análise de placa única&quot; e &quot;3&#39;LIFE - análise multiplate&quot; disponível a partir <a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com</a> . Copie dados brutos para vaga-lume e Renilla luciferase medições de arquivo de saída luminómetro em locais correspondentes à condição negativa, miRNA # 1, # 2 e miRNA no &quot;3&#39;LIFE - análise placa single&quot; planilha. </li><li> A planilha calculará automaticamente vaga-lume rácio / Renilla e normalizar cada miRNA para o controlo negativo adequado, e normalizar os valores de repressão através de cada prato. NOTA: Esta planilha irá identificar automaticamente poços com sinal de baixa luciferase, realce poços significativamente reprimidas, e fornecer medidas de repressina em toda a placa. Veja 24 para explicação detalhada de análise estatística. <ol><li> Copiar os valores de caixa &quot;Normalized Índice RI&quot;, em células correspondentes no &quot;3&#39;LIFE - análise multipanel&quot; folha de cálculo na posição correspondente para replicar # 1 para cada miARN testado. Repetir para todos os replicados biológicos realizados em dias diferentes. </li></ol></li><li> Se desejado, inserir os nomes de genes alvo e estado de predição nas colunas B e D, respectivamente. <ol><li> Permitir que a planilha para calcular automaticamente a média de todas as placas. Observar os dados em formato de 96 cavidades como um mapa de calor (Figura 2). O arquivo também organiza os dados em formato de lista (Figura 2). NOTA: O índice de repressão é a medida utilizada para identificar alvos de miARN putativos. Restringência parâmetros diferentes pode ser utilizado, com base nas preferências individuais. Em média, nós consideramos prováveis ​​sucessos abaixo índice de repressão de 0.8 e estatisticamente significativa pelo teste t (valor p &lt;0,05). Como mostrado na Figura 3 alvos potenciais com base nesses critérios serão destacadas em vermelho. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Pasquinelli, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+sequence+and+temporal+expression+of+let-7+heterochronic+regulatory+RNA.">Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA.</a> Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).</li><li>Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+plants.">MicroRNAs in plants.</a> Genes Dev. 16 (13), 1616-1626 (2002).</li><li>Ivey, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+regulation+of+cell+lineages+in+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).</li><li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14.">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li><li>Wienholds, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+in+zebrafish+embryonic+development.">MicroRNA expression in zebrafish embryonic development.</a> Science. 309 (5732), 310-311 (2005).</li><li>Darnell, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+during+chick+embryo+development.">MicroRNA expression during chick embryo development.</a> Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).</li><li>Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+and+microRNAs+in+fragile+X+mental+retardation.">RNA and microRNAs in fragile X mental retardation.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MicroRNA+feedback+circuit+in+midbrain+dopamine+neurons.">A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons.</a> Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).</li><li>Poy, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pancreatic+islet-specific+microRNA+regulates+insulin+secretion.">A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion.</a> Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+in+human+cancers.">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).</li><li>Paraskevopoulou, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIANA-microT+web+server+v5.0:+service+integration+into+miRNA+functional+analysis+workflows.">DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows.</a> Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).</li><li>Krek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+microRNA+target+predictions.">Combinatorial microRNA target predictions.</a> Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+target+recognition+and+regulatory+functions.">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136 (2), 215-233 (2009).</li><li>Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+microRNA+let-7+binds+to+imperfect+let-7+complementary+sites+from+the+lin-41+3'UTR.">The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR.</a> Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).</li><li>Lal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-24+Inhibits+cell+proliferation+by+targeting+E2F2,+MYC,+and+other+cell-cycle+genes+via+binding+to+'seedless'+3'UTR+microRNA+recognition+elements.">miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to 'seedless' 3'UTR microRNA recognition elements.</a> Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).</li><li>Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+structure+of+the+let-7+miRNA+interacting+with+the+site+LCS1+of+lin-41+mRNA+from+Caenorhabditis+elegans.">NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).</li><li>Shin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+microRNA+targeting+code:+functional+sites+with+centered+pairing.">Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing.</a> Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).</li><li>Azzouzi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-96+directly+inhibits+gamma-globin+expression+in+human+erythropoiesis.">MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis.</a> PLoS One. 6 (7), e22838 (2011).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-193b+Regulates+Mcl-1+in+Melanoma.">miR-193b Regulates Mcl-1 in Melanoma.</a> Am J Pathol. 179 (5), 2162-2168 (2011).</li><li>Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+mode+of+microRNA+target+recognition.">An alternative mode of microRNA target recognition.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).</li><li>Jiao, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+targeting+oncogenes+are+down-regulated+in+pancreatic+malignant+transformation+from+benign+tumors.">MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors.</a> PLoS One. 7 (2), e32068 (2012).</li><li>Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'LIFE:+a+functional+assay+to+detect+miRNA+targets+in+high-throughput.">3'LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput.</a> Nucleic Acids Res. , (2014).</li><li>Mangone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+C.+elegans+3'UTRs.">The landscape of C. elegans 3'UTRs.</a> Science. 329 (5990), 432-435 (2010).</li><li>Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A-to-I+editing+of+microRNAs+in+the+mammalian+brain+increases+during+development.">A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development.</a> Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).</li><li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m(6)A+RNA+methylation.">Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screens+of+miRNA-mRNA+interactions+unveiled+that+the+3'UTR+of+a+gene+is+targeted+by+multiple+miRNAs.">Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3'UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs.</a> Plos One. 8 (7), e68204 (2013).</li><li>Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noncommercial+dual+luciferase+enzyme+assay+system+for+reporter+gene+analysis.">A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis.</a> Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).</li><li>Seiler, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNASU+plasmid+and+PSI:Biology-Materials+repositories:+resources+to+accelerate+biological+research.">DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research.</a> Nucleic Acids Res. , (2013).</li><li>Baek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microRNAs+on+protein+output.">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).</li><li>Ebert, M. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+MicroRNAs+in+Conferring+Robustness+to+Biological+Processes.">Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes.</a> Cell. 149 (3), 515-524 (2012).</li><li>Pelaez, N., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+robustness+and+the+role+of+microRNAs:+a+network+perspective.">Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective.</a> Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).</li></ol>

