Name: preparation and metabolic assay of 3-dimensional spheroid co-cultures of pancreatic cancer cells and fibroblasts
Uploaded: 2017-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
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Gostaríamos de agradecer Samuel Zirbel assistência no monitoramento de crescimento esferoide e otimizando as condições de cultura. Estamos gratos à Agilent technologies para fornecer o analisadore96 XF de cavalos-marinhos, os reagentes do ensaio e conhecimentos técnicos. Agradecemos também Dr. Hemant Kocher Barts Cancer Institute no Reino Unido para fornecer as células do PS1. Este trabalho foi financiado em parte pela Fundação Magowitz viu um para pesquisa do câncer no pâncreas e um Stand até câncer-câncer Research UK-Lustgarten Fundação pancreático câncer sonho equipe bolsa de investigação (Grant Number: SU2C-AACR-DT-20-16). Stand Up para câncer é um programa da Entertainment Industry Foundation. Bolsas de investigação são administradas pela Associação Americana para pesquisa do câncer, o parceiro científico de SU2C.

1. cultura de câncer pancreático esferoides 3D usando magnético Bioprinting <ol><li>usando padrão asséptico tecido cultura técnica, células de cultura de interesse num balão T75 para uma confluência de 70-80% em meios de crescimento adequado. 
	Nota: Normalmente, 5-7 × 10 6 células de um frasco de T75 confluente de 70-80% foram colhidas. Dois diferentes tipos de células foram utilizados neste estudo - Patu8902 (células de tumor pancreático) e PS1 células (células estreladas do pâncreas registrados 21). As duas linhas de células foram cultivadas em meios de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) suplementado com 10% (v/v) fetal bovino serum(FBS), 1 × penicilina-estreptomicina (p/s).</li>
	<li>Lavar as células uma vez com 5 mL de Dulbecco &#39; saline(DPBS) de tampão de fosfato de s.</li>
	<li>Células de desanexar do plástico de superfície por trypsinizing com 2 mL de 0.05% Trypsin-EDTA para 5-10 min a 37 ° C. Check para destacamento de células sob um microscópio.</li>
	<li>Deactivate tripsina pela adição de meio de crescimento de 8 mL de desanexado células. Evite sobre tripsinização, como isto pode afetar adversamente a saúde/viabilidade de células.</li>
	<li>Células de pipeta acima e para baixo para gerar uma única célula suspensão e contagem de células densidade usando um contador automatizado de células ou um hemocytometer.</li>
	<li>Entretanto, equilibrar um frasco de NS à temperatura ambiente.</li>
	<li>Calcular a quantidade de células necessárias para semear o número desejado de esferoides (poços) e a alíquota para um novo tubo cônico de 15 mL. Por exemplo, a semente de um inteiro 96 placa bem com 5.000 células/poço, células de alíquota pelo menos 5,5 × 10 5.</li>
	<li>Coletar células por centrifugação a 500 x g durante 3 min. cuidadosamente aspirar ou decante o sobrenadante e ressuspender as células em uma concentração de 1,0 x 10 6 células/mL em meios de crescimento. Pipeta suavemente usando uma ponta da pipeta ampla entediado para evitar distorção. Por exemplo, 5,5 x 10 5 eritrócitos em 550 µ l de meio crescimento.</li>
	<li>Magnetizar a quantidade desejada de células usando o NS equilibrado (passo 1.6).
	<ol><li>Diretamente adicionar NS para a suspensão de células em meios de crescimento e agitar suavemente. Para eficiente magnético rotulação de células, use 10 µ l NS por 100 µ l células (resuspended a 1 x 10 6 células/mL). 
		Nota: Para um experimento típico, etiqueta 5.5 × 10 5 Patu8902 células em 550 µ l com 55 µ l NS e 1,1 × 10 6 PS1 em 1100 µ l, (separadamente) com 110 µ l NS.</li>
		<li>Suavemente invertido tubo algumas vezes para garantir a suspensão de células. Temporariamente, transferi a mistura de célula-NS em um único poço de uma placa de 24. Fazer isso separadamente para cada tipo de célula a ser magnetizado. Cobrir a placa e incubar a células em temperatura ambiente por 2 h com agitação suave para permitir a ligação de NS a superfície celular. 
		Nota: Cultura e ensaio de esferoides, começando a partir de Patu8902 ou PS1 células sozinhos, além de esferoides co-cultura, começando com os dois tipos pré-misturados antes de impressão em unidades magnéticas com êxito foi alcançado usando esse método de independente de células experimentos. Um método para gerar esferoides co-cultura de células Patu8902 e PS2 é descrito nas etapas subsequentes.</li>
	</ol></li> <li>Pipeta e descer as células magnetizadas delicadamente para misturar uniformemente e preparar uma mistura de mestre contendo o número do celular desejado. Para semeadura esferoides, usar um total de 15.000 células (5.000 Patu8902 + 10.000 PS1) e ajustar para um volume total de 150 µ l por alvéolo de uma placa de 96 poços. 
	Nota: O volume final dispensado em cada poço deve ser o mesmo, independentemente do número de células utilizadas.</li>
	<li>Colocar uma placa de 96 poços repelente de célula no topo a unidade magnética 96 poços esferoide e dispensar 150 µ l de mistura de célula para cada poço. Observe as células lentamente recolher para o centro do poço acima do ímã. Cobrir e incubar a placa durante a noite numa incubadora 5% CO 2 conjunto a 37 ° C com a unidade magnética esferoide ainda ligada. Remova o disco magnético e incube por mais crescimento por até 7 dias. 
	Nota: É fundamental usar placas de crescimento celular repelente para impressão de esferoide usando unidades de esferoide magnético. Certifique-se de que a unidade de esferoide com ímãs menores mais finos é usada, não a unidade de exploração.</li>
	<li>Acompanhar o crescimento de esferoides todos os dias. Reabastecer com mídia de crescimento fresco a cada três dias, colocando a placa de crescimento, montada sobre o magnético segurando o carro em um ângulo e usando uma pipeta multicanal para atrair mídia irradiada. 
	Nota: As células Patu8902 e PS1 co semeadas em 15.000 células/poço crescerá em 3D esferoides de 400-600 µm de diâmetro dentro de 5-7 dias. Neste ponto esferoides estão prontos para caracterização metabólica, avaliação de drogas e outras aplicações a jusante.</li>
</ol> 2. Ensaio metabólico de esferoides de Tumor pancreático 3D para caminhos de bioenergética, usando o analisador de fluxo extracelular Nota: nesta seção, a análise das funções metabólicas dos esferoides utilizando-se um fluxo extracelular analisador com microplacas de ensaio especificamente projetadas para 3D esferoides é descrito.
