Modelos de transplante laríngeo foram descritos em camundongos e ratos. O trabalho anterior de Senior alter concentrou-se em conceber um método mais eficiente usando as artérias carótidas doadoras para anastomose, evitando a necessidade de dissecar as artérias tireoidianas superiores. Neste vídeo, descrevemos esse procedimento em camundongos.
Este modelo de transplante laríngeo de camundongos permite que estudos imunológicos sejam conduzidos com facilidade e baixo custo. Embora tecnicamente mais desafiador devido ao menor tamanho dos vasos em comparação com um modelo de rato, esse procedimento pode ser realizado em aproximadamente três horas se a familiaridade com as etapas cirúrgicas for obtida. Depois que o animal estiver totalmente anestesiado, transfira o camundongo para a área de barbear onde 1,5% de isoflurano com um litro por minuto de fluxo de oxigênio será entregue através de uma máscara facial para manutenção da anestesia.
Confirme a profundidade da anestesia com uma pitada no dedo do pé. Raspe o peito e o pescoço do rato até a linha da mandíbula e aplique o creme de depilação. E após 30 segundos, limpe o creme e transfira o mouse para a área cirúrgica.
Imobilize o rato e prepare a área cirúrgica três vezes com iodopovidona e álcool, em seguida, cubra o rato. Faça uma pequena incisão horizontal logo superior ao entalhe supraesternal. Usando uma tesoura fina, eleve a pele bilateralmente através dessa incisão até a mandíbula e excise um segmento de pele em forma de trapézio.
Excise as glândulas salivares bilaterais usando cauterização na parte superior, onde uma pequena veia que viaja através da glândula é visualizada. Dissecar os músculos esternocleidomastoideos bilaterais dos tecidos circundantes e retraí-los lateralmente. Faça uma incisão na linha média nos músculos da cinta e os extirpe bilateralmente, tomando cuidado para não danificar a glândula tireoide subjacente e deixando-a no complexo laringotraqueal esofágico ou LTE.
Após esta etapa, as artérias carótidas bilaterais são visíveis. Dissecar circunferencialmente as artérias carótidas comuns ao nível da clavícula inferiormente e ao nível da bifurcação carotídea superiormente. O nervo vago e a veia jugular interna são dissecados livres das artérias carótidas e não incluídos no enxerto adquirido.
Dissecar as artérias carótidas internas e externas o suficiente para poder ligar e dividir. Usando uma sutura de nylon 10-0, ligue as artérias carótidas internas dois a três milímetros superiores à bifurcação carotídea. Ligue as artérias carótidas externas pelo menos três milímetros acima do ponto de ramificação da artéria tireoidiana superior e ligue as artérias carótidas comuns ao nível do esterno.
Corte todos os vasos de ligação bilateralmente. Mantenha os pedículos vasculares no topo do complexo LTE para evitar danos acidentais durante a dissecção adicional. Para evitar qualquer vazamento de gás ou perda inadvertida de anestesia, certifique-se de que o animal expirou antes de fazer qualquer corte nas vias aéreas.
Transecte a traqueia abaixo do quinto anel traqueal e leve a incisão através do esôfago até a fáscia pré-vertebral para liberar o complexo LTE inferiormente. Liberte a traqueia e o esôfago da fáscia pré-vertebral subjacente de inferior para superior. Criar uma faringectomia anterior apenas inferior ao hioide.
Leve a incisão até a fáscia pré-vertebral para liberar o complexo LTE superiormente. Divida quaisquer anexos linfoides ou de tecido conjuntivo restantes entre o complexo LTE e o tecido circundante. E, finalmente, remova o enxerto.
Coloque o enxerto adquirido em uma placa de Petri estéril e lave com solução salina normal para se livrar de quaisquer coágulos sanguíneos. Dilatar as artérias carótidas bilaterais usando microdilatadores de um milímetro. Usando uma agulha de ponta contundente de calibre 30, injete aproximadamente dois mililitros de solução salina heparinizada em cada artéria carótida para lavar o enxerto.
Sangue e solução salina serão vistos saindo da artéria carótida contralateral e pequenas extremidades de vasos livres, o que confirma artérias tireoidianas superiores intactas. O enxerto pode ser deixado em solução salina heparinizada e uma pequena pausa pode ser feita por até três horas antes de transplantá-lo para o receptor. Prepare o camundongo receptor exatamente da mesma maneira descrita para o doador após as etapas de indução anestésica, barbear e preparação cirúrgica.
