Research informou nesta publicação foi apoiada pelo National Eye Institute dos Institutos Nacionais de Saúde, com os números de premiação: R01EY022084 / S1 (KMC), T32EY007145 (HS) e P30EY014104. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do National Institutes of Health. Apoio adicional foi fornecida pelo Fundo Massachusetts Lions Eye Research (KMC) e um Prêmio Especial Acadêmico de Pesquisa para prevenir a cegueira (para KMC).

Todos os experimentos em animais foram tratados de acordo com a Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia Declaração de Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research, e as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Massachusetts Eye and Ear Infirmary Comitê Animal Care. O dia antes da experiência: 1. Preparação de tubulação para o fluxo Câmara <ol><li> Para preparar o lado jugular, conecte um centímetro PE10 tubo de polietileno de tubo de silicone 6 centímetros seguido por tubos de polietileno de 5 cm. Para o lado da carótida, preparar de modo semelhante ao lado jugular com a adição de um tubo em T dentro do tubo de silicone 6 centímetros a cerca de 1,5 cm de distância do tubo de polietileno com 1 cm (Figura 1A, B). A fim de inserir o tubo T, alargar o tubo de silicone utilizando uma pinça fina, se necessário. </li><li> Ligue uma extremidade de 10 cm de tubo de silicone para o transdutor de pressão, em seguida, insira a extremidade T da carótida side tubo T para a outra extremidade. Assegurar a ligação sites são apertados e sem vazamento. Aplicar um pequeno pedaço rectangular de parafilme sobre o local onde o tubo se encaixa, se necessário, para evitar fugas (Figura 1C). </li></ol> 2. Revestimento da Câmara <ol><li> Preparar a proteína de revestimento de superfície endotelial (por exemplo, selectina P, molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1), proteína vascular-1 de adesão celular (VCAM-1)) em 0,1% de BSA. A título de orientação, 1 ug de proteína em 200 ul de BSA é suficiente para revestir 4-5 câmaras. Usando uma seringa de 1 ml ligada a uma agulha G 25, cada câmara de infusão (0,04 x 0,4 x 50 mm) com a proteína de revestimento de superfície endotelial. Armazenar as câmaras revestidos em um tubo de 15 ml a 4 ° C durante a noite. </li></ol> O dia do experimento: 3. Preparar a Câmara <ol><li> Retirar as câmaras revestidos de 4 ° C e ligar a tubagem jugular e carótida de cada lado. Sele as connections com cuidado esticar um pequeno pedaço rectangular de parafilm sobre onde a tubulação encontra a câmara. Usando uma seringa, encher a câmara e tubos com 0,1% de BSA (verificação de fugas). Incubar durante 45 min. </li><li> Prepara-se uma placa de Petri 35 milímetros para manter a câmara de corte por ranhuras de cada lado do prato. Estabilize a câmara nos entalhes; em seguida, usar uma pequena gota de silicone para fixar a câmara para o prato no local dentada. Certifique-se que a câmara está nivelada por olhar sob o microscópio. Permitir que o silicone para secar durante pelo menos 15 min. </li><li> Encha uma seringa de 60 ml de bloqueio com heparina e conecte-se o transdutor de pressão. Ligue o transdutor de pressão para a tubagem carótida na seguinte ordem: Transdutor, tubagem de silicone, e T-tubo. <ol><li> Use de 1 cm PE50 entre o tubo de silicone ligado ao transdutor e o tubo T, para fixar a ligação. Passar a tubagem de silicone da artéria carótida por meio do grampo