O objetivo geral deste procedimento é reproduzir a maioria dos aspectos essenciais da doença de Parkinson em um modelo animal. A entrega estereotipada de vetores virais associados ao adeno, codificando a sinucleína humana na substantia nigra. A doença de Parkinson é uma doença neurodegenerativa que envolve a morte do neurônio dopaminérgico, na via nigrostriatal e, consequentemente, a progressão da perda de controle do movimento voluntário.
Este processo neurodegenera é acompanhado, pela deposição de proteína agregada no cérebro, que são constituídas principalmente pela sinucleína. Evidências emergentes indicam que os agregados de sinucleína podem estimular receptores semelhantes a pedágio na microglia, desencadeando assim inflamação neural na substantia nigra. Além disso, evidências indicam que os agregados de sinucleína podem ser capturados e apresentados, por células que apresentam antígenos às células T, induzindo uma resposta imune adaptativa específica à sinucleína.
A entrega estereotipada de vetores virais associados ao adeno que codifica a sinucleína humana na substantia nigra, mostrou reproduzir muitos aspectos essenciais da doença, incluindo patologia da sinucleína, ativação microglial, ativação de células T, neurodegeneração e comprometimento motor. Este estudo apresenta uma análise de como um vetor viral e o tempo após o parto do vetor viral, afeta a extensão da expressão da sinucleína humana, neurodegeneração e neuroinflamação na via nigrostriatal, bem como o grau de comprometimento motor em um modelo de rato de entrega estereóxica unilateral da sinucleína humana na substantia nigra. Para manter um ambiente asséptico, use roupas cirúrgicas adequadas durante toda a cirurgia, incluindo capas de sapato, máscara de cirurgia, barreira sanitária, luvas e boné de cirurgia.
Pulverizar etanol no camundongo e todo o material cirúrgico, para manter o ambiente asséptico. Para induzir uma analgesia, injete carprofeno subcutâneo a cada 12 horas, começando uma hora antes da cirurgia, e continuando até três dias após a cirurgia. Para anestesiar o rato, coloque o animal em uma câmara de indução.
Abra o fluxo isoflurane a uma taxa de 0,5% e, em seguida, lentamente aumente-o até 5% ao longo de aproximadamente cinco minutos até que o mouse tenha perdido seu reflexo de redomentação. Remova o animal da câmara de indução. Transfira imediatamente o animal para um circuito não-rebreathing com um cone de nariz de tamanho apropriado.
Mantenha a anestesia do camundongo, com isoflurano de 1% durante todo o tempo de cirurgia. Confirme se o mouse está totalmente anestesiado beliscando suas caudas e patas. Quando o mouse não reage ao beliscar a cauda e as patas, significa que o mouse está completamente anestesiado.
Raspe a cabeça do rato usando uma tesoura. Limpe a pele do rato usando um cotonete com clorexidina 2% e remova todos os cabelos. Fixar a cabeça do mouse no quadro estereotaxic.
Coloque um protetor de córnea em ambos os olhos de rato, usando um cotonete. Para evitar a indução de estresse em outros roedores, evite a presença de qualquer outro rato na sala de cirurgia. Limpe a cabeça do rato com três rodadas de clorhexidina 2%, seguidas de etanol 70% Exponha o crânio usando material cirúrgico, e faça um orifício fino com uma broca nas coordenadas anteroposterior 2,8 mm, e mediolateral 1,4 mm, com relação à linha medial.
Coloque a agulha de uma seringa de 10 microliter no orifício, e mova a agulha dentro do cérebro lentamente, até chegar a 7,2 mm dorsoventral, respeito à dura. Deixe a agulha na posição final por dois minutos, para permitir que o tecido se acalme um pouco, e então injete um microliter de vetores virais na substantia nigra direita, a uma taxa de 0,2 microliters a cada 30 segundos. Deixe a agulha na mesma posição por cinco minutos após a entrega dos vetores virais e, em seguida, retire-a lentamente.
Feche a ferida usando uma sutura de seda estéril. Coloque o rato na gaiola de casa, pré-aquecido colocando-o sobre um colchão quente elétrico. 12 semanas após a cirurgia estereotaxa, avalie o desempenho do motor, utilizando uma versão simplificada do teste de feixe, descrito anteriormente.
Para isso, utilize um feixe horizontal de 25 cm de comprimento e 3 cm de largura. A superfície do feixe deve ser coberta por uma grade metálica com quadrados de um centímetro, e elevada um centímetro acima do feixe. Faça um vídeo do mouse, enquanto atravessa o feixe de superfície da grade, de uma extremidade para a extremidade oposta do feixe, onde a gaiola doméstica está localizada.
Treine o mouse por dois dias, antes da determinação do desempenho do motor. No primeiro dia, treine o rato para andar pela trave cinco vezes, sem a grade. No segundo dia, treine o mouse para caminhar pela viga, na presença de grade cinco vezes.
No terceiro dia, avalie o desempenho do motor. Para isso, quantifique o número de erros realizados, pelas patas esquerdas ou pelas patas direitas separadamente, assistindo os vídeos em um modo de câmera lenta. Para anestesiar o mouse, injete uma mistura de cetamina e xilazina intraperitoneally.
Uma vez que o rato esteja completamente anestesiado, abra o tórax com material cirúrgico e exponha o coração. Em seguida, insira uma agulha de ponta plana no ventrículo esquerdo do coração. Ao acoplar a agulha a um tubo, perfuse 50 mililitros de soro fisiológico tampão de fosfato, a uma taxa de 9,5 mililitros por minuto, usando uma bomba peristáltica.