This work is supported by funds from the College of Liberal Arts and Science and the Biodesign Institute at Arizona State University and NIH Exploratory/Developmental Research Grant 1R21CA179144-01A1.

O ensaio 3&#39;LIFE identifica alvos miRNA funcionais em 3&#39;UTRs em high-throughput. Este ensaio é útil para investigadores que desejam identificar experimentalmente um grande número de possíveis alvos para a sua miARN de interesse. O ensaio 3&#39;LIFE é uma abordagem poderosa para consultar 3&#39;UTR regulação accionado, em que o ensaio fornece uma medida funcional de miARN direccionamento, e o teste de binário de um único repórter :: 3&#39;UTR contra um único miARN pode confiantemente tratar o estado de ...

O objetivo geral deste método é detectar e mapear precisamente microRNA (miRNA) em alvos de alto rendimento. MiRNAs são ARNs endógeno não-codificantes ~ 22 nucleótidos de comprimento. Após a transcrição e processamento, miARNs maduros são incorporadas num complexo proteína chamada o ARN de silenciamento induzido complexo (RISC). Cada miRNA orienta o RISC de elementos localizados principalmente nas regiões 3&#39;untranslated (3&#39;UTRs) de RNA mensageiro (mRNA) alvo, resultando em repressão ou tradução ou clivagem mRNA 1. Mirna reconhecer sites de destino com base no padrão de Watson-Crick e G: U oscilar base emparelhamento, e são degenerados na natureza, que contém vários pares de bases incompatíveis e regiões incharam. Muitos miARNs são amplamente conservada de plantas para os seres humanos 2,3, em que desempenham uma grande variedade de funções biológicas. Em metazoans miRNAs pode influenciar vários processos biológicos incluindo as decisões do destino da célula 4, o calendário de desenvolvimento 5 </sup&gt; E, freqüentemente, apresentam padrões de expressão específicos de tecidos 6,7. MiARN misexpression também pode resultar na regulação do gene aberrante, que pode ter uma influência significativa no comportamento das células com base unicamente na função de genes alvo. Como tal, miARNs estão ligadas a uma ampla gama de doenças, incluindo a neurodegeneração 8,9, diabetes 10 e 11 do cancro. Bioinformática e abordagens molhado de bancada sugerem que cada miARN pode ser capaz de se direccionar centenas a milhares de ARNm distintas 12-14, o que indica que de alto rendimento ou do genoma abordagens de largura são necessários para investigar este grande grupo de potenciais interacções. Identificar genes-alvo é um componente crítico de mechanistically definindo função miRNA, e para isso os pesquisadores devem ser capazes de revelar alvos em grande escala. Várias abordagens foram desenvolvidas para identificar alvos de miARN, incluindo algoritmos de previsão de bioinformática, sequenciação de alto rendimentodo ARNm alvo, e ensaios baseados repórter. Cada uma dessas abordagens tem pontos fortes e fraquezas inerentes. Dado que miARN direccionamento é guiado pela especificidade da sequência, especialmente de 2-6 nucleótidos de miARN (denominada região da semente), vários algoritmos foram desenvolvidos para prever alvos miARN ao longo do genoma de muitos organismos. Esses algoritmos são treinados usando os motivos de emparelhamento de bases observados de alvos miRNA validados, e freqüentemente utilizam parâmetros como emparelhamento rigorosas de sementes, conservação de sítios, e / ou estabilidade termodinâmica 15. Embora esses filtros refinar o grande número de possíveis alvos com complementaridade suficiente para destinos somente altos de confiança, eles podem excluir espécies locais específicos e não-canônicos alvo de miRNA, evidências recentes sugerem que são difundidos 16-24. Além disso, estas previsões não têm em conta os mecanismos de processamento de mRNA que excluem locais alvo de miRNA, tais como poliadenilação alternativa25, edição de 26 de RNA, RNA metilação 27, e ligação cooperativa. Como tal, as altas taxas positivos e falsos negativos falsos têm sido relatados por muitos algoritmos 22,24,28. Enquanto estes algoritmos são úteis para identificar candidatos alvos miRNA para validação experimental posterior, estas taxas de erro elevadas limitar a eficácia de abordagens de bioinformática para miRNA detecção do alvo sistemático. Para sondar sistematicamente as interacções entre uma dada miARN e 3&#39;UTRs potencialmente segmentados temos desenvolvido um ensaio de elevado débito chamados luminescentes Identificação de elementos funcionais na 3&#39;UTRs (3&#39;LIFE 24). Este ensaio mede interacções directas e repressão de translação da 3&#39;UTR de teste por uma consulta miARN utilizando um sistema repórter de luciferase duplo. Neste sistema, o 3 &#39;UTR de um gene de interesse é clonado a jusante da luciferase (FLUC) repórter grelha de leitura do pirilampo. Os contras repórtertruct é co-transfectado com uma consulta de miARN em células HEK293T. MiARN direccionamento é determinada pela medição da alteração relativa entre o FLUC teste :: repórter 3&#39;UTR e um segundo não específica repórter de luciferase de Renilla. Importante, ensaios de luciferase detectar interacções funcionais miARN / ARNm que influenciam a saída de translação do