Esta nova técnica combina espectrometria de mobilidade-mobilidade com modelagem molecular e teoria da dinâmica de reação para determinar a termoquímica relativa de duas reações de dissociação concorrentes de um complexo ternário. A combinação dessas técnicas caracteriza as vias de reação de reagentes e produtos, estruturas conformais e a afinidade do ligante para formar um complexo ternário com o íon metálico. Esta pesquisa modela a reatividade de duas potenciais etiquetas de peptídeos para purificação de proteínas recombinantes, onde a tag reage com a quelatada metálica por ácido nitrilotriactico em uma coluna de afinidade metálica imobilizada.
Comece carregando a amostra de 2 mililitros em uma seringa de nariz sem corte de 2,5 mililitros e injetando a amostra no eletrospray do instrumento usando a bomba de seringa do instrumento a uma taxa de fluxo de 10 microliters por minuto. Coloque o instrumento em espectrometria de massa de íon negativo ou modo IM-MS. Identifique o padrão de isótopo em massa de carga do complexo ternário de ligação metálica alternativa com carga negativa, ou complexo amb-metal-NTA, abrindo o programa de espectrometria de massa e selecionando spectrum.
Em seguida, selecione Ferramentas seguidas pelo Modelo de Isótopo. Na janela pop-up, liste a fórmula molecular do complexo, verifique a caixa para Show Charged Ion, digite 1 para a carga de negativa, e clique em OK.In o padrão de isótopo exibido do complexo, note o pico de massa mais baixo. No software de instrumento, selecione Configuração seguida de Quad Profile.
Em seguida, selecione Manual Fixo e digite a massa do pico de padrão isotópico mais baixo. Clique em Atualizar e feche a janela. Novamente, selecione Configuração e clique em Resolver Quad.
Colete o espectro de íon negativo IM-MS começando com a primeira energia de colisão de transferência usando uma duração de execução de 5 minutos e tempo de varredura de 2 segundos. Repita para coletar o espectro IM-MS para cada uma das outras energias de colisão. Utilize as distribuições integradas de tempo de chegada, ou áreas ATD, para o complexo ternary amb-metal-NTA e dois produtos, complexo NTA-metal e complexo amb-metal, para normalizar para uma escala percentual relativa.
A partir da dissociação induzida por colisão de limiar de réplica, ou medidas TCID, encontrar os desvios médios e padrão de cada ponto de dados. Em seguida, converta a energia de colisão de transferência de quadro de laboratório para a energia de colisão em massa. Para medir as seções transversais de colisão, colete o espectro negativo de íon IM-MS da amostra de poli-DL-alanina de 10 ppm, ou PA, por 10 minutos usando as condições de operação instrumentais.
Em seguida, colete os espectros IM-MS de cada complexo ternário por 5 minutos. Extrair o ATD de cada um dos complexos PA e ternários e exportar seus arquivos para o software de espectrometria de massa usando a opção Retain Drift Time. Encontre os tempos médios de chegada a partir do máximo das curvas ATD correspondentes.
Use um método de calibração transversal para converter os tempos médios de chegada em seções transversais de colisão do complexo ternário. Do menu principal do CRUNCH, abra o arquivo de texto GB5 contendo a energia do centro de massa, ou intensidades relativas dependentes do ECM dos produtos. Resposta Não aos parâmetros de leitura.
Em seguida, selecione Modelagem seguida de Definir todos os parâmetros. A partir das opções do modelo de reação, escolha a opção CID limiar padrão seguida por RRKM com integração sobre a distribuição de transferência de energia do complexo ternário. Digite 2 para canais de produtos independentes modelados e selecione Calcular seções transversais.
Para o tipo de modelo nãoconvolucido, escolha 0 seção transversal Kelvin, que inclui a correção estatística de RRKM dos turnos cinéticos devido à janela de tempo de 50 microsegundos da célula de colisão para o detector de tempo de voo. Para as opções de convolução, escolha a dupla integral de Tiernan, que inclui a convolução sobre distribuições de energia translacional entre o íon do complexo ternário e o gás de colisão de argônio. Para o método de integração numérica, escolha quadrature gaussiana com seções transversais pré-salvas.
A partir das opções de entrada nos parâmetros moleculares, digite G para ler o arquivo de modelagem estrutural com as frequências vibracionais e rotacionais PM6 do complexo ternário. Resposta Sim à pergunta: Um dos reagentes é atômico? Escreva a localização e o nome do arquivo de modelagem.
Digite 1 para a carga em íon e 1.664 para a polarizabilidade do gás argônio. A massa de íons e massa de destino são para o complexo ternário e argônio, respectivamente, e são lidas automaticamente a partir do arquivo de texto GB5. Digite 0 para vibrações harmônicas.
Aperte Enter para ler as constantes rotacionais 1D e 2D do arquivo de modelagem estrutural. Selecione os valores padrão de 0 para os tratamentos de rotor dificultados e 1 para simetria de moléculas. Escolha o padrão 300 Kelvin para a temperatura de reação.
Selecione Integração para o método de redução da densidade do array de estados. Selecione Sim para truncar a distribuição de energia. Digite 40000 número de onda para energia máxima para distribuição, 2 número de onda para tamanho de lixeira e 32 para o número de pontos na distribuição de energia.
Para parâmetros para o modelo TCID/RRKM, escolha Sim para Alterar, digite 0 para Tempo Fixo e 0,000050 segundos para o limite superior da janela de detecção. Para o canal do produto 1, selecione 1 para um único estado de transição a partir das opções do canal de dissociação e 0 para nenhuma dissociação sequencial. Para o tipo de estado de transição, escolha 1 para órbita.