de pressão (Figura 1D). Execute 100USP heparina through o tubo eo compartimento até que não haja bolhas de ar. </li></ol></li></ol> 4. Instalação do Software <ol><li> Para preparar o software, ligue o computador, microscópio, e um dispositivo de laboratório aberto. Clique duas vezes sobre o conjunto de aplicativos Leica (LAS) (ou equivalente) e preparar uma pasta para guardar o vídeo: navegar → adquirir → filme → definir seqüência de clips (clips = 15, o tempo de gravação = 30 segundos, e intervalos = 15 sec) em seguida, clique no sinal de &quot;+&quot; para confirmar. </li><li> Para gravar a pressão de fluxo abrir o LabChart (ou equivalente) do arquivo e coordenar o nome do arquivo para a pasta de gravação na etapa 4.1, acima. </li></ol> 5. Procedimento Cirúrgico <ol><li> Anestesiar um rato de 8-10 semanas de idade, utilizando uma combinação de cetamina (60 mg / kg) e xilazina (6 mg / kg), injectada intraperitonealmente (IP). Confirme se a sedação profunda é alcançada dentro de 5-10 min por perda do reflexo interdigital. Se necessário, o isofluranopor máscara pode ser dado como necessário. </li><li> Enquanto sob anestesia, coloque uma almofada de aquecimento por baixo da gaiola e configurada para 37 ° C para manter a temperatura corporal. Uma vez que a anestesia adequada é confirmada, coloque o mouse em uma posição ventral e revestir os olhos com bacitracina pomada para evitar a secura ocular. </li><li> Em seguida, raspar o cabelo no local da incisão usando uma lâmina de barbear e limpe o local com álcool. </li><li> Depois de completamente anestesiado prender o animal com fita mantendo o mouse em uma posição ventral. Expor a área do pescoço com uma tesoura e remover a glândula tireóide para expor a traqueia e os vasos (Figura 2A). </li><li> Limpe a artéria carótida até que esteja totalmente exposto tomando cuidado para não danificar o nervo vago (Figura 2B). Dobre um pedaço de fio de sutura e passar a curva debaixo da artéria carótida em seguida, corte na curva de forma que há agora dois pedaços de sutura debaixo da carótida. Loop cada sutura em nós (não aperte oknots). </li><li> Repetir o mesmo procedimento para expor a veia jugular esquerda (Figura 2C), preparando-se as suturas da mesma maneira (Figura 2D). </li><li> Conecte o tubo para a vasculatura mouse. <ol><li> Heparinizar o mouse através da injeção de 1 ml de IP heparina. </li><li> Apertar a sutura superior na artéria carótida. Coloque o grampo do navio tão baixo quanto ele pode ir na artéria carótida (Figura 3A). Use pinça para segurar o fio de sutura pela artéria superior e fazer uma pequena incisão, cerca de 1/8 da circunferência da artéria, utilizando a microtesoura (Figura 3B). </li><li> Passar a tubagem artéria carótida através do segundo nó da sutura superior e para dentro da incisão feita na artéria. Amarrar a sutura inferior de modo a que a artéria é fechada hermeticamente em torno do tubo (vários nós devem ser tomadas medidas para garantir uma vedação estanque; Figura 3C). </li><li> Repetir o mesmo procedimento para a inserção do tubo de veia jugular (o vasobraçadeira não é necessária para o lado jugular; Figura 3D). </li><li> Teste o fluxo liberando a braçadeira navio. Se não há vazamentos mover o mouse para o microscópio e se conectar a tubulação carótida ea veia jugular à tubulação câmara (veja o vídeo em anexo para demonstração do procedimento cirúrgico). </li></ol></li></ol> 