<ol><li>Lavagem e transferência de esferoides de placas de crescimento para esferoide ensaio microplacas. 
	Nota: Esferoides podem ser usados para ensaios metabólicos quando atingem um diâmetro de ~ 500 µm.
	<ol><li>o dia antes de realizar o ensaio, hidrate o cartucho de sonda ou sensor com ensaio calibrant (200 µ l/poço) na placa de utilitário fornecido e incubar durante a noite (4-18 h) em uma incubadora umidificada (não-CO 2) definido em 37 ° C.</li>
		<li>Preparar o meio adequado para o ensaio metabólico desejado, completando os meios de comunicação de base (ver a tabela de materiais) com qualquer ensaio de 2 mM L-glutamina para teste de stress de glicólise (GST) ou com piruvato de 1 mM, 2 mM L-glutamina e 10mm glicose para um ensaio de teste de estresse mitocondrial (MST). 
		Nota: O analisador de fluxo extracelular mede tanto a respiração mitocondrial (OCR) e a glicólise (ECAR) de células vivas em um formato de placa de 96 poços. Estas taxas fornecem uma visão geral das funções metabólicas celulares em amostras sob investigação. Por favor consulte o manual nos kits de ensaio para obter instruções detalhadas.</li>
		<li>Após a adição do ensaio suplementos específicos (consulte a etapa 2.1.1), aquecer o doseamento completados em banho maria a 37 ° C e ajustar o pH para 7,4 ± 0.1 com 0.1N NaOH. Aquecer o meio até uso.</li>
		<li>Reconstituir ensaio reagentes no meio de ensaio calibrado para concentrações recomendadas ações. 
		Nota: Estes são feitos em 10 × a concentração final desejada em poços. Estoque concentrações de glicose, oligomicina e 2-deoxy-glicose (2-DG) são 100 mM, 100 µM e 500 mM, respectivamente.</li>
		<li>Observar esferoides da placa de crescimento sob uma luz de microscópio para verificar para morfologia de esferoide e uniformidade global; em termos de forma e estruturase dos esferoides.</li>
		<li>Transferência da placa de crescimento em uma unidade de exploração magnética e Aspire cuidadosamente o meio de crescimento ~ 120 µ l. Delicadamente lavar esferoides com ~ 120 µ l de mídia ensaio aquecido e pré-calibrados, Aspire e repita a lavagem duas vezes. Inspecione os esferoides sob o microscópio novamente para garantir que esferoides não são lavados.</li>
		<li>Preparar a microplaca de ensaio esferoide adicionando mídia de ensaio quente 180 µ l de cada poço.</li>
		<li>Definir uma P20 micropipeta de 10 µ l e caber uma ponta larga entediada para isso. Se larga entediadas dicas não estiverem disponíveis, cortar as pontas das pontas de pipetas regular com uma tesoura limpa ou bisturi para alargar o furo. 
		Nota: Isso deve reduzir a distorção e preservar a morfologia geral dos esferoides enquanto sendo transferido para ensaio placas.</li>
		<li>Usar uma superfície quente (37 ° C) para realizar a transferência de esferoides. Use uma superfície de visualizador de filme de raio-x aquecida com uma lâmpada de luz branca para realçar o contraste e visualização de esferoides durante o processo de transferência de auxílio.</li>
		<li>Cuidadosamente aspirado um esferoide pre-lavado único da placa de crescimento celular repelente usando uma micropipeta P20 equipado com uma ampla furo ponta e suavemente esferoide de transferência diretamente para o centro de cada poço da placa de ensaio esferoide para efectuar a metabólica do ensaio. Permitir que cada spheroid para cair suavemente a microcâmara central de cada poço pela gravidade pura para preencher a placa de ensaio. 
		Nota: Normalmente leva 5-8 s para cada spheroid para cair no centro do poço por gravidade. Não puxe a pipeta até os esferoides se estabeleceram na microcâmara. Fazer não depósito esferoides em poços de 4 canto da placa de ensaio (A1, A12, H1, H12) uma vez que estes serão usados como poços fundo.</li>
		<li>Monitorar a morfologia e a posição de cada spheroid para garantir que cada esferoide é no centro de cada poço. Se necessário, reposicione ao centro do poço aspirando fora esferoide usando uma ampla furo ponta da pipeta e subsequente deposição pela gravidade.</li>
		<li>Uma vez que foram transferidos todos os esferoides, coloque a placa de ensaio em uma incubadora de ar umidificado de 37 ° C (não-CO 2) para antes de uma hora do ensaio.</li>
	</ol></li> <li>Carregar cartucho de sensor de compostos ao realizar o ensaio <ol><li>preparar 10 × concentrou-se na mídia específica do ensaio descrita na etapa 2.1.2 reagentes específicos de ensaio. Por exemplo, realizar GST, reconstituir a glicose, oligomicina e 2-DG em volumes recomendados referido no manual do ensaio. GST e o MST ensaios foram realizados usando Patu8902-PS1 esferoides.</li>
		<li>Corretamente orientar o cartucho do sensor com linhas rotuladas A-H no lado de mão esquerda e colocar um guia de carregamento no topo do cartucho do sensor. Garantir o correto carregamento de porta desejada pelo orientando o carregamento de guia para que a letra correspondente à porta para ser carregado no canto superior esquerdo.</li>
		<li>Usando uma pipeta multicanal, dispense os reagentes diretamente em portos de injeção. Mantenha guias de carregamento em posição usando a ponta dos dedos ao longo do processo. 
		Nota: Cada reagente será injetado em uma porta recomendada prevista no manual de ensaio. Evitar a criação de bolhas de ar, mas não toque em qualquer parte do cartucho para remover as bolhas de ar.</li>
		<li>Remover a guia de carregamento e posição ao nível dos olhos com cartucho para inspecionar visualmente portos de injeção para o mesmo carregamento.</li>
		<li>Criar o protocolo de projeto/instrumento de ensaio experimental usando o controlador do instrumento software onda (doravante, o software de análise), conforme descrito na seção 2.3.</li>
	</ol></li> <li>Ensaio design e execução usando o software de análise <ol><li>criar um modelo de ensaio para o experimento <ol><li>abrir o software de análise e clique em &#34; modelos &#34; ou escolher um ensaio existente modelo. Clique duas vezes no &#34; modelo em branco &#34;.</li>
			<li>Definir grupos experimentais e condições.
			<ol><li>Estratégias de injeção definir para portas A, B e C. deixar vazio de Porto D. 
				Nota: Para o ensaio da GST, somente essas portas, estarão com glicose, oligomicina e 2-DG. No caso de ensaio de MST, oligomicina, FCCP e rotenona serão carregados.</li>
				<li>Definir pré-tratamentos se esferoides foram tratados com um ou mais compostos de teste e grupo controle. Definir os meios de ensaio para incluir fonte, suplementos e outras informações.</li>
