Este trabalho foi suportado pelo R01 concessão de NIH / NHLBI HL082689 para Scott I. Simon e Anthony G. Passerini.

1. Cultura de Células e Preparação do Substrato <ol><li> Cortar 3 polegadas substratos circulares de um prato 100 20 milímetros x cultura de tecido (BD Falcon), utilizando um torno. Esterilizar substratos por submersão em etanol a 70%. Colocar em uma placa de Petri e revestimento com 4 ml de colagénio tipo I (100 ug / ml) durante 1 h à temperatura ambiente, em seguida lavar com 4 ml de 1 x PBS. </li><li> Suspender Humanos células endoteliais aórticas (AHCE, a passagem 4-6) em 5 6.5x10 células / ml e de sementes aplicando 1 ml directamente ao substrato. Colocar em um 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora e permitir que as células aderem ao substrato durante 1 hora. </li><li> Adicionar 9 ml de crescimento endotelial Médio-2 (EGM-2) suplementado com 1x solução de antibiótico-antimicótico para as células. Alterar meios cada 2 dias até as células atingirem 90% de confluência. </li><li> Manter células THP-1 em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS e solução 1x antibiótico-antimicótico. Células de passagem quando atingem uma densidade de 10 6 células / ml. </li></ol> 2. Protocolo Shearing celular As células são condicionados numa personalizado dispositivo de corte de cone e prato-Cell (CSD). Detalhes do dispositivo e as especificações de concepção estão documentados na Tabela 1 e Figura 4. <ol><li> Prepare o CSD. Esterilizar a caixa de uma câmara com etanol e lavar com PBS estéril. Aquecer a carcaça para 37 ° C e nível para garantir que o cone é perpendicular à monocamada de células. Montar o substrato com as células a partir do fundo da caixa e definir o cone para a altura desejada. </li><li> Use Leibovitz-15 (L-15) meio suplementado com BulletKit endotelial como o meio de corte para manter o pH apropriado na ausência de CO 2. Para estimular a inflamação, adicionar necrose tumoral-α (TNF-α, 0,5 ng / ml) ao meio de corte e injectar 6 ml no dispositivo através de uma seringa ligada a um orifício de entrada, tendo o cuidado de não introduzir arbolhas no interior da câmara. </li><li> Células de cisalhamento com uma elevada tensão de corte magnitude constante (HSS, 15 dyne / cm 2) ou uma tensão de cisalhamento oscilatório (OSS, 0 ± 5 dines / cm 2, 1 Hz) durante 4 horas. A SS desejado é conseguido pela rotação do cone acima das células, o que é precisamente controlado com um motor de micro-stepping como descrito anteriormente 6 A SS parede na superfície (τ w) é aproximada por.: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq1.jpg" alt="Equação 1" /> onde μ é a viscosidade do meio, ω é a velocidade angular do cone, e α é o ângulo de cone (0,5 °). O alinhamento de cone com o substrato é ajustada para dentro 0,05 ° por meio de nivelamento de precisão e da altura lacuna fixado em 20 ± 10 mM usando um medidor de profundidade para minimizar a variação circunferencial e radial em τ w. O dispositivo foi validado para garantir características de fluxo laminar. Remova cells a partir do dispositivo e preparar para a análise de adesão de monócitos. </li></ol> 3. Fabricação de PDMS microfluídicos Câmara <ol><li> Obter molde mestre para o número do canal desejado microfluídicos e altura do canal, dependendo da aplicação. As características da concepção específica utilizada neste protocolo são detalhados na Tabela 1. O método para criar estes já está bem documentado na literatura. 1 Resumidamente, a rede de canais é concebido usando software de CAD (Autodesk Inventor) e impresso em 5000 dpi em uma transparência. Fotorresiste negativo (SU8) é fiado em uma pastilha de silício até uma espessura de 100 mm. A transparência é sobreposto e expostas à luz UV. Non-polimerizado material fotosensitivo é removida para gerar a réplica de mestre positivo. </li><li> Para fazer a solução de PDMS base de silicone mistura com silicone agente de cura 10:01, em peso, de um barco pesar e agita-se com uma pipeta de 5 ml serológico. Tenha cuidado para não raspar as paredespesar do barco para evitar a adição de flocos de plástico para a solução. </li><li> Coloque a bolacha mestre em uma placa de Petri 100x15mm e despeje a solução de PDMS para o prato. </li><li> Cobrir o prato e colocá-lo dentro de um recipiente a vácuo durante 15 minutos para remover bolhas. Depois de 15 minutos tomar a placa de Petri para fora e remover as bolhas excesso suavemente soprando ar sobre a superfície. </li><li> Colocar a placa de Petri num forno durante 1 hora a 70 ° C. Retire o prato e cortar as câmaras microfluídicos utilizando uma lâmina afiada. </li></ol> 4. Montagem do dispositivo em Microscópio <ol><li> Ligue fonte de luz para microscópio invertido e definir aquecedor para 37 ° C. Anexar tubagem para uma seringa de 10 ml e encher com água destilada de modo que não existem bolhas. Coloque a seringa na bomba de seringa ea taxa de fluxo conjunto para induzir uma parede de SS 1 dine / cm 2. A tensão de cisalhamento de parede (τ w) gerado ao longo da linha central do canal é aproximada utilizando o padrãoequação para uma câmara de fluxo de placas paralelas: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq2.jpg" alt="Equação 2" /> onde μ é a viscosidade do meio, Q é o caudal volumétrico, h é a altura do canal, e w é a largura do canal. Nota: uma vez que os canais são de largura finita a real τ w irá variar com w dependendo do canal relação de aspecto, e as medições são evitados a 25% mais próximo das paredes laterais. 