6. Gravação de rolamento Velocity <ol><li> Abrir o grampo carótida para encher a câmara, fazendo com que um circuito com o sistema circulatório do rato. Permitir que o sangue circule para 3-5 min, de modo que as condições de fluxo estabilizar. Durante o período de espera de 3-5 minutos, ajustar a fase de microscópio de modo que a câmara é nível de uma extremidade para a outra com o objectivo de microscópio e o seu bordo é paralela com a janela de gravação de vídeo na tela. </li><li> Encher o prato de Petri contendo modificado da câmara de vidro com água, em seguida, baixar a objectiva de imersão em água 10X para o prato de modo a que as células fluem através da câmara são visíveis.A intensidade de luz pode ter que ser ajustada para uma visualização adequada das células. Geralmente uma intensidade menor é melhor. </li><li> Ajustar o grampo no tubo de modo que o transdutor lê uma constante 30 mm Hg correlacionando a uma pressão média de fluxo fisiológico, ou como desejado. </li><li> Pressione &quot;iniciar&quot; para iniciar a gravação, tanto o vídeo e a pressão com o primeiro lapso de tempo perto do final jugular e move contra o fluxo para a extremidade carótida até concluída. NOTA: Várias condições de revestimento utilizando diferentes moléculas de adesão pode ser estudado no mesmo rato usando várias câmaras. Apenas uma câmara é registada em cada vez. <ol><li> Quando a gravação terminar, fechar a válvula no local de entrada, interrompendo o fluxo de sangue. Remover a câmara e encaixar uma nova câmara (revestido com uma molécula de adesão diferente) para o circuito utilizando uma pinça fina em um lado, e uma pinça com ranhuras na outra mão. Retomar a gravação para a nova câmara, conforme descrito nas etapas6,1-6,4. </li></ol></li><li> Eutanásia todos os ratinhos por asfixia com CO 2, seguida por um deslocamento da medula espinal, no final da experiência. O procedimento é terminal, por conseguinte, os ratinhos são sacrificados por luxação da medula espinal, no final da experiência. </li></ol> 7. Interpretação dos Resultados <ol><li> Para a análise dos dados gravados usar o plugin &quot;M TrackJ&quot; para software ImageJ 23. </li><li> Converta o arquivo em tons de cinza Selecione o arquivo de importação → → → AVI converter em tons de cinza. </li><li> Padronizar os quadros Select → imagem → propriedade → por introduzir os intervalos de quadro (i) → global. Calcular os intervalos de quadro dividindo a duração total video (normalmente 30 segundos) ao número de quadros num vídeo (mostrado no canto superior da janela de vídeo J Imagem). </li><li> Medir o fluxo de cada leucócitos por Select plug-in → M TrackJ → Adicionar faixas → selecionar um dos leucócitos→ Acompanhe-o com cada quadro de 15-20 seg → Mesclar. </li><li> Repita o passo 7.4 para todos os leucócitos em vista. </li><li> Determine a velocidade média de rolamento dos leucócitos da Select medida → duas colunas aparecem → copiar todos os M TrakJ: Trilhas em uma planilha. A coluna denominada &quot;V dizer&quot; é o rolamento de leucócitos medido em pixels / segundo. Converter em um / sec dividindo por 2/3. </li><li> Para analisar o destaque de dados de pressão e de exportação em uma planilha e executar o seguinte cálculo: AP (mm Hg) e t (dina / cm 2) para uma comparação entre cada grupo experimental. Uma vez calculada, copiar os dados para software prisma para a representação gráfica. </li></ol>