				<li>Definir um ou mais tipo de células (por exemplo, Patu8902, PS1) ver a informação do número densidade e passagem.</li>
			</ol></li> <li>Clique &#34; gerar grupos de &#34;.</li>
			<li>Clique &#34; placa mapa &#34; guia e atribuir grupos para a placa de ensaio correspondente para o delineamento experimental.</li>
			<li>Selecione os poços de quatro canto como poços de fundo. Certifique-se de que não há nenhum esferoides nesses poços.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Executar ensaio no analisador <ol><li>clique na guia instrumento protocolo manter o padrão comandos do protocolo verificando &#34; calibrar &#34;, &#34; equilíbrio &#34; e &#34; ciclo de medição da linha de base &#34;.</li>
		<li>Clique &#34; injeções &#34; e definir compostos para cada porta. Edite ciclos de medição para 6 ciclos padrão de 3 ciclos de esferoides. Mantenha a mistura de 3 min padrão, 0 min espera e vezes de medida 3 min. 
		Nota: Tempos de mistura-espera-medida padrão são 3 min, min 0, 3 min, respectivamente. Três medições da taxa basal normalmente são tomadas antes da injeção do primeiro ensaio de composto. Estas medições podem ser calibradas e reajustadas conforme o delineamento.</li>
		<li>Revisão de protocolo e Resumo do grupo.</li>
		<li>Salvar ensaio projeto modelo.</li>
		<li>Proceder à calibração do pré-ensaio uma vez que os portos de injeção foram carregados com substratos de ensaio. Transferir o cartucho com a placa de utilidade para o analisador de fluxo extracelular. 
		Nota: Este geralmente é concluída no prazo de 15 a 20 min e calibra os sensores para realizar medidas de OCR e ECAR.</li>
		<li>Após a calibração do cartucho, substitua a placa de utilidade com a placa de ensaio pré-aquecido contendo esferoides 3D e iniciar o ensaio. Após concluídas as medições, exportar os dados para a planilha ou software de gráfico e estatístico para analisar os dados.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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Os autores George W. Rogers e Andrew Neilson são empregados/acionistas da Agilent Technologies que produz reagentes e instrumentos utilizados neste artigo. Todos os outros autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Usando o câncer de pâncreas, o 3rd principal causadora de câncer relacionados mortes nos Estados Unidos24, como um exemplo e um modelo, um método rápido e consistente foi desenvolvido para crescer e ensaio esferoides 3D usando a co-cultura de células de câncer pancreático e activado no pâncreas fibroblastos. Usando bioprinting magnético, obtiveram-se esferoides variando em tamanho de 400-600 µm de diâmetro. Estas foram submetidas a ensaios metabólicos para testar com sucesso a funcionalidade dos culturas esferoides 3D. Este método é simples, consistente e pode ser facilmente adaptado para outros tipos de células.
Enquanto esta metodologia vai acelerar e aumentar o valor de translação dos ensaios realizados com esferoides 3D, pode ser melhorado através do desenvolvimento de técnicas que permitem multiplexação de manipulação esferoide e manipulação. Isso deve reduzir o tempo total, custo e o trabalho necessário para realizar o ensaio. Além disso, volumes esferoide podem ser usados para normalizar o OCR sinais como relatado por outros6. Volume de esferoide normalizado pelo volume médio de uma célula pode ser usado para determinar o OCR por célula, mas desde que o crescimento de esferoides não será idêntico, calcular um OCR absoluto por célula pode ser um desafio. Atualmente, esta metodologia é limitada pela falta de uma ferramenta eficiente para manipulação de esferoide multiplex e transferência das placas de crescimento a ensaiar o ambiente.
O método descrito é modificado e adaptado a partir da tecnologia de bioprinting magnética e mais validado para mostrar a relevância funcional aplicando os esferoides cultivadas para um ensaio metabólico a jusante. O método fornece uma ferramenta importante para gerar esferoides robustas, viáveis e funcionais que contêm os dois tipos principais de célula encontrados na maioria dos tecidos do tumor, as células cancerosas e fibroblastos de cancro associado, que podem ser empregados para outros ensaios experimentais, tais como telas de drogas. A relativa facilidade e a eficiência da metodologia NS é uma grande melhoria sobre outros métodos25, tais como a suspensão drop método2,26 da geração de esferoide.
Esferoides robustos gerados como tal fornecem um em vitro modelo de tumor que inclui células do estroma, que muitas vezes estão falta em muitos estudos de cultura 3D. As possibilidades de aplicação de modelos 3D esferoide gerado como tal são vastas. Por exemplo, tais modelos podem ser empregados para investigar interações célula-célula, turnos de Bioenergética e testar a susceptibilidade genética e dependência de vários regimes terapêuticos. Esferoides 3D que recapitular o microambiente do tumor na vivo servem como ferramenta altamente relevante e úteis para estudos e aqueles investigando os mecanismos de ação da terapêutica atual e inovador de despistagem de drogas. Ensaios metabólicos sondando caminhos de energia usando esferoides culturas com as células mutantes podem ajudar a lançar uma nova luz sobre o papel desses genes e vias relacionadas no Patobiológico em um modelo 3D relevante de câncer, como os esferoides descritos neste estudo.
O sucesso da aplicação deste método baseia-se, acima de tudo, sobre a saúde das células necessárias para a impressão magnética, é por isso que a célula crescendo em fase logarítmica deve ser colhida e magnetizada. É fundamental usar a unidade magnética esferoide para imprimir células magnetizadas e não a unidade de exploração, que deve ser utilizada apenas durante a lavagem de esferoide e mídia reabastecendo etapas do método descrito. O outro aspecto mais crítico de leitura bem sucedida de ensaios metabólicas é manter a morfologia dos esferoides durante o processo de transferência da placa de crescimento para a placa de ensaio.
Em geral, este protocolo foi estabelecido para geração de esferoides 3D que contêm células do estroma, após o ensaio metabólico subsequente dos esferoides usando o analisador de fluxo extracelular e câncer. As principais características desse método são que é rápida, facilmente adaptável e consistentes, relevantes para e imita o microambiente do tumor na vivo , é relativamente barato e pode servir como uma nova ferramenta para estudar a biologia do tumor e desenvolver anticâncer agentes.