Remova o cérebro usando tesouras e pinças, e depois fixá-lo por imersão, em cinco mililitros de 4% de paraformaldeído, em soro fisiológico tampão fosfato. Depois, coloque o cérebro fixo em 15 mililitros de 30% de sacarose por 48 horas. Em seguida, coloque o cérebro em quatro mililitros de solução de crioproteção, e salve o cérebro a 80 graus, ou use-o imediatamente na próxima etapa.
Para obter fatias estriais, corte o cérebro em seções de 40 micrômetros de espessura, começando em 1,34 mm, e terminando em 0,26 mm. Colhe cada fatia em um crioboto de dois mililitros, seguindo a ordem anteroposterior. Para realizar análises imunohistoquímicas e imunofluorescentes no estriado, escolha cinco seções estriais coronais tomadas em intervalos uniformes, que cobrem toda a extensão rostrocaudal do núcleo.
Para validar a correta entrega de vetores virais nos neurônios dopaminérgicos da via nigrostriatal, foram injetados vetores codificando GFP, na substantia nigra, e 12 semanas depois, a fluorescência GFP e a imunoreatividade hidroxialase de tiranosina foram analisadas na substantia nigra e estria por imunofluorescência. A fluorescência associada ao GFP foi localizada exclusivamente no sítio ipsilateral, e observou-se uma colocalização significativa com imunoreatividade hidroxilase tyrosina em ambas as substantia nigra e estriato, indicando a correta entrega de vetores virais nos neurônios dopaminérgicos da via nigrostriatal. Para testar a dose de vetores, codificando a sinucleína necessária, para induzir uma superexpressão significativa da sinucleína humana que promove a neurodegeneração dos neurônios dopaminérgicos nigral, diferentes doses dos vetores foram injetadas.
E 12 semanas depois, a imunoreatividade da sinucleína humana, e a extensão da imunoreatividade da hidroxilase de tirasina foram testadas na via nigrostriatal. A imunoreatividade da sinucleína humana foi evidente, com todas as doses testadas na substantia nigra. No entanto, apenas camundongos que receberam de 10 a 10 genomas virais por camundongo, apresentaram evidente imunoreatividade da sinucleína humana, no estriado.
Camundongos que receberam de 10 a 10 genomas virais por rato de vetores codificando sinucleína humana, apresentaram uma perda significativa de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra. Embora os camundongos que receberam a mesma dose de vetores codificando GFP, apresentaram um baixo grau de perda neuronal, esses camundongos apresentaram um grau significativamente menor de neurodegeneração, em comparação com os camundongos que receberam vetores, codificando a sinucleína humana. Utilizando o teste do feixe, foi detectada uma redução significativa no desempenho motor dos camundongos, recebendo de 10 a 10 genomas virais por rato de vetores codificando sinucleína humana, ao comparar o número de erros cometidos pelas patas direita e esquerda, ou quando comparado o número total de erros, de camundongos que recebem vetores codificando sinucleína humana, com aqueles ratos recebendo o vetor de controle.
Para definir o início da expressão da sinucleína humana, os camundongos foram tratados com 10 a 10 genomas virais por camundongo, de vetores codificando sinucleína humana, ou cirurgia falsa, e a extensão da expressão da sinucleína humana foi analisada na substantia nigra, uma vez por semana, durante as semanas duas a cinco após a cirurgia estereotaxa. Os resultados mostram que a expressão da sinucleína humana começou a ficar evidente na semana cinco após a cirurgia estereotaxa. Para determinar o pico da ativação microglial, a extensão das células expressas altos níveis de Iba1, foi quantificada no estriado de camundongos, durante as semanas 2-15 após a cirurgia.
Os resultados mostram um aumento significativo na ativação microglial do lado ipsilateral, em comparação com o lado contralateral dos camundongos, 15 semanas após a inoculação viral. O número de células T regulatórias infiltradas no nigra substancial foi analisado em diferentes pontos de tempo, após a cirurgia estereotipada por imunofluorescência, seguida pela observação da microscopia confocal. O pico de infiltração regulatória de células T na substantia nigra foi observado na semana 11 após a cirurgia.
O modelo de camundongos de neurodegeneração aqui analisado, representa um modelo útil para estudar números do envolvimento de aspectos-chave na fisiopatologia da doença de Parkinson. Mecanismos de envolvimento na patologia da sinucleína, ativação microglial, envolvimento do sistema imunológico periférico, na neuroinflamação, e os mecanismos de neurodegeneração Uma dose adequada de vetor viral associado ao adeno, subtipo cinco codificando a sinucleína humana para induzir neurodegeneração, neuroinflamação, infiltração de células T e comprometimento motor, é de 10 a 10 genomas virais por camundongo. Este estudo mostra que, cinco semanas após a cirurgia estereotaxa, constitui um ponto de tempo chave, no qual a expressão da sinucleína humana já era evidente, mas na ausência de comprometimento motor neste modelo animal.
Assim, este ponto temporal representa um ponto temporal interessante, para iniciar a administração de terapias experimentais adaptadas para impedir o progresso da neuroinflamação e neurodegeneração. O ponto de tempo mais adequado para analisar a neuroinflamação neste modelo animal, é na semana 15 após uma cirurgia estereotipada. Enquanto um ponto de tempo adequado para analisar a infiltração de células T no sistema nervoso central.
parece estar na semana 11 após a inoculação do vetor viral.