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The authors (L.M., H.S., and K.M.C.) have no competing financial interests to disclose.

O processo de recrutamento de leucócitos é um passo crucial na resposta inflamatória; que envolve a migração de leucócitos a partir do sistema circulatório em direcção tecidos alvo, onde eles são capazes de exercer a sua função efectora. O recrutamento de leucócitos é parte integrante de uma variedade de condições inflamatórias, tais como placas de aterosclerose, enfarte do miocárdio, isquemia / reperfusão, e cirurgia de transplante de 1, bem como várias condições neuro-inflamatórias relacionadas com o SNC 10-12,20,24,25. Considerando a diversidade das condições de doença que vãos de recrutamento de leucócitos, a câmara de microfluxo autoperfused fornece uma ferramenta indispensável que o examinador a capacidade para estudar a dinâmica de migração de leucócitos. Ao longo das últimas décadas, uma variedade de ensaios in vitro têm sido desenvolvidos para estudar a dinâmica de adesão celular de leucócitos 26. Infelizmente, todos estes ensaios requerem a extracção deos leucócitos a partir do sangue, a introdução de activação mecânica. Para se aproximar mais o ambiente in vivo, foram feitas adaptações para coletar amostras de sangue total e controlar as condições de escoamento hemodinâmica 16,17. Aqui, vamos estender os avanços anteriores no domínio ligando uma câmara revestida para o sistema circulatório do mouse. Nós somos capazes de regular o fluxo de sangue para uma gama fisiológica e estudar a dinâmica de rolamento dos leucócitos. A câmara revestida nos dá a capacidade de estudar as interações leucócito com moléculas de adesão específicos. Uma vez que o sistema está a funcionar como uma unidade operada por um rato vivo, que imita mais de perto o ambiente natural, o que nos permite estudar as interacções leucócito-endotélio em uma variedade de modelos de ratinho imunológicas. Além disso, este sistema permite-nos tirar proveito dos múltiplos modelos genéticos do rato disponíveis. Embora o sistema não replicar completamente o ambiente in vivo, que proporciona uma plataforma para estudar específic elementos dos leucócitos em condições fisiológicas, um feito que não tenha sido possível. Mesmo que isso nos leva um passo mais perto de um ambiente mais fisiológico existem limitações para o sistema. Não replicar completamente a matriz 3D complexo da vasculatura para que só são capazes de avaliar certos elementos de interação leucócito que são restritos ao revestimento de câmara. Além disso, deve-se tomar muito cuidado para garantir um sistema fechado para a circulação do mouse, seguindo todas as etapas mencionadas no protocolo. A introdução de bolhas de ar irá afectar significativamente a precisão e reprodutibilidade dos experimentos. Enquanto nós descrevemos o uso da câmara de Autoperfused Microflow para avaliação da dinâmica de rolamento de leucócitos o procedimento tem o potencial para ser personalizado por investigadores para o estudo de uma variedade de doenças. Por exemplo, metástase das células cancerosas por expressar muitas das integrinas comuns partilhadas pelos leucócitos. Studying sua dinâmica de rolamento em um cenário que imita mais de perto um ambiente in vivo poderia ajudar em nosso conhecimento, e, possivelmente, a previsão, a natureza invasiva de certas células cancerígenas. Uma abordagem possível seria combinar uma técnica de marcação para as células cancerosas, tais como GFP 27, juntamente com o ensaio de câmara de fluxo para acompanhar a dinâmica de rolamento das células cancerosas que expressam GFP. Dada a flexibilidade de revestimento da câmara com uma variedade de substâncias e conectar várias câmaras ao mesmo mouse, será interessante ver como este processo é modificado para uso em outros laboratórios em combinação com camundongos geneticamente modificados e modelos de doenças. A técnica aqui descrita apenas toca em um potencial de aplicação muito mais ampla que é limitado apenas pela criatividade do investigador.