Na última década, foram desenvolvidos numerosos em vitro modelos 3D para recapitular e investigar na vivo tumor biologia microambiente condições e crescimento de células de câncer1,2. Cultura em sistemas com uniforme exposição a fatores bioquímicos e compostos experimentais não para replicar as interações de tumor estromal 3D nativas expostas para um gradiente de difusão através do extracelular de compostos de células bidimensional monocamada (2D) matriz de3,de proteínas (ECM)4. Assim, em comparação com modelos de cultura de tecidos 2D, 3D câncer modelos surgiram para melhor mostrar potencial no simulando o microambiente do tumor e serviu como ferramentas importantes para melhor compreender na vivo tumor características, tais como hipóxia, desmoplasia, letargia, penetrância drogas, toxicidade e resistência terapêutica5,6. Para este fim, modelos 3D têm potencial para colmatar o fosso entre a cultura de pilha 2D e modelos animais toda imitando na vivo características do tumor, apesar de ser relativamente barato e otimizado para geração rápida e consistência. Estas vantagens estão a ser exploradas para acelerar a pesquisa translacional em muitas áreas, incluindo a biologia do câncer, morfogênese e tecido engenharia7,8.
Em uma onda de evolução de métodos de cultura de tecido 3D, técnicas de levitação magnética recentemente foram desenvolvidas e descritas para o crescimento, imagem de esferoides e análise do derivado de várias células tipos9,10, 11 , 12. bioprinting 3D magnética explora o uso de forças magnéticas para engenheiro de tecidos por células com nanopartículas biocompatíveis de magnetização e imprimi-los em formatos múltiplos bem. Isto permite a rápida produção de consistente, perto de esferoides 3D idênticos, o que podem ser aproveitados e utilizados para uma infinidade de aplicações a jusante para investigação bioquímica e biofísica10. Aqui nós adaptamos a técnica de bioprinting magnética usando um material biocompatível, chamado Nanoshuttle (NS) composto de óxido de ferro, poli L-lisina e ouro nano partículas de rotular de fibroblastos e células de câncer pancreático. NS une eletrostaticamente a membrana plasmática, não é conhecido para vincular a qualquer receptores específicos e lançamentos fora da célula de superfície dentro de uma semana. Requer muito baixas forças magnéticas (30pN), suficiente para agregado mas não prejudicar as células e não afeta a viabilidade celular, metabolismo ou proliferação para torná-lo extremamente biocompatíveis para culturas 3D10,13,14 ,15.
Neste estudo, usando o câncer pancreático como um exemplo e modelo, descrevemos a geração e o ensaio metabólico de esferoides de fibroblastos-células de câncer 3D. A partir de células cultivadas em vasos de 2D, ilustramos as condições de cultura e crescimento de esferoides de co-cultura de tumor pancreático-fibroblasto usando bioprinting magnético. Esferoides cultivadas foram então usados em ensaios metabólicos funcionais, usando um analisador de fluxo extracelular, uma tecnologia demonstrou a medida simultaneamente as duas vias produtoras de energia principais, a glicólise e a respiração mitocondrial, em uma variedade de ao vivo células e tecidos16,17,18,19,20. Glicólise foi medido como uma alteração na taxa de acidificação do extracelular (ECAR), enquanto a respiração mitocondrial ou fosforilação oxidativa foi medida como taxa de consumo de oxigênio (OCR). Propomos que esse método desenvolvido por esferoides de tumor pancreático pode servir como uma espinha dorsal para a otimização e traduzindo o tumor 3D esferoide geração e ensaio para outros tipos de célula/tecido.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin EDTA</td><td>Sigma</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>96 well cell repellant plate</td><td>USA Scientific/ Griener Bio-One</td><td>655970</td><td>spheroid growth plate</td></tr><tr><td>Cellometry Cell counting slides</td><td>Nexcelom&amp;nbsp;</td><td>CHT4-SD100-002</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Glycolysis Stress Test Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>103020-100</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>59202C</td><td></td></tr><tr><td>&lt;span class=&quot;font5&quot;&gt;Mitochondrial&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font5&quot;&gt; Stress Test Kit&lt;/span&gt;</td><td>Agilent Technologies</td><td>103015-100</td><td></td></tr><tr><td>n3D Magnetic Spheroid drive</td><td>Nano3D Bioscience</td><td>655841</td><td>Part of &lt;span class=&quot;font5&quot;&gt;Spheroid Bioprinting &lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font5&quot;&gt;Kit&lt;/span&gt;</td></tr><tr><td>n3D Magnetic Spheroid holding drive</td><td>Nano3D Bioscience</td><td>655841</td><td>Part of &lt;span class=&quot;font5&quot;&gt;Spheroid Bioprinting &lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font5&quot;&gt;Kit&lt;/span&gt;</td></tr><tr><td>n3D NanoShuttle-PL&amp;nbsp;</td><td>Nano3D Bioscience</td><td>655841</td><td>Part of Spheroid Bioprinting &lt;span class=&quot;font5&quot;&gt;Kit&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font5&quot;&gt;:&amp;nbsp; store at 4 &amp;deg;C&lt;/span&gt;</td></tr><tr><td>Patu8902 cells</td><td>Laboratory Stock</td><td></td><td>pancreatic ductal adenocarcinoma cells</td></tr><tr><td>PS1 cells</td><td>Laboratory Stock</td><td></td><td>activated pancreatic stellate cells</td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875&lt;span class=&quot;font5&quot;&gt;-093&lt;/span&gt;</td><td>growth media for cells, spheroids</td></tr><tr><td>SeaHorse XF&lt;span class=&quot;font12&quot;&gt;&lt;sup&gt;e&lt;/sup&gt;&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font5&quot;&gt;96 extracellular flux analyzer&lt;/span&gt;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>extracellular flux analyzer</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>XF Base media</td><td>Agilent Technologies</td><td>102365-100</td><td>base media for metabolic assays on XF&lt;span class=&quot;font12&quot;&gt;&lt;sup&gt;e&lt;/sup&gt;&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font5&quot;&gt;96&lt;/span&gt;</td></tr></tbody></table>