repórter. Esta é uma das principais vantagens sobre os métodos tradicionais para detectar regulamento miRNA, como RT-qPCR e Western blot, em que este ignora diferenças na degradação do mRNA e repressão translacional, bem como mudanças na abundância de proteína independente de regulação baseada 3&#39;UTR. Os ensaios de luciferase são amplamente utilizados para validar alvos diretos de miRNA por causa de sua relativa simplicidade e sensibilidade, mas seu uso em telas de alto rendimento é limitado por elevados custos associados com reagentes de consumo, a falta de bibliotecas 3&#39;UTR de fontes públicas, ea ausência de prot luciferase padronizadaocols, levando a dificuldades na comparação de repressão funcional em vários conjuntos de dados. Para facilitar a utilização do ensaio 3&#39;LIFE, nós colocamos ênfase na simplificação do design experimental, a utilização de transfecção 24 e luciferase reagentes não-comerciais 29, criando uma biblioteca 3&#39;UTR que é regularmente atualizada e expandida, e está disponível através um repositório plasmídeo público 30. A escalabilidade do ensaio 3&#39;LIFE permite o rastreio de uma grande biblioteca 3&#39;UTR para segmentação por um determinado miRNA sem polarização da tela em direção genes bioinformatically identificados. Além de testar interacções canónicos e preditos, esta abordagem permite a identificação sistemática de novos alvos impulsionados através de interacções não canónicos e / ou específica da espécie. Importantemente, o efeito da miARN alvo na produção de proteína é geralmente entendida para resultar em modesta repressão translacional 15,31 &lt;/ Sup&gt;, sugerindo que um papel principal de regulação miRNA é para afinar saída proteína, proteger contra os níveis de expressão de genes aberrantes, e proporcionam robustez a célula programas específicos 32,33. A sensibilidade do ensaio de luciferase combinado com o inerentemente grande número de interacções miARN / ARNm negativos na tela de 3&#39;LIFE permite a detecção de efeitos subtis da miARN alvo em um grande número de genes, e a identificação de múltiplos componentes de redes de genes que são regulados por um determinado miRNA 24. Aqui nós descrevemos o protocolo 3&#39;LIFE, e demonstrar que é viabilidade pela triagem dois miRNAs bem caracterizados, miR-10b e deixe-7c contra um painel de 275 3&#39;UTRs humanos (Figura 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycylglycine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1127-25G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kx PO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P2222</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATP</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">FLAAS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CoA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C4282</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">luciferin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L9504</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E0399</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K H2 P O4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1551139</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaN3</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coelenterazine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3230</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS/HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5546</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2442</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pennicilin/Streptomicin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;">T2600000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Consumables</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MaxiPrep Kit</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A2392</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well miniprep plate</td>
			<td style="width:71px;">Pall</td>
			<td>8032</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well shuttle plates</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">V4SP-2096</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5x Lysis Buffer</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td>E1941&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instruments</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well GloMax Plate Reader</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E9032</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biomech FX Liquid Handler Robot</td>
			<td style="width:71px;">Beckmann</td>
			<td style="width:119px;">A31842</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4D-Nucleofector Core Unit</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">AAF-1001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well Shuttle System</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">AAM-1001</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell Counter Countess</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C10227</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of mirna targets in high-throughput using the 3'life assay