A inflamação é uma resposta universal do corpo a lesões e é um passo crucial para tanto a função do sistema imune inata e adaptativa. Em resposta à lesão e / ou estímulos inflamatórios, células endoteliais upregulate moléculas de adesão específicos; isto leva a extravasão de leucócitos através do endotélio microvascular, principalmente nas vénulas pós-capilares. Este processo inicia-se com tethering dos leucócitos de fluxo livre na corrente sanguínea no endotélio. Laminagem estável e adesão firme dos leucócitos, que por sua vez leva a transmigração e a secreção de agentes citotóxicos, seguir esta amarrar 1,2. As selectinas são conhecidos para mediar os primeiros passos da cascata de 3-5; integrinas são responsáveis ​​pelas etapas posteriores da adesão firme e transmigração 1,6-8. Um crescente corpo de evidências sugere leucócitos e moléculas de adesão endoteliais têm um papel vital em modelos animais de lesão de isquemia e reperfusão, Asma, psoríase, esclerose múltipla, e degeneração macular relacionada com a idade 9-12. Sob estas condições, a resposta inflamatória é ineficaz para atacar o próprio corpo, resultando na destruição de tecido saudável. Existentes agentes anti-inflamatórios (tais como drogas não esteróides anti-inflamatórios, corticosteróides, ou outros agentes quimioterapêuticos), carregam o risco de efeitos secundários graves, com o uso a longo prazo 13. Portanto, é de grande interesse para ter as ferramentas adequadas com a capacidade de identificar moléculas específicas de doenças, que podem, em última análise, ser orientada para ter o efeito anti-inflamatório desejado mantendo-se não tóxica 14. Existente em métodos in vitro tais como o ensaio de adesão de leucócitos estática foram usadas o mais cedo como 1976 15. A câmara de fluxo paralelo foi utilizado pela primeira vez em 1987 in vitro para estudar as interacções leucócito-endotélio sob as condições de fluxo. Nestas experiências, estimulada human leucócitos polimorfonucleares (PMN) a partir de sangue venoso foram perfundidos através de uma monocamada de células primárias endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Para controlar as condições de fluxo hemodinâmico, a bomba de seringa Harvard Apparatus foi empregado 16. Alternativamente, para evitar o isolamento de leucócitos artificial, sangue total foi utilizado em combinação com a câmara de vidro revestido com moléculas de adesão 17 imobilizadas. Para evitar a estimulação dos leucócitos e estudar mecanicamente sua interação com as moléculas de adesão em condições fisiológicas aproximados, uma ex vivo autoperfused, extracorporal, circuito arteriovenosa foi desenvolvido 16. Neste circuito, o sangue flui entre a artéria carótida comum direita e a veia jugular externa esquerda de um rato sob anestesia vivo, que permita a interacção dos LSP nativos dentro de uma câmara de microfluxo vidro revestido com moléculas individuais ou co-adesão imobilizada. Uma grande vantagem do presente systeo símbolo m representa a capacidade de empregar os ratos geneticamente modificadas, em que as vias inflamatórias estão directa ou indirectamente manipulados. Além disso, existe a capacidade de identificar a contribuição isolado de moléculas de adesão de leucócitos à inflamação, livre de activação externa, em condições de escoamento. A aplicação de um regulador de fluxo no ponto de entrada da câmara de fluxo proporciona uma vasta gama de variações experimentais de forças de cisalhamento ou a mimetizam sistemas 18-22 venosas ou arteriais. Aqui nós descrevemos em grande detalhe um protocolo relativamente à preparação e execução do vivo autoperfused ensaio de câmara ex microflow.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">Material</td>
			<td style="width:220px;">Vendor</td>
			<td style="width:237px;">Part number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro glass chamber 0.4x0.04x50mm</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td>2540-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 60</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427416</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Silicone tubing 002</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-189-15A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y tube</td>
			<td>Value Plastics</td>
			<td>Y210-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T tube</td>
			<td>value plastics</td>
			<td>T410-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone gel</td>
			<td>Hardware store - Home Depo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mm petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM996</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11253-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Tube holder</td>
			<td>FST</td>
			<td>00608-11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Clamp applicator</td>
			<td>FST</td>
			<td>18057-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Vascular clamp</td>
			<td>FST</td>
			<td>18055-04</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-0 silk sutures</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-1215-6/0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25x1G&#160; needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30x1/2G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin 100 USP units/ml</td>
			<td>Hospital pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing leukocyte-endothelial interactions under flow conditions in an ex vivo autoperfused microflow chamber assay

Interação leucócito-endotélio são eventos precoces e críticos na inflamação aguda e crônica e pode, quando desregulada, mediar lesão tecidual levando a danos patológica permanente. Ensaios convencionais existentes permitem a análise de moléculas de adesão de leucócitos apenas após a extracção de leucócitos a partir do sangue. Isto exige que o sangue passa por várias etapas antes de leucócitos do sangue periférico (PBL) pode estar pronto para a análise, que por sua vez pode estimular PBL que influenciam os resultados da investigação. O ensaio de câmara de fluxo de micro autoperfused, no entanto, permite aos cientistas estudar primeiros leucócitos desregulação funcional usando o fluxo sistêmico de um rato vivo, tendo a liberdade de manipular uma câmara revestida. Por meio de um modelo de doença, a expressão funcional de moléculas de adesão de leucócitos pode ser avaliada e quantificada num micro-câmara de vidro revestido com moléculas de adesão endotelial imobilizadas ex vivo. Neste modelo, o sangue fluientre a artéria carótida comum direita e veia jugular externa esquerda de um rato vivo, sob anestesia, permitindo a interação de PBL nativas na câmara. Análise experimental em tempo real é conseguido com o auxílio de um microscópio intravital, bem como um dispositivo de pressão de Harvard Apparatus. A aplicação de um regulador de fluxo no ponto de entrada da câmara de vidro permite que as condições de fluxo fisiológicas comparáveis ​​entre os experimentos. Velocidade de leucócitos de rolamento é o principal resultado e é medida usando os Institutos Nacionais de Saúde de acesso aberto software ImageJ. Em resumo, o ensaio de câmara de fluxo micro autoperfused fornece um ambiente fisiológico óptimo para estudar a interacção de leucócitos endotelial e permite aos investigadores tirar conclusões precisos quando se estuda a inflamação.