preparation and metabolic assay of 3-dimensional spheroid co-cultures of pancreatic cancer cells and fibroblasts

Muitos tipos de câncer, incluindo câncer de pâncreas, têm uma densa estroma fibrótica que desempenha um papel importante na progressão do tumor e invasão. Fibroblastos de câncer registrados associado são um componente-chave do estroma tumor que interagem com as células cancerosas e apoiar o seu crescimento e sobrevivência. Modelos que recapitular a interação das células cancerosas e ativado fibroblastos são ferramentas importantes para o estudo da biologia do estroma e para o desenvolvimento de agentes antitumorais. Aqui, um método é descrito para a rápida geração de co-cultura robusto 3-dimensional (3D) esferoide de células de câncer no pâncreas e fibroblastos pancreáticos ativados que podem ser usados para estudos biológicos subsequentes. Além disso, descreveu é o uso de esferoides 3D na realização de ensaios metabólicos funcionais para sondar os caminhos de Bioenergética celular usando um analisador de fluxo extracelular emparelhado com uma esferoide microplaca. Células de câncer pancreático (Patu8902) e células de fibroblastos pancreático ativado (PS1) co foram cultivadas e magnetizado usando um conjunto de nanopartículas biocompatíveis. Magnetizada células foram rapidamente bioprinted usando unidades magnéticas em um formato bem 96, em meios de crescimento para gerar esferoides com diâmetro variando entre 400 e 600 µm no prazo de 5-7 dias de cultura. Funcionais ensaios metabólicos usando Patu8902-PS1 esferoides então foram realizados utilizando a tecnologia de fluxo extracelular para sondar vias energéticas celulares. O método aqui é simples, permite a geração consistente de câncer célula-fibroblasto esferoide co culturas e pode ser potencialmente adaptado para outros tipos de células de câncer sobre otimização da atual metodologia descrita.