Luminescente Identificação de elementos funcionais em 3&#39;UTRs (3&#39;LIFE) permite a rápida identificação de alvos de miRNAs específicos dentro de uma matriz de centenas de 3&#39;UTRs consultados. Identificação do alvo baseia-se no ensaio de luciferase dupla, que detecta a ligação ao nível do ARNm por medição da produção de translação, dando uma leitura funcional de miARN alvo. 3&#39;LIFE usa buffers não-proprietários e reagentes, e bibliotecas repórter publicamente disponíveis, tornando as telas do genoma viável e rentável. 3&#39;LIFE pode ser realizada quer num ambiente de laboratório padrão ou ampliados usando robôs de manipulação de líquidos e outros instrumentos de alto rendimento. Nós ilustrar a abordagem que utiliza um conjunto de dados de 3&#39;UTRs humanos clonados em placas de 96 alvéolos, e duas miARNs de teste, deixa-7c e miR-10b. Nós demonstramos como realizar a preparação de DNA, transfecção, cultura de células e ensaios de luciferase em formato de 96 poços, e fornecer ferramentas para dadosanálise. Em conclusão 3&#39;LIFE é altamente reprodutível, rápida, sistemática e identifica alvos elevados de confiança.

O arquivo de saída luminï¿½etro contém medidas brutos para ambas as proteínas vaga-lume e Renilla luciferase. Este formato bruto é compatível com o &quot;3&#39;LIFE - análise de placa única&quot; e &quot;3&#39;LIFE - análise multiplate&quot; planilhas disponíveis no site do laboratório Mangone ( <a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com</a> ). A única planilha análise placa calcula automaticamente vaga-lume rácio / Renilla, normaliza cada miRNA para o controlo negativo adeq...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay at JoVE.com

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Detecção de alvos miRNA em métodos de alta capacidade utilizando o ensaio 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

detection-of-mirna-targets-in-high-throughput-using-the-3-life-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

10.0K visualizações.  Arizona State University. Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Vídeo: Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

Alto rendimento Assay Sacarificação para materiais lignocelulósicos

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Biologia

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

Genome-wide tela de Metas de miRNA Usando a missão Biblioteca ID Alvo

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

De alto rendimento cristalização de proteínas de membrana Usando o método Bicelle lipídico

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

Alta capacidade mapeamento físico de cromossomos usando Automated<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Do genoma deleções de genes em<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de Alto Rendimento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

RNA Secundária Previsão Estrutura Usando SHAPE de alta capacidade

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

De alta capacidade de Triagem funcional usando um caseiro Dual-brilho ensaio de luciferase

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identificação de pares Kinase-substrato utilizando High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energia Despesas Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...