<html> Durante cada gravação leucócitos apenas interagindo são evidentes na câmara. Os resultados de uma experiência representativa pode ser visto na Figura 4. As setas brancas indicam a leucócitos individuais que foram capturados por a molécula de adesão de interesse e estão rolando ao longo da câmara entre outras que fluem livremente dentro do fluxo sanguíneo. Um artefacto comum no exterior da câmara pode ser visto com os grandes esferas escuras em todas as imagens. As esferas escuras ajudar o leitor a apreciar o movimento dos leucócitos em relação a um ponto fixo. Leucócitos avanço ao longo de um período de 22 segundos pode ser visto em relação às esferas. O gráfico na mesma figura mostra um gráfico final dos dados, onde Tx1 diminui a velocidade de rolamento (um desvio para a esquerda) e Tx2 aumenta a velocidade (um desvio para a direita) em comparação com o controlo. 0 &quot;/&gt; Figura 1: Preparação de tubagem para a câmara de fluxo. (A) Ferramentas necessárias para a tubulação e montagem de câmara (câmara de vidro micro 0,4 x 0,04 x 50 mm, polietileno PE10 tubulação, tubos de polietileno PE60, silício tubulação 002, tubo Y, tubo T, 35 milímetros placa de Petri, uma pinça fina, tesoura fina, suporte do tubo, o grampo vascular, 7-0 sutura de seda. (B) Preparação da artéria carótida e veia jugular para tubos de re-orientar o fluxo de sangue do rato através da câmara de revestimento. (C) Ligação da artéria carótida tubagem para o transdutor de pressão. (D) Passe o tubo do transdutor através do grampo para ajustar a taxa do fluxo de sangue. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig2.jpg" width="700" /> Figura 2:. A exposição da artéria carótida e veia jugular (A) cortado cuidadosamente a área do pescoço para expor a traqueia (B) Limpar a artéria carótida direita, de modo que um pedaço de fio de sutura pode ser passada por baixo do vaso (pontilhado amarelo. linha descreve a artéria carótida). (C) Limpe a veia jugular esquerda, de modo que um pedaço de fio de sutura pode ser passado sob o vaso (linha amarela pontilhada descreve a veia jugular). (D) Organizar frouxamente amarrados suturas nas regiões superiores e inferiores da artéria carótida e veia jugular (setas indicam as regiões superiores e inferiores dos vasos). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig3.jpg" width="700" /> Figura 3: Ligação da tubagem para tele artéria carótida ea veia jugular. (A) Apertar o nó superior na carótida e coloque o grampo abaixo do nó inferior. (B) Usando a microtesoura, fazer uma pequena incisão na carótida, cerca de 1/8 da circunferência (círculo amarelo pontilhada indica a incisão). ( C) Insira o tubo na carótida e seguro, com pelo menos duas suturas (linha pontilhada verde mostra a tubulação e a linha pontilhada amarela da artéria carótida). (D) Do mesmo modo inserir tubulação na jugular (linha pontilhada verde mostra a tubulação e a amarelo linha pontilhada a veia jugular). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig4.jpg" width="700" /> Figura 4: curso de leucócitos rolando através do cham fluxo tempo Representanteber (Escala bar = 100 mm) (setas brancas apontam leucócitos rolando). Gráfico mostra resultados representativos após a exportação em um programa de gráficos (Tx1 e Tx2 são grupos de tratamento experimental e CTR é o grupo controle). Tx1 representa um tratamento em que os leucócitos abrandar levando a uma diminuição na velocidade de leucócitos e um desvio para a esquerda do gráfico em comparação com o grupo não tratado (CTR) de rolamento, enquanto Tx2 leva a um deslocamento para a direita o que reflecte um aumento na velocidade de rolamento de leucócitos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Aqui, nós apresentamos um protocolo que permite ao investigador para avaliar a dinâmica de recrutamento de leucócitos ex vivo, ligando uma câmara revestida com moléculas de adesão endoteliais derivados de para o sistema circulatório de um rato. Este método oferece vantagens significativas, uma vez que permite a avaliação de leucócitos em condições biológicas relativos.