O fluxo de trabalho geral para bioprinting magnética e análise de fluxo extracelular de esferoides 3D 
A Figura 1 mostra uma visão geral de todo o processo descrito neste protocolo. Células de câncer pancreático (Patu8902) e células estreladas ativadas (PS1) foram cultivadas em frascos de cultura de tecidos que contém a mídia de crescimento adequado para uma confluência de 70-80%. As células foram desanexadas da nave cultura 2D e lavagem, densidade celular estava determinada e células finalmente resuspended em meios de crescimento a 1 × 106 células/mL. NS, uma montagem de nanopartículas de poli-L-lisina, óxido de ferro e ouro foi utilizado para magnetizar as células. Magnetizada individualmente as células Patu8902 e PS1 então foram misturadas e impressas em placas de 96 poços de crescimento celular repelente montadas em uma unidade magnética esferoide. Otimizamos a 15.000 para ser o número total de células para semeadura de um único poço (5.000 células Patu8902 misturados com 10.000 células PS1 para gerar um único esferoide). Após a incubação, em condições de cultura de tecido apropriado para 5-7 dias, foram obtidos 3-dimensional esferoides, tempo durante o qual o crescimento desses esferoides foi monitorado e gravado. Após a lavagem com mídia de ensaio, esferoides fisicamente foram transferidos para uma esferoide microplacas para realizar ensaios metabólicos, utilizando um analisador de fluxo extracelular para a medida simultânea da glicólise e respiração mitocondrial.
Cultura e crescimento de esferoides de tumor pancreático-fibroblasto Para obter esferoides funcionais e robustos, a célula de câncer epitelial linha Patu8902 e ativado células estreladas PS1 foram cultivados em RPMI-1640, suplementado com soro fetal bovino. Pat8902 e células de PS1 magnetizadas com NS foram então misturadas na proporção de 1:2, a fim de propagar um total de 15.000 células por poço em uma placa de crescimento. Dentro de 24 h de imprimir as células para as unidades magnéticas, células focalizado para o centro do poço exatamente no topo de cada Peão magnético sob cada poço. Crescimento de esferoides Patu8902-PS1 foi monitorado pela imagem latente nos dias 2, 4, 7 e 9, após a semeadura de células. A Figura 2 mostra a quantificação do diâmetro médio de esferoides representativos em vários pontos do tempo acima. O diâmetro de esferoides aumenta de 414 µm no dia 2 para 596 µm no 7º dia pós impressão. Não houve diferença significativa entre crescimento nos dias 7 e 9, e assim, todas as outras experimentação foi limitada a 7 dias de crescimento de esferoide. Percebemos que os esferoides adquirem uma morfologia mais nítida, especialmente ao redor das bordas exteriores e o NS progressivamente é mais uniformemente difusa em todo o volume do spheroid com mais dias em cultura. Também estimamos a esfericidade de 10 esferoides baseado no comprimento dos seus eixos maiores e menores. A esfericidade média é 0,92 ± 0,04 para Patu8902 sozinho (tumor), 0.95 ± 0,04 para PS1 (estroma) sozinho e 0,94 ± 0,02 para esferoides co-cultura.
Ensaio metabólico funcional do pâncreas esferoides 3D usando o analisador de fluxo extracelular Para testar a funcionalidade dos esferoides, utilizamos metabólica e análise bioenergética para sondar os caminhos da energia no esferoides. Foi realizado um teste de estresse de glicólise em esferoides cultivadas como descrito acima. Para este fim, esferoides gerados a partir de células ou Patu8902 ou PS1 além das resultantes de uma cultura co a tipos de duas células foram submetidas a ensaio. Curiosamente, todos os três tipos de esferoides, se originários de células distintas ou mistas, exibiram uma resposta biologicamente funcional para o ensaio de GST. Ao injetar uma concentração saturante de glicose, os tipos de esferoides testaram mostrar aumentos na via glicolítico como evidenciado por um aumento na ECAR (Figura 3). Quando, a produção de ATP mitocondrial foi inibida usando oligomicina, produção de energia muda para a glicólise e empurrado células para capacidade máxima glicolítico, vista como aumento ECAR. Inibição da glicólise usando 2-DG, uma glicose analógico que liga-se competitivamente glicose hexoquinase, resultado em uma diminuição na ECAR, confirmando que o aumento prévio ECAR foi devido à atividade glicolítico. Notamos que os esferoides testadas neste estudo responderam desta forma, embora os PS1 sozinhos esferoides (diâmetro médio de 250 µm) tinham um sinal relativamente menor, possivelmente devido a seu tamanho menor e menor capacidade glicolítico comparado ao câncer de Patu8902 células (diâmetro médio 600 µm). Em geral, uma maior ECAR sinal da célula de tumor derivada esferoides comparados de relativamente menor do fibroblasto PS1 derivado esferoides, possivelmente poderia ser atribuída a inclinação de metabólica inerente das células câncer para glicólise22, 23. Todos os três tipos de esferoides foram derivados de semear o mesmo número de células, embora notamos variação de tamanho de esferoide entre cada tipo, com PS1 esferoides sozinhos sendo menor, seguido de esferoides co-cultura, e esferoides sozinhos Patu8902 sendo o maior.
Para testar a função mitocondrial em 3D esferoides, sujeitámos esferoides co-cultura para um ensaio do MST. O MST mede parâmetros-chave de função mitocondrial medindo diretamente o OCR de células (Figura 4A e 4B). Uma injeção serial com compostos (oligomicina, FCCP e uma mistura de rotenona e antimycin A) foi usada para medir parâmetros mitocondriais-chave tais como, produção de ATP, respiração máxima e respiração mitocondrial-não. Estes parâmetros e taxas de respiração basal mais foram usadas para calcular a fuga de próton e capacidade respiratória (Figura 4). Uma diminuição em OCR em resposta a oligomicina, um inibidor da ATP sintetase (complexo V) se correlaciona com a respiração mitocondrial associada à produção de ATP celular. Esferoides foram incubados com oligomicina para uma duração mais longa permitir a penetração máxima e tempo de resposta eficiente. Uma segunda injeção com o desacoplador FCCP estimula o consumo máximo de oxigênio e um aumento correspondente no OCR. O OCR Compararia-estimulada foi utilizado para calcular a capacidade respiratória, uma medida da capacidade da célula para responder à procura crescente de energia. A terceira injeção; uma mistura de rotenona, (um complexo eu inibidor) e antimycin A (um inibidor do complexo III) bloqueia a respiração mitocondrial, vista como uma diminuição acentuada em OCR (Figura 4BONG >).
Em geral, nossas observações confirmam a funcionalidade de esferoides cultivadas usando um analisador de fluxo extracelular como uma medida de sua pegada/atividade metabólica tanto em termos de potencial mitocondrial e glicolítico, como descrito acima.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig1.jpg"> 
Figura 1 . Representação esquemática da metodologia para a cultura e o ensaio de esferoides de células de fibroblastos/câncer de pâncreas. Patu8902 e PS1cells foram cultivadas, trypsinized, lavados e contados. Para a propagação cada esferoide, Patu8902 (5.000 células/poço) e fibroblastos PS1 (10.000 células/poço) foram magnetizados usando NS e impresso em uma placa de crescimento celular repelente no dia 1. Após a semeadura, a placa de crescimento foi montada em uma unidade de esferoide magnético (com um íman em cada poço da placa de crescimento de 96 formato bem) e permitiu a cultura para 2-7 dias obter 3D esferoides. Os resultantes esferoides foram lavados e transferidos para as esferoide ensaio microplacas para realizar os ensaios metabólicos no instrumento fluxo extracelular. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig2.jpg"> 
Figura 2 . Crescimento de esferoides de tumor pancreático-fibroblasto. (A) uma imagem representativa do esferoide de co-cultura Patu8902-PS1 correspondente ao dia da cultura é mostrada na parte superior e o tamanho de diâmetro do spheroid (µm) é quantificado abaixo. Aumento progressivo no tamanho de esferoide e difusão de partículas do NS (pontos escuros) em todo o seu volume é evidente entre os dias 2 e 7. Esferoides foram mantidas em cultura por mais dias 2 depois disto, que não resultou em um aumento significativo do diâmetro de esferoide. (B) representante fotos de esferoides derivados de células tumorais (Patu8902), células do estroma (PS1) e células cultivadas co (Patu8902 + PS1) é mostrado. Dados (C) a esfericidade são retratados de 10 esferoides individuais de cada grupo. Barras de erro representam o desvio padrão (SD). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig3.jpg"> 
Figura 3 . Teste de estresse de glicólise (GST) com esferoides pancreáticos. (A) representação esquemática de um ensaio de típica função glicolítico com diversos parâmetros de ensaio descrito. (B) um exemplo de um teste de GST realizada sobre os pâncreas esferoides cultivadas usando a metodologia descrita. Rampas de injeção de glicose acima de glicólise, visto como um aumento na ECAR, com aumento na adição de oligomicina para desligar a respiração mitocondrial. ECAR cai em resposta a 2-DG, um análogo do competidor da glicose, através do bloqueio de glicólise. Todos os esferoides são anotados para expor uma resposta funcional para o ensaio de GST. (C) uma saída do ensaio GST usando o gerador de relatórios do fabricante retratando os três principais parâmetros do ensaio do GST. Barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig4.jpg"> 
Figura 4. Teste de Stress mitocondrial (MST) com Patu8902-PS1 esferoides. (A) representação esquemática de um ensaio de típica função mitocondrial com diversos parâmetros de ensaio é retratada. (B) um exemplo de um MST em esferoides o tumor pancreático-fibroblasto é mostrado. Esferoides 3D (C) co-cultura exibem uma resposta funcional para o ensaio do MST. Como esperado, função mitocondrial medida como um declínio em OCR foi notada quando esferoides foram desafiados com oligomicina, inibidor de ATP sintase. Usar FCCP para aumentar o fluxo de elétrons resultou em OCR máxima, que imediatamente entrou em colapso após a inibição da respiração mitocondrial usando um - coquetel de inibidores de complexos mitocondriais. Barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig4large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Aqui, um método é descrito para a preparação de co-cultura 3-dimensional (3D) esferoide de células de câncer no pâncreas e fibroblastos, seguidos por medição das funções metabólicas, usando um analisador de fluxo extracelular.