1,7 </li><li> Coloque PDMS câmara em água e usar uma micropipeta 100 uL para remover o ar a partir dos canais individuais. Ligue o adaptador de câmara de vácuo para garantir que a válvula está definido para fora. </li><li> Coloque placa de Petri com AHCE monocamada sobre o objetivo. Coloque a câmara de PDMS sobre a placa de Petri e cuidadosamente ajustado na monocamada AHCE enquanto assegurando que não existem bolhas de ar formam entre o dispositivo ea monocamada. Gire a válvula para que o vácuo é ligado ea câmara está bem encaixada. </li&gt; <li> Cortar 19 agulhas de calibre sem corte tal que existe apenas 5 mm de lado esquerdo do metal. Encha o reservatório de plástico com tampão e colocar em PDMS entrada da câmara. Repetir para número apropriado de canais a serem utilizados. Anexar tubulação de bombas de seringa para saídas de PDMS canal. </li></ol> 5. Ensaio de adesão de monócitos Sob tensão de cisalhamento <ol><li> Suspender células THP-1 em 2x10 6 células / ml em HBSS + Ca 2 + / Mg + + 2 HSA a 0,1%. Activar células THP-1, por incubação com factor-1 derivado do estroma (SDF-1, 50 ug / ml) durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Ligue bomba de seringa para estabelecer o fluxo, em seguida, adicionar 50 ul de suspensão de células para o reservatório sem a introdução de bolhas de ar. Quando o fluxo é totalmente desenvolvido, comece a aquisição de dados. </li><li> Executar durante 5 min a taxa de fluxo adequado, adicionando tampão para o reservatório se a solução fica baixo. Continue fluindo tampão para os canais para lavar as células não ligadas na corrente de fluxo. </li></ol> 6. Aquisição de Dados e Análise <ol><li> Adquirir sequências de imagens digitais em 3 de imagens / s durante 2 min após o fluxo totalmente desenvolvida ao longo do eixo longitudinal do canal, 3 localizações no canal, tendo cuidado para não gravar imediatamente após a entrada ou antes ou aberturas de saída no 25% mais próximo do lado paredes. </li><li> Contar o número de células presos por campo, identificando a sua aparência fase brilhante no mesmo plano focal como a monocamada. </li><li> Prisão célula firme é definida pelo movimento &lt;½ diâmetro da célula em 10 s. Média de dados com mais de 3 campos aleatórios / canal e quantificar usando software ImageJ. </li></ol> 7. Os resultados representativos Embora o endotélio vascular é uniformemente expostas a agonistas que contribuem para a inflamação sistémica, a aterosclerose é uma doença focal que se desenvolve preferencialmente em locais de perturbação do fluxo nas artérias, implicando heterogeneidade espacial da função endotelial. 8 </sup&gt; circulantes mediadores inflamatórios, tais como TNF-α são elevadas no soro humano sob stress metabólico e correlacionar com a função endotelial prejudicada. 9, 10 TNF-α induz uma resposta bem caracterizados em CE que inclui up-regulation de moléculas de adesão celular (CAM ; por exemplo, VCAM-1, ICAM-1, E-selectina) e quimiocinas que recrutam monócitos da circulação, uma característica da lesão aterosclerótica precoce 11 Hemodinâmica é um importante regulador do fenótipo inflamatório endotelial 12 tensão de cisalhamento alta magnitude (HSS..; por exemplo de 15 dines / cm 2) ou tensão de corte pulsátil (PSS; por exemplo, 15 ± 5 dinas / cm 2) associados com sítios de resistência à aterosclerose em artérias down-regulam TNF-α as respostas induzidas. Por outro lado, baixa tensão de cisalhamento magnitude (LSS, por exemplo, 2 dinas / cm 2) ou de cisalhamento oscilatório (OSS; por exemplo, 0 ± 5 dinas / cm 2), característico de locais suscetíveis in vivo, exacerbar cytokine inflamação induzida 13., 14 Nossos dispositivos microfluídicos de PDMS fornecer uma plataforma para a realização de estudos sobre os mecanismos para testar hipóteses relacionadas com a superposição de estresse metabólico com fatores hidrodinâmicos na regulação da função endotelial e patologia. A utilidade e versatilidade da abordagem é amplamente ilustrado através dos resultados representativos que se seguem. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. Tensão de cisalhamento diferencialmente modula THP-1 de adesão celular para monocamadas inflamadas de TNF-a endoteliais. Estes dados foram adquiridos utilizando o protocolo detalhado acima descritos e documentados no vídeo. Monocamadas HAEC foram simultaneamente expostos a uma dose baixa da citoquina inflamatória TNF-α (0,5 ng / ml, ~ CE 50 para VCAM-1 up-regulation) e quer HSS (15 dines / cm 2) ou OSS (0 ± 5 dinas / cm 2, 1 Hz), em um CSD personalizado para 4 hr como descricama no protocolo detalhado. THP-1 de detenção celular foi quantificada sob fluxo de cisalhamento em uma câmara de fluxo PDMS. Esta linha de células que imita o fenótipo de monócitos humanos foi escolhido pela sua reprodutibilidade e facilidade de utilização. HSS atenuou a resposta inflamatória em comparação com OSS, resultando numa redução de detenção célula THP-1. Os dados foram analisados ​​pelo teste t de Student e estão representados como média ± EPM de 3 experimentos independentes. Adaptado com permissão de DeVerse et al. 5 Os dados a seguir demonstram a versatilidade da nossa abordagem usando exemplos do nosso trabalho publicado. Saídas a partir do protocolo acima são indicados onde for aplicável. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig2.jpg" alt="A Figura 2" /> Figura 2. Modulação da expressão de VCAM-1 induzida por citocina e recrutamento de monócitos em um gradiente de tensão de cisalhamento. A) monocamadas HAEC foram estimuladas com TNF-α (0,3 ng / ml) durante 4 h sob flow em uma VMMC desenhado com base Hele-Shaw teoria de fluxo. 15 Uma diminuição linear em magnitude SS ao longo da linha central do canal foi conseguida através da concepção de as paredes laterais da câmara de modo a coincidir com a simplifica de um fluxo de estagnação bidimensional e moldando o fim do canal para coincidir com as linhas de iso-potenciais. A tensão de cisalhamento de parede (τ w) gerado ao longo da linha central deste canal a uma distância axial a partir da entrada (x) é dada por: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq3.jpg" alt="Equação 3" /> onde μ é a viscosidade do meio, Q é o caudal volumétrico, h é a altura do canal, w 1 é a largura do canal de entrada, e L é o comprimento total do canal. Q foi escolhido para gerar um gradiente em magnitude SS a partir de 16 dines/cm2 na entrada a 0 no ponto de estagnação &quot;a&quot; apenas proximal ao outlet. B)-C) VCAM-1 expressão foi medida in situ por microscopia de imunofluorescência utilizando anticorpos conjugados com pontos quânticos e apresentados como percentagem de intensidade de fluorescência média (IFM) de não estimulada controlo estático. SS não modular o nível basal da expressão de VCAM-1, que é baixa em AHCE não estimulada (triângulos cinza). No entanto, a VCAM-1 em relação à expressão aumentada de TNF-α em magnitudes de LSS, atingindo um máximo de ~ 2 dines / cm 2 e retornando à linha de base de TNF-α ou abaixo em magnitudes de cisalhamento&gt; 5 dinas / cm 2 (quadrados pretos). D) Os monócitos (10 6 / ml) foram perfundidos menos 2 dines / cm 2 por 5 min, em canais de fluxo paralelos sobre monocamadas pré-condicionadas como em A). Recrutamento de monócitos ao endotélio quantitativamente correlacionada com a expressão VCAM-1 com uma grandeza dada cisalhamento. Notavelmente, a capacidade para sondar VCAM-1 e expressão recrutamento de monócitos com resolução espacial muito bem em um monolayer revelou alterações significativas ao longo de um intervalo estreito em magnitude SS que não seria apreciada através da aplicação de apenas alguns valores discretos de cisalhamento em experiências separadas. Os dados foram analisados ​​por ANOVA repetidas medidas e as diferenças avaliadas por pós-teste de Newman-Keuls, * P &lt;0,05 a partir de TNF-α, em condições estáticas. Os dados são média ± EPM de 3-6 experimentos independentes. Adaptado com permissão de Tsou et al. 2 <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. Triglicéridos ricos em lipoproteínas (TGRL) modulam citocina induzida por inflamação em proporção aos níveis séricos de doadores de triglicéridos e VCAM-1 de expressão. Monocamadas HAEC foram estimuladas com TNF-α (0,3 ng / ml) durante 4 horas em simultâneo com TGRL (10 mg / dl ApoB) isolado a partir de sujeitos humanos após uma refeição com elevado de gordura em cultura estática. A) VCAM-1 expressão foi medida separadamente em CE suspenso por citometria de fluxoe adesão de monócitos quantificados utilizando um VMMC como descrito no protocolo detalhado. Os dados são apresentados como% de mudança de TNF-α. Prisão de monócitos variaram em proporção directa com endotelial VCAM-1 expressão, o que aumentou directamente com o nível de triglicéridos no soro dador. B) detenção de monócitos para um subconjunto de pró-inflamatórias dadores foi abolida na presença de um VCAM-1 anticorpo bloqueador. A significância foi determinada pelo emparelhado teste t de Student, médias ± SEM de 3-5 experimentos independentes. Adaptado com permissão de Wang et al. 4