Avaliando interação leucócito-endotélio em condições de fluxo em um<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Câmara Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

assessing-leukocyte-endothelial-interactions-under-flow-conditions-an

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

9.5K visualizações.  Harvard Medical School, Massachusetts Eye & Ear Infirmary.  Aqui, nós apresentamos um protocolo que permite ao investigador para avaliar a dinâmica de recrutamento de leucócitos ex vivo, ligando uma câmara revestida com moléculas de adesão endoteliais derivados de para o sistema circulatório de um rato. Este método oferece vantagens significativas, uma vez que permite a avaliação de leucócitos em condições biológicas relativos. 

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Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

Câmara de placas paralelas de fluxo e Circuito de fluxo contínuo para avaliar células progenitoras endoteliais sob estresse de cisalhamento Fluxo Laminar

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Bioengenharia

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Determinação da taxa de transporte de xenobióticos e nanomateriais através da placenta usando o<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de perfusão da placenta humana

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

Um dispositivo de câmara de fluxo tridimensional Novel para estudar Chemokine dirigido extravasamento de células circulantes fisiológicos sob condições de fluxo

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Engenharia de Tecidos por Intrínseca Vascularização numa<em&gt; In Vivo</em&gt; Câmara Engenharia de Tecidos

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

Uma nova técnica cirúrgica como fundamento na Vivo parcial engenharia fígado de rato

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Um método automatizado para realizar o ensaio de micronúcleos in vitro usando citometria de fluxo de imagem multiespectral

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

In Vitro 3D Cell-Cultured Modelos arteriais para estudar a segmentação de drogas vasculares sob fluxo

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

Um sistema microfisiológico para estudar a interação das células leucócitos-endoteliais durante a inflamação

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical communities. The resolution of results obtained from current methods of measuring certain biomarkers can take several days or weeks to obtain, as they can be limited in resolution both spatially and temporally (e.g., fluid compartment microdialysis of interstitial fluid analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA], high-performance liquid chromatography [HPLC], or mass spectrometry); thus, their guidance of timely diagnosis and treatment is disrupted. In the present study, a unique technique for detecting and measuring peptide transmitters in vivo through the use of a capacitive immunoprobe biosensor (CI probe) is reported. The fabrication protocol and in vitro characterization of these probes are described. Measurements of sympathetic stimulation-evoked neuropeptide Y (NPY) release in vivo are provided. NPY release is correlated to the sympathetic release of norepinephrine for reference. The data demonstrate an approach for the fast and localized measurement of neuropeptides in vivo. Future applications include intraoperative real-time assessment of disease progression and minimally invasive catheter-based deployment of these probes.

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Established immunochemical methods to measure peptide transmitters in vivo rely on microdialysis or bulk fluid draw to obtain the sample for offline analysis. However, these suffer from spatiotemporal limitations. The present protocol describes the fabrication and application of a capacitive immunoprobe biosensor that overcomes the limitations of the existing techniques.

Medição in vivo de neuropeptídeos por imunoprobe capacitivo no coração suíno

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by scoring MN in once-divided, cytokinesis-blocked binucleated cells or fully divided mononucleated cells. Historically, light microscopy has been the gold standard method to score the assay, but it is laborious and subjective. Flow cytometry has been used in recent years to score the assay, but is limited by the inability to visually confirm key aspects of cellular imagery. Imaging flow cytometry (IFC) combines high-throughput image capture and automated image analysis, and has been successfully applied to rapidly acquire imagery of and score all key events in the MN assay. Recently, it has been demonstrated that artificial intelligence (AI) methods based on convolutional neural networks can be used to score MN assay data acquired by IFC. This paper describes all steps to use AI software to create a deep learning model to score all key events and to apply this model to automatically score additional data. Results from the AI deep learning model compare well to manual microscopy, therefore enabling fully automated scoring of the MN assay by combining IFC and AI.

The micronucleus (MN) assay is a well-established test for quantifying DNA damage. However, scoring the assay using conventional techniques such as manual microscopy or feature-based image analysis is laborious and challenging. This paper describes the methodology to develop an artificial intelligence model to score the MN assay using imaging flow cytometry data.

Automação do Ensaio de Micronúcleos Utilizando Imagem por Citometria de Fluxo e Inteligência Artificial

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...