Preparação e ensaio metabólico de 3-dimensional Spheroid co culturas de células de câncer no pâncreas e fibroblastos

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

preparation-metabolic-assay-3-dimensional-spheroid-co-cultures

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

12.2K visualizações.  Translational Genomics Research Institute. Aqui, um método é descrito para a preparação de co-cultura 3-dimensional (3D) esferoide de células de câncer no pâncreas e fibroblastos, seguidos por medição das funções metabólicas, usando um analisador de fluxo extracelular.

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Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

Avaliando a viabilidade celular e morte em 3D culturas esferóides de células cancerosas

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Pesquisa do câncer

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and progression. Complexity within the tumor microenvironment, including tumor secretome, low-grade inflammation, hypoxia, and redox imbalance, fosters heterotypic interaction and allows the transformation of inactive resident fibroblasts to become active CAFs. CAFs are metabolically distinguished from normal fibroblasts (NFs) as they are more glycolytically active, produce higher levels of reactive oxygen species (ROS), and overexpress lactate exporter MCT-4, leading to the opening of the mitochondrial permeability transition pore (MPTP). Here a method has been described to analyze the mitochondrial health of activated CAFs isolated from the multicellular 3D tumor spheroids comprising of human lung adenocarcinoma cells (A549), human monocytes (THP-1), and human lung fibroblast cells (MRC5). Tumor spheroids were disintegrated at different time intervals and through magnetic-activated cell sorting, CAFs were isolated. The mitochondrial membrane potential of CAFs was assessed using JC-1 dye, ROS production by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) staining, and enzyme activity in the isolated CAFs. Analyzing the mitochondrial health of isolated CAFs provides a better understanding of the reverse Warburg effect and can also be applied to study the consequences of CAF mitochondrial changes, such as metabolic fluxes and the corresponding regulatory mechanisms on lung cancer heterogeneity. Thus, the present study advocates an understanding of tumor-stroma interactions on mitochondrial health. It would provide a platform to check mitochondrial-specific drug candidates for their efficacies against CAFs as potential therapeutics in the tumor microenvironment, thereby preventing CAF involvement in lung cancer progression.