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	<li>Schaff, U. Y., Xing, M. M., Lin, K. K., Pan, N., Jeon, N. L., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+mimetics+based+on+microfluidics+for+imaging+the+leukocyte--endothelial+inflammatory+response.">Vascular mimetics based on microfluidics for imaging the leukocyte--endothelial inflammatory response.</a> Lab Chip. 7, 448-456 (2007).</li><li>Tsou, J. K., Gower, R. M., Ting, H. J., Schaff, U. Y., Insana, M. F., Passerini, A. G., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+inflammation+by+human+aortic+endothelial+cells+in+a+linear+gradient+of+shear+stress.">Spatial regulation of inflammation by human aortic endothelial cells in a linear gradient of shear stress.</a> Microcirculation. 15, 311-323 (2008).</li><li>Ting, H. J., Stice, J. P., Schaff, U. Y., Hui, D. Y., Rutledge, J. C., Knowlton, A. A., Passerini, A. G., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride-rich+lipoproteins+prime+aortic+endothelium+for+an+enhanced+inflammatory+response+to+tumor+necrosis+factor-alpha.">Triglyceride-rich lipoproteins prime aortic endothelium for an enhanced inflammatory response to tumor necrosis factor-alpha.</a> Circ. Res. 100, 381-390 (2007).</li><li>Wang, Y. I., Schulze, J., Raymond, N., Tomita, T., Tam, K., Simon, S. I., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+inflammation+correlates+with+subject+triglycerides+and+waist+size+after+a+high-fat+meal.">Endothelial inflammation correlates with subject triglycerides and waist size after a high-fat meal.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, H784-H791 (2011).</li><li>Deverse, J. S., Bailey, K. A., Jackson, K. N., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+modulates+rage-mediated+inflammation+in+a+model+of+diabetes-induced+metabolic+stress.">Shear stress modulates rage-mediated inflammation in a model of diabetes-induced metabolic stress.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2012).</li><li>Dai, G., Kaazempur-Mofrad, M. R., Natarajan, S., Zhang, Y., Vaughn, S., Blackman, B. R., Kamm, R. D., Garcia-Cardena, G., Gimbrone, M. 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C., Usami, S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+increases+icam-1+and+decreases+vcam-1+and+e-selectin+expressions+induced+by+tumor+necrosis+factor-[alpha]+in+endothelial+cells.">Shear stress increases icam-1 and decreases vcam-1 and e-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 73-79 (2004).</li><li>Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+the+effects+of+shear+stress+on+vascular+endothelial+cells.">Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells.</a> J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).</li><li>Usami, S., Chen, H. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+cd11c++monocytes+in+atherogenesis+associated+with+hypercholesterolemia.">Functional role of cd11c+ monocytes in atherogenesis associated with hypercholesterolemia.</a> Circulation. 119, 2708-2717 (2009).</li><li>Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparatus+for+subjecting+living+cells+to+fluid+shear+stress.">Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress.</a> The Review of scientific instruments. 53, 1851-1854 (1982).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Descrevemos a utilização de dispositivos microfluídicos PDMS para a avaliação no chip do fenótipo inflamatória endotelial através da imagem em tempo real da CAM expressão e adesão de monócitos. Uma grande vantagem da nossa abordagem reside na capacidade para quantificar resultados associados com a disfunção endotelial em células expostas a mediadores inflamatórios, tais como lípidos da dieta e citocinas, sob condições hidrodinâmicas definidos que espelham tensão de cisalhamento em vasos aterogênicas...

