Nosso protocolo permite que os pesquisadores testem o metabolismo de energia mitocondrial e esferoides sem emendas para permitir comparações entre várias linhas celulares diferentes, números de células e fenótipos, bem como tratamentos medicamentosos em uma pesquisa de descoberta de drogas e câncer de campo. Nosso trabalho apresenta um protocolo detalhado para explorar o metabolismo de energia mitocondrial usando esferoides 3D fornecendo o modelo fisiológico superior em comparação com experimentos de monocamadas celulares. Observações biológicas podem estar extrapolando de um esferoides vítreos para tumores in vivo e identificar caminhos que podem atingir o metabolismo tumoral esferoide.
Por exemplo, o consumo de carboidratos durante o crescimento dos esferoides. Todos os dados do instrumento de fluxo extracelular 96 são muito sensíveis. O posicionamento de esferoides in vitro dentro da placa de ensaio é primordial para obter dados precisos no nível único de esferoide.
Verifique a viabilidade esferoide usando um microscópio de luz invertida com contraste de fase na ampliação de 4x para garantir estrutura eferóide intacta, morfologia e uniformidade geral entre as amostras. Para hidratar o cartucho do sensor, alíquotar aproximadamente 20 mililitros do calibrante em um tubo cônico. Coloque o tubo cônico contendo o calibrante em uma incubadora de dióxido de carbono 37 graus Celsius durante a noite.
Tire o conteúdo do kit de ensaio. Coloque o cartucho do sensor de cabeça para baixo ao lado da placa do utilitário. Pipeta 200 microliters de água dupla estéril destilada em cada poço da placa de utilidade usando uma pipeta P300 multicanal.
Coloque o cartucho do sensor em cima da placa de utilidade. Verifique se o nível de água em cada poço é alto o suficiente para submergir as sondas do sensor. Transfira o cartucho de sensor montado para uma incubadora de dióxido de carbono 37 graus Celsius e deixe-o durante a noite.
Para revestir a microplaca de ensaio esferoide, adicione 30 microliters de 0,1 miligramas por solução de poli-d-lysina mililitro por poço de microplaca esferoide usando uma técnica séptica. Aspire a solução de cada poço da microplacão esferoide, inverta a placa e bata-a firmemente no papel de tecido para remover qualquer solução residual. Lave cada poço da placa com 200 microliters de água dupla destilada estéril.
Após a lavagem final, inverta a microplacão e bata-a firmemente no papel de tecido para remover qualquer água residual. Deixe a placa secar por 30 minutos antes do uso futuro. Prepare o meio XF RPMI como descrito no manuscrito.
Pré-aquecimento o ensaio XF RPMI suplementado médio a 37 graus Celsius uma hora antes do ensaio. E pré-aquecimento o ensaio esferoide revestido microplaca em uma incubadora de dióxido de carbono 37 graus Celsius. Retire o tubo cônico contendo o calibrante e o cartucho do sensor da incubadora de ar.
Remova o cartucho do sensor da placa do utilitário e coloque-o de cabeça para baixo na superfície de trabalho. Usando uma pipeta multicanal P300, aspire a água da placa de utilidade e descarte-a. Adicione 200 microliters do calibrante pré-armado a cada poço da placa de utilidade.
Coloque o cartucho do sensor na placa do utilitário garantindo que os sensores estejam bem submersos no calibrante. Transfira o cartucho de sensor montado para a incubadora não-carbono, 37 graus Celsius até estar pronto para carregar as soluções de injeção da porta. Retire a placa de cultura esferoide da incubadora e observe os esferoides sob o microscópio para garantir sua integridade antes das etapas de transferência de esferoides.
Carregue 180 microliters de ensaio pré-guerra em cada poço da placa esferoide, incluindo quaisquer poços de correção de fundo. Encha parcialmente uma placa de Petri de sete centímetros com três mililitros do meio de ensaio. Transfira os esferoides da placa de cultura 96 para uma placa de Petri, usando uma pipeta multicanal carregada com pontas de pipeta de orifício largo, e volume definido para 10 a 50 microliters.
Defina o volume de um único pipettor de canal equipado com uma ponta de pipeta de orifício largo para 20 microliters e aspire cuidadosamente um único esferoide. Coloque a ponta diretamente no centro de cada poço deste microplato de ensaio e permita que a ação capilar retire o esferoide da ponta pipeta. Confirme a evolução sob o microscópio, inserindo o conteúdo do pipettor na placa de Petri.
Uma vez que todos esses esferoides tenham sido transferidos para a microplaca de ensaio esferoide, transfira a placa para uma incubadora de dióxido de carbono 37 graus Celsius por um mínimo de uma hora. Prepare as concentrações de estoque de trabalho de cada composto como descrito no manuscrito, usando um meio de ensaio XF RPMI totalmente complementado. Dispensei 20 microliters da solução de funcionamento de cada composto em todas as portas correspondentes usando uma pipeta multicanal P100 calibrada.
Prepare o analisador para carregar o cartucho do sensor. Para obter esferoides compactos bem formados, cada linha celular foi otimizada individualmente para a densidade de semeadura e duração do cultivo. Em estratégias otimizadas de semeadura, o volume de spheroid para SK-OV-3 foi em torno de 5,46 x 10 para os sete micrômetros cúbicos e para A549, foi de 1,45 x 10 a oito micrômetros cúbicos.
Todos os tipos de esferoides tinham uma correlação linear entre a densidade inicial de semeadura e o volume esferoide. A simetria esferoide perfeita teve uma circularidade de 1,0 e um desvio de 1,0 indicou perda de circularidade. Para todos os tipos de esferoides, a taxa de consumo de oxigênio aumentou com o tamanho do esferoide e foi linearmente correlacionada com o volume esferoide com o maior em spheroids MCF-7 e o menor em spheroids SK-OV-3.
Os spheróides MCF-7 não responderam ao controle do veículo durante todo o experimento. A taxa de consumo de oxigênio nos esferoides MCF-7 foi reduzida com oligomicina após cinco ciclos de medição após a primeira injeção de 0,5 microgramas por mililitro. Em resposta ao BAM15, a taxa de consumo de oxigênio foi aumentada antes da segunda injeção.
Enquanto a combinação de Rotenone mais Antimicina A baixou-o. Um protocolo para sondar com precisão a respiração mitocondrial basal. Respiração de fosforilação aDP, respiração de vazamento, eficiência de acoplamento, capacidade respiratória máxima e capacidade respiratória sobressalente foi desenvolvida usando esferoides 3D derivados do câncer.
Todos os compostos respiratórios produziram os perfis de taxa de consumo de oxigênio cinético esperados para os compostos selecionados revelando uma taxa média de respiração basal estável média de 20 a 30 picomoles de oxigênio por minuto, por poço. Localização de esferoides dentro da microplacão e número do ciclo de medição após a injeção composta para garantir que as taxas de respiração sejam estáveis entre as adições compostas. Ao explorar a capacidade respiratória mitocondrial com desacopladores, não só é a chave de concentração, mas também sua capacidade de descoplar a respiração na presença de oligomicina, que é tipicamente adicionada antes de desacoplador em experimentos que sondam o metabolismo de energia mitocondrial.