Injete o rato receptor com analgésico de libertação prolongada por via subcutânea 30 minutos antes do início da cirurgia. Usando um bisturi, faça uma incisão no pescoço da linha média que se estende da linha da mandíbula superiormente ao esterno inferiormente. Eleve a pele do lado esquerdo e recrai-a lateralmente.
Excise a glândula salivar esquerda cauterizando os vasos superiores como descrito anteriormente. Excise o tecido adiposo e linfoide dividindo quaisquer vasos visíveis com cauterização de baixa temperatura. Tomando cuidado para não danificar a veia jugular externa subjacente.
Dissecar a veia jugular externa circunferencialmente. Use pelo menos cinco milímetros de comprimento claro do vaso para anastomose. Dissecar o músculo esternomastóideo e retraí-lo lateralmente.
Dissecar circunferencialmente a artéria carótida comum da clavícula inferiormente até a bifurcação carotídea superiormente. Passe o material de fundo sob a veia jugular externa e aplique os grampos de aproximação dupla do vaso B-3. Coloque uma sutura de nylon 10-0 através da parede anterior da veia jugular externa no local da monotomia desejada e use a sutura para puxar anteriormente o vaso.
Corte apenas profundamente a sutura com micro tesouras para facilitar a criação da venotomia de fenda única de tamanho adequado e para garantir que o corte seja completamente através da parede venosa. Usando uma agulha de ponta contundente de calibre 30, lave o interior da veia com solução salina heparinizada. Coloque o complexo LTE do doador entre a artéria carótida esquerda receptora e a veia jugular externa esquerda.
Alinhar a extremidade livre da artéria carótida esquerda do doador em direção à veia jugular externa esquerda receptora e chanfrar a extremidade usando uma tesoura afiada. Usando quatro suturas interrompidas de nylon 10-0, anastomose a artéria carótida esquerda do doador e a veia jugular externa esquerda receptora de forma end-to-side. Deslize o material de fundo sob a artéria carótida comum receptora e aplique os grampos de aproximação dupla do vaso A-3.
Crie uma arteriotomia da mesma forma que a venotomia. Anastomose a artéria carótida direita doadora para a artéria carótida esquerda receptora de forma end-to-side. O uso de seis suturas interrompidas com nylon 10-0 é ideal para a anastomose arterial.
Remova os grampos no lado venoso. Se o sangramento for encontrado, aplique uma pressão suave com pontas de algodão. Remova os grampos na artéria e aplique imediatamente uma pressão suave com as pontas de algodão.
Algum sangramento é esperado na etapa, que geralmente pára após um minuto com pressão suave. Verifique a integridade do fluxo sanguíneo na artéria da veia. Com o fluxo arterial intacto, a pulsação da artéria carótida do doador é geralmente vista e a glândula tireoide do doador mudará de sua cor transparente corada de volta para sua cor avermelhada original.
A coloração vermelha dos pequenos vasos no complexo LTE também pode ser observada. Feche a incisão da pele com sutura de monofilamento 5-0 de forma corrida. Aplique um adesivo cutâneo na incisão.
Injete um mililitro de solução salina quente por via subcutânea para explicar a perda de líquido durante a cirurgia. Pare a anestesia e transfira o rato para uma gaiola de recuperação. Observe o mouse em uma almofada de aquecimento até que esteja totalmente acordado para evitar a hipotermia.
O sucesso cirúrgico pode ser avaliado imediatamente após a remoção dos grampos do vaso. A Figura A é representativa de uma cirurgia bem-sucedida porque o fluxo sanguíneo pode ser visualizado nas artérias carótidas da laringe doadora e nas glândulas tireoidianas ficaram vermelhas. A Figura B é representativa de uma cirurgia malsucedida, pois o fluxo sanguíneo não pode ser visualizado nas artérias carótidas da laringe doadora e as glândulas tireoidianas permaneceram pálidas.
Após 15 dias, na ausência de imunossupressão, a maioria dos receptores não tem fluxo sanguíneo para o transplante. A patência da artéria pode ser avaliada macroscopicamente dissecando o complexo laringotraqueal livre do tecido receptor circundante e visualizando a anastomose de ponta a ponta. Obrigado. Depois de assistir a este vídeo, você deve entender como transplantar heterotopicamente um complexo traqueoesofágico laríngeo de um rato para outro em aproximadamente três horas.
Este modelo viável e de custo relativamente baixo oferece um potencial significativo no estudo do papel do sistema imunológico na rejeição do complexo laringotraqueal, oferecendo assim o potencial para novas terapias no transplante de órgãos.