<table border="1"><tbody><tr><td> Item </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> 100 x 20mm placas de Petri </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> Etanol 95% </td><td> Merck Química </td><td> EX0290-1 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td></tr><tr><td> O colágeno tipo I da cauda de rato Derived </td><td> Gibco </td><td> A10483-01 </td></tr><tr><td> Células endoteliais aórticas humanas </td><td> Genlantis </td><td> PH30405A </td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótica Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td></tr><tr><td> BulletKit endotelial </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> Endoteliais basais Mídia-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td></tr><tr><td> Seringas 10 ml </td><td> BD Falcon </td><td> 309604 </td></tr><tr><td> Tubo de poliuretano </td><td> Tygon </td><td> ABW0001 </td></tr><tr><td> Leibovitz-15 Meios </td><td> Gibco </td><td> 11415-069 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Base de Dados de elastômero de silicone </td><td> A Dow Corning </td><td> 184 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Agente de Cura Silicone Elastômero </td><td> A Dow Corning </td><td> 184 </td></tr><tr><td> SU8 Wafer Mestre Photoresist </td><td> UC Davis Pan Lab </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Eclipse TE200 microscópio invertido </td><td> Nikon </td><td> Eclipse TE200 </td></tr><tr><td> Bomba de seringa </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PHD2000 </td></tr><tr><td> 19 agulha hipodérmica calibre </td><td> Kendall </td><td> 8881 </td></tr><tr><td> THP-1 da linha celular monocítica </td><td> ATCC </td><td> TIB-202 </td></tr><tr><td> HBSS (solução salina tamponada com Hanks) com Ca 2 + / Mg 2 + </td><td&gt; Gibco </td><td> 14025-092 </td></tr><tr><td> Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 210-TA-010 </td></tr><tr><td> Fator Derivado do Estroma - 1 (SDF-1) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 350-NS-010 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040-CV </td></tr><tr><td> Albumina de soro humano (HSA) </td><td> ZLB Behring </td><td> NDC 0053-7680-32 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Reagentes específicos e equipamentos.