Selecione G para ler os arquivos do programa de modelagem que contenham os parâmetros rotacionais e vibracionais PM6 para os produtos amb-metal complexo mais NTA. Enter No for:É um dos estados de transição de limite de espaço de fase, ou PSL TS, espécie atômica? Digite o local e o nome do arquivo complexo amb-metal.
Use 1.062 para frequências de escala, bata Enter para o número de átomos e digite No for:A molécula é linear? Repita o mesmo para o arquivo de modelagem que contém as frequências vibracionais e rotacionais do produto NTA. Digite a descrição do TS em órbita. Digite 1.0 para a carga de íon amb-metal e, em seguida, entre na polarizabilidade e no momento dipolo da NTA.
Selecione 0 Kelvin para temperatura rotacional e dipolo bloqueado para o tratamento do estado de transição em órbita. Entre as massas médias do íon amb-metal e nta. Aperte Enter para ler as constantes de rotação 1D e 2D dos arquivos de modelagem.
Selecione 0 para rotores dificultados, 1 para simetria de moléculas e 1 para degeneração de reação. Digite a opção Sem Alterações. Para o canal do produto 2, selecione 1 para estado de transição único, 0 para nenhum para a dissociação sequencial e 1 para orbitar para o tipo de estado de transição.
Selecione G para ler em arquivos de modelagem que contenham os parâmetros rotacionais e vibracionais PM6 para os produtos complexos NTA-metal e amb. Então, digite a descrição do TS em órbita. Digite 1.0 para a carga do íon complexo NTA-metal, e insira a polarizabilidade e o momento do dipolo da amb. Selecione 0 Kelvin para a temperatura rotacional e dipolo bloqueado para o tratamento do estado de transição em órbita.
Entre nas massas médias dos produtos NTA-metal e amb. Aperte Enter para ler as constantes de rotação 1D e 2D dos arquivos de modelagem. Selecione 0 para rotores dificultados, 1 para simetria de moléculas e 1 para degeneração de reação.
Então, insira "Sem Alterações". Para lidar com rotações 2D inativas, selecione as opções padrão para distribuição de momento angular estatístico e integre a distribuição P-E, G sobre J. Use o valor padrão de 32 no número de pontos na integração.
Para o menu Modelo, selecione Otimizar parâmetros para encaixar dados e digite a energia mínima e energia máxima para iniciar e terminar o ajuste de dados, respectivamente. Selecione 1 para os desvios padrão experimentais dos modelos de ponderação. Com base nos dados, selecione um desvio padrão mínimo aceitável de 0,01 a 0,001.
Use o valor padrão para o limite de convergência do E0 e selecione Não para manter qualquer parâmetro no valor atual, 0,5 e 2.0 elétronvolt para os limites inferiores e superiores e 2 para o método de avaliação de derivativos. No menu Otimização, selecione Iniciar Otimização. O programa CRUNCH otimizará o modelo TCID selecionado aos dados experimentais.
Por fim, no menu Modelo, selecione delta-H e S em T para a avaliação termoquímica dos dois canais de dissociação. A imagem representativa mostra as estruturas primárias dos peptídeos de ligação metálica alternativa A e H. A cor destaca os potenciais locais de ligação metálica.
A dependência energética para formar os íons de produtos amb-metal e NTA-metal é mostrada aqui. A energia de colisão em massa, onde há 50% de dissociação do complexo ternário amb-metal-NTA, está incluída nos gráficos. As imagens representativas mostram o modelo de dinâmica para o método TCID resolvido em energia.
As colisões entre o complexo ambH-zinco-NTA mais o argônio resultam na dissociação ao complexo ambH-zinco e produtos NTA-zinco livres, ou produtos ambH complexos e ambH livres de NTA. As energias limiares E1 e E2 equivalem aos 0 Kelvin enthalpies de dissociação para as reações complexo ambH-zinco-NTA ao complexo ambH-zinco e nta livre, ou complexo ambH-zinco-NTA ao complexo NTA-zinco e ambH livre, respectivamente. Os complexos ternários ternários amb-metal-NTA otimizados para geometria PM6 são mostrados aqui.
Esses conformadores foram utilizados na modelagem TCID dos dados experimentais e foram selecionados de outras estruturas candidatas comparando suas energias eletrônicas PM6 e como suas seções transversais de colisão calculadas em comparação com as seções transversais de colisão medida pelo IM-MS. O TCID resolvido com energia dos quatro complexos amb-metal-NTA é retratado nessas imagens. Para as espécies A e H, os íons do produto de amb-metal e NTA-metal com os ajustes de limiar CRUNCH complicados são mostrados aqui.
Os valores energéticos são os enthalpies de dissociação em 0 Kelvin para as reações amb-metal-NTA a amb-metal e NTA livre, ou amb-metaL-NTA para NTA-metal e amb livre. Uma comparação das energias livres de Gibbs de associação em kilojoules por toupeira e constantes de formação derivadas das inenthalpies de dissociação, líquido zero Kelvin, com cálculos de mecânica estatica usando os parâmetros PM6 são mostrados aqui. A reação do NTA-níquel e ambA livre para formar o complexo ambA-níquel-NTA exibe a maior constante de formação e representa a reação onde a proteína marcada ambA é imobilizada pelo NTA-níquel dentro da coluna de afinidade.
O encaixe CRUNCH requer uma triagem cuidadosa de reagentes e produtos para obter energias precisas de limiar. É necessária experiência em modelagem molecular para obter as estruturas e parâmetros moleculares confiáveis. Os métodos gerais descritos aqui poderiam ser desenvolvidos para triagem da eficácia de moléculas projetadas para ligar cofatores metálicos e locais ativos de proteínas para bloquear as funções enzimáticas.