Multicellular 3D tumor spheroids were prepared with lung adenocarcinoma cells, fibroblasts, and monocytes, followed by the isolation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) from these spheroids. Isolated CAFs were compared with normal fibroblasts to assess mitochondrial health by studying the mitochondrial transmembrane potential, reactive oxygen species, and enzymatic activities.

Avaliação da Saúde Mitocondrial em Fibroblastos Associados ao Câncer Isolados de Esferoides de Tumores Pulmonares Multicelulares 3D

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Tridimensional modelo de co-cultura para Interaction Tumor estromal-

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Medicina

<meta charset="utf8"></head><body>Modelo 3D-PDAC Capturando Desmoplasia para Avaliação Terapêutica

Growing Desmoplastic Three-Dimensional Pancreatic Cancer Spheroids from Co-Culture

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the deadliest cancers with a 5-year survival rate of &#60;12%. The biggest barrier to therapy is the dense desmoplastic extracellular matrix (ECM) that surrounds the tumor and reduces vascularization, generally termed desmoplasia. A variety of drug combinations and formulations have been tested to treat the cancer, and although many of them show success pre-clinically, they fail clinically. It, therefore, becomes important to have a clinically relevant model available that can predict the response of the tumor to therapy. This model has been previously validated against resected clinical tumors. Here a simple protocol to grow desmoplastic three-dimensional (3D)-coculture spheroids is described that can naturally generating a robust ECM and do not require any external matrix sources or scaffold to support their growth.
Briefly human pancreatic stellate cells (HPaSteC) and PANC-1 cells are used to prepare a suspension containing the cells in a 1:2 ratio, respectively. The cells are plated in a poly-HEMA coated, 96-well low attachment U-well plate. The plate is centrifuged to allow the cells to form an initial pellet. The plate is stored in the incubator at 37 &#176;C with 5% CO2, and media is replaced every 3 days. Plates can be imaged at designated intervals to measure spheroid volume. Following 14 days of culture, mature desmoplastic spheroids are formed (i.e. average volume of 0.048 + 0.012 mm3&#160;(451 &#181;m x 462.84 &#181;m)) and can be utilized for experimental therapy assessment. Mature ECM components include collagen-I, hyaluronic acid, fibronectin, and laminin.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Validando as respostas da terapia do câncer com modelos esferoides desmoplásicos

Pancreatic cancer remains one of the toughest cancers to treat. Therefore, it is critical that pre-clinical models evaluating treatment efficacy are reproducible and clinically relevant. This protocol describes a simple co-culture procedure to generate reproducible, clinically relevant desmoplastic spheroids.

Cultivo de esferóides de câncer de pâncreas tridimensionais desmoplásicos de co-cultura

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the deadliest cancers with a 5-year survival rate of &#60;12%. The biggest barrier to therapy is the ...

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell cultures. The clinostat mimics an environment where cells can assemble as highly reproducible spheroids with low shear forces and active nutrient diffusion. We demonstrate that both cancer and non-cancer hepatocytes (HepG2/C3A and THLE-3 cell lines) require 3 weeks of growth prior to achieving functionalities comparable to liver cells. This protocol highlights the convenience of utilizing incubators for 3D cells with cameras monitoring the cell growth, as snapshots can be taken to count and measure spheroids upon treatment. We describe the comparison of THLE-3 and HepG2/C3A cell lines, showing how non-cancerous cell lines can be grown as well as immortalized cancer cells. We demonstrate and illustrate how proteomics experiments can be conducted from a few spheroids, which can be collected without perturbing cell signaling, i.e., no trypsinization required. We show that proteomics analysis can be used to monitor the typical liver phenotype of respiratory chain metabolism and the production of proteins involved in metal detoxification and describe a semi-automated system to count and measure the spheroid's area. Altogether, the protocol presents a toolbox that comprises a phenotypic characterization via image capture and a proteomics pipeline to experiment on 3D cell culture models.

We present a protocol for growing high-reproducible spheroids and their phenotypic characterization using image capture and proteomics.

Análise Fenotípica Semi-Automatizada de Culturas Funcionais de Células Esferoides 3D

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

Bioquímica

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

A Cancer Cell Spheroid Ensaio para avaliar a invasão em um ambiente 3D

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

Preparação e ensaio metabólico de 3-dimensional Spheroid co culturas de células de câncer no pâncreas e fibroblastos

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Avaliando a viabilidade celular e morte em 3D culturas esferóides de células cancerosas

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

Avaliação da Saúde Mitocondrial em Fibroblastos Associados ao Câncer Isolados de Esferoides de Tumores Pulmonares Multicelulares 3D

Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas

Tridimensional modelo de co-cultura para Interaction Tumor estromal-

Cultivo de esferóides de câncer de pâncreas tridimensionais desmoplásicos de co-cultura

Cultivo de esferóides de câncer de pâncreas tridimensionais desmoplásicos de co-cultura

Cultivo de esferóides de câncer de pâncreas tridimensionais desmoplásicos de co-cultura

Análise Fenotípica Semi-Automatizada de Culturas Funcionais de Células Esferoides 3D

A Cancer Cell Spheroid Ensaio para avaliar a invasão em um ambiente 3D