on-chip endothelial inflammatory phenotyping

A aterogênese é potencializado por anormalidades metabólicas que contribuem para um elevado estado de inflamação sistêmica, resultando em disfunção endotelial. No entanto, as primeiras alterações funcionais no endotélio que significam um nível individual de risco não estão diretamente avaliada clinicamente para ajudar a estratégia de guia terapêutico. Além disso, a regulação da inflamação por hemodinâmica local contribui para a distribuição não aleatória espacial da aterosclerose, mas os mecanismos são difíceis de delinear in vivo. Descrevemos uma abordagem lab-on-a-chip baseado quantitativamente perturbação metabólica ensaio de eventos inflamatórios em células endoteliais humanas (CE) e monócitos em condições de fluxo precisos. Métodos padrão de litografia suave são usados ​​para microfabricate vasculares miméticos câmaras microfluídicos (VMMC), que são ligados directamente para monocamadas de cultura da CE. 1 Esses dispositivos têm a vantagem de utilizar pequenos volumes de reagentes enquantoproporcionando uma plataforma para imagiologia directamente os eventos inflamatórios na membrana de CE expostos a um campo de cisalhamento bem definida. Temos aplicado com sucesso estes dispositivos para investigar-citocina, 2 lípido-3, 4 e RAGE inflamação induzida por 5 em aorta humana CE (AHCE). Aqui temos documentar a utilização do VMMC para a célula monocítica ensaio (THP-1) de rolamento e parada em monocamadas HAEC que são condicionadas sob características diferenciais de cisalhamento e activado pela citoquina inflamatória TNF-α. Estudos como estes estão fornecendo uma visão mecanicista em atherosusceptibility sob fatores de risco metabólicos.

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On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Câmaras de fluxo microfluídicos gravados por fotolitografia e fabricada a partir de PDMS são aplicados para sondar os resultados funcionais associados com disfunção CE e inflamação. Numa experiência representativa, a capacidade de tensão de cisalhamento diferencial para modular a adesão celular monocítica a citocina activado CE monocamadas é demonstrada.

On-Chip fenotipagem endotelial Inflamatória

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

on-chip-endothelial-inflammatory-phenotyping

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.8K visualizações.  University of California, Davis. Câmaras de fluxo microfluídicos gravados por fotolitografia e fabricada a partir de PDMS são aplicados para sondar os resultados funcionais associados com disfunção CE e inflamação. Numa experiência representativa, a capacidade de tensão de cisalhamento diferencial para modular a adesão celular monocítica a citocina activado CE monocamadas é demonstrada.

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Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk of thromboemboli formation1,2,3. We have developed a method to line the inside surface of Ti tubes with autologous blood-derived human or porcine endothelial progenitor cells (EPCs)4. By implanting Ti tubes containing a confluent layer of porcine EPCs in the inferior vena cava (IVC) of pigs, we tested the improved biocompatibility of the cell-seeded surface in the prothrombotic environment of a large animal model and compared it to unmodified bare metal surfaces5,6,7 (Figure 1). This method can be used to endothelialize devices within minutes of implantation and test their antithrombotic function in vivo. 
Peripheral blood was obtained from 50 kg Yorkshire swine and its mononuclear cell fraction cultured to isolate EPCs4,8. Ti tubes (9.4 mm ID) were pre-cut into three 4.5 cm longitudinal sections and reassembled with heat-shrink tubing. A seeding device was built, which allows for slow rotation of the Ti tubes. 
We performed a laparotomy on the pigs and externalized the intestine and urinary bladder. Sharp and blunt dissection was used to skeletonize the IVC from its bifurcation distal to the right renal artery proximal. The Ti tubes were then filled with fluorescently-labeled autologous EPC suspension and rotated at 10 RPH x 30 min to achieve uniform cell-coating9. After administration of 100 USP/ kg heparin, both ends of the IVC and a lumbar vein were clamped. A 4 cm veinotomy was performed and the device inserted and filled with phosphate-buffered saline. As the veinotomy was closed with a 4-0 Prolene running suture, one clamp was removed to de-air the IVC. At the end of the procedure, the fascia was approximated with 0-PDS (polydioxanone suture), the subcutaneous space closed with 2-0 Vicryl and the skin stapled closed. 
After 3 - 21 days, pigs were euthanized, the device explanted en-block and fixed. The Ti tubes were disassembled and the inner surfaces imaged with a fluorescent microscope.
We found that the bare metal Ti tubes fully occluded whereas the EPC-seeded tubes remained patent. Further, we were able to demonstrate a confluent layer of EPCs on the inside blood-contacting surface.
Concluding, our technology can be used to endothelialize Ti tubes within minutes of implantation with autologous EPCs to prevent thrombosis of the device. Our surgical method allows for testing the improved biocompatibility of such modified devices with minimal blood loss and EPC-seeded surface disruption.

A method for seeding titanium blood-contacting biomaterials with autologous cells and testing biocompatibility is described. This method uses endothelial progenitor cells and titanium tubes, seeded within minutes of surgical implantation into porcine venae cavae. This technique is adaptable to many other implantable biomedical devices.

Autólogas progenitoras endoteliais Cell Technology Semear e Teste de biocompatibilidade para dispositivos Cardiovascular em Modelo Animal Grande

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

Bioengenharia

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic processes in simple, compact systems with no moving parts. Isotachophoresis (ITP) is a simple and very robust electrokinetic technique that can achieve million-fold preconcentration1,2 and efficient separation and extraction based on ionic mobility.3 For example, we have demonstrated the application of ITP to separation and sensitive detection of unlabeled ionic molecules (e.g. toxins, DNA, rRNA, miRNA) with little or no sample preparation4-8 and to extraction and purification of nucleic acids from complex matrices including cell culture, urine, and blood.9-12
ITP achieves focusing and separation using an applied electric field and two buffers within a fluidic channel system. For anionic analytes, the leading electrolyte (LE) buffer is chosen such that its anions have higher effective electrophoretic mobility than the anions of the trailing electrolyte (TE) buffer (Effective mobility describes the observable drift velocity of an ion and takes into account the ionization state of the ion, as described in detail by Persat et al.13). After establishing an interface between the TE and LE, an electric field is applied such that LE ions move away from the region occupied by TE ions. Sample ions of intermediate effective mobility race ahead of TE ions but cannot overtake LE ions, and so they focus at the LE-TE interface (hereafter called the "ITP interface"). Further, the TE and LE form regions of respectively low and high conductivity, which establish a steep electric field gradient at the ITP interface. This field gradient preconcentrates sample species as they focus. Proper choice of TE and LE results in focusing and purification of target species from other non-focused species and, eventually, separation and segregation of sample species.
We here review the physical principles underlying ITP and discuss two standard modes of operation: "peak" and "plateau" modes. In peak mode, relatively dilute sample ions focus together within overlapping narrow peaks at the ITP interface. In plateau mode, more abundant sample ions reach a steady-state concentration and segregate into adjoining plateau-like zones ordered by their effective mobility. Peak and plateau modes arise out of the same underlying physics, but represent distinct regimes differentiated by the initial analyte concentration and/or the amount of time allotted for sample accumulation.
We first describe in detail a model peak mode experiment and then demonstrate a peak mode assay for the extraction of nucleic acids from E. coli cell culture. We conclude by presenting a plateau mode assay, where we use a non-focusing tracer (NFT) species to visualize the separation and perform quantitation of amino acids.

Isotachophoresis (ITP) is a robust electrokinetic separation and preconcentration technique with applications ranging from toxin detection to sample preparation. We review the physical principles of ITP and the methodology of applying this technique to two specific example applications: separation and detection of small molecules and purification of nucleic acids from cell culture lysate.

On-chip Isotachophoresis para separação dos íons e purificação de ácidos nucléicos

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

Lensfree On-chip microscopia tomográfica Empregando Multi-ângulo de iluminação e Pixel Super-resolução

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Quantificar as propriedades mecânicas do Glicocálix endotelial com Microscopia de Força Atômica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

Avaliando interação leucócito-endotélio em condições de fluxo em um<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Câmara Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. The feasibility of using magnetic forces to capture and retain endothelial outgrowth cells (EOC) labeled with super paramagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) has been shown previously. But this technique requires the development of a mechanically functional stent from a magnetic and biocompatible material followed by in-vitro and in-vivo testing to prove rapid endothelialization. We developed a weakly ferromagnetic stent from 2205 duplex stainless steel using computer aided design (CAD) and its design was further refined using finite element analysis (FEA). The final design of the stent exhibited a principal strain below the fracture limit of the material during mechanical crimping and expansion. One hundred stents were manufactured and a subset of them was used for mechanical testing, retained magnetic field measurements, in-vitro cell capture studies, and in-vivo implantation studies. Ten stents were tested for deployment to verify if they sustained crimping and expansion cycle without failure. Another 10 stents were magnetized using a strong neodymium magnet and their retained magnetic field was measured. The stents showed that the retained magnetism was sufficient to capture SPION-labeled EOC in our in-vitro studies. SPION-labeled EOC capture and retention was verified in large animal models by implanting 1 magnetized stent and 1 non-magnetized control stent in each of 4 pigs. The stented arteries were explanted after 7 days and analyzed histologically. The weakly magnetic stents developed in this study were capable of attracting and retaining SPION-labeled endothelial cells which can promote rapid healing.

Our goals were to design, manufacture and test ferromagnetic stents for endothelial cell capture. Ten stents were tested for fracture and 10 more stents were tested for retained magnetism. Finally, 10 stents were tested in-vitro and 8 more stents were implanted in 4 pigs to show cell capture and retention.

Ferromagnético Bare Metal Stent para captura de células endoteliais e Retenção

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Película seca baseada em fotorresiste eletroquímica Microfluidic Biosensor plataforma: Fabricação de dispositivo, ensaio em-microplaqueta preparação e operação de sistema

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Fabricação e validação de um sistema de órgãos-em-microplaqueta com eléctrodos integrados para quantificar diretamente a resistência elétrica de Transendothelial

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is deleterious for the cells as it reduces their ability to form a mature and functional layer. Here, we present a method for establishing and subculturing human and sheep corneal endothelial cell cultures that minimizes the loss of cell-to-cell contact. Explants of corneal endothelium/Descemet&#39;s membrane are taken from donor corneas and placed into tissue culture under conditions that allow the cells to collectively migrate onto the culture surface. Once a culture has been established, the explants are transferred to fresh plates to initiate new cultures. Dispase II is used to gently lift clumps of cells off tissue culture plates for subculturing. Corneal endothelial cell cultures that have been established using this protocol are suitable for transferring to biomaterial membranes to produce tissue-engineered cell layers for transplantation in animal trials. A custom-made device for supporting biomaterial membranes during tissue culture is described and an example of a tissue-engineered graft composed of a layer of corneal endothelial cells and a layer of corneal stromal cells on either side of a collagen type I membrane is presented.

This protocol describes the critical steps required to establish and grow corneal endothelial cell cultures from explants of human or sheep tissue. A method for subculturing corneal endothelial cells on membranous biomaterials is also presented.

Crescimento de Camadas de Células Endoteliais De Córnea Humana e Ovelha em Membranas Biomateriais

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

Fenotipagem de tensão de levedura de alta produtividade com sequenciamento de RNA baseado em gotículas

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...