Gostaríamos de agradecer as nossas fontes de financiamento: O Instituto da Califórnia de Medicina Regenerativa Clinical Fellow Training Grant (AN), National Science Foundation (MW), Irene Award Perstein (TCM), American College of Surgeons (TCM), Associação Americana de Pediatria Cirúrgica ( TCM), e da March of Dimes (TCM).

1. Preparação de Pipetas Injection <ol><li> Calibrar o puxador de uma pipeta de tal forma que a separação da pipeta de vidro ocorre dentro de 15 segundos (veja as instruções do fabricante em relação à calibração). A pipeta terá um cone, onde se separa. </li><li> Corte a extremidade da pipeta de modo que a distância do início do cone até o fim da pipeta é 1,04 centímetros a 1,05 centímetros. O comprimento da pipeta é inversamente proporcional ao calibre do orifício da pipeta. Estar ciente de que fazer um longo pipeta também resulta em uma menor dica que é mais suscetível à quebra durante a injecção. </li><li> O próximo passo para tornar a pipeta é criar um chanfro lisa afiando a ponta em uma roda de diamante nitidez. No momento de cortar a pipeta para o tamanho apropriado, a pipeta, muitas vezes rompe com um chanfro natural em sua ponta que deve ser usado quando colocar a pipeta na roda. Durante este processo, é importante suavemente o resto da pipeta na roda de afiar e reavaliar periodicamente para certificar-se da pipeta ainda está tocando a roda (como o bisel se torna mais suave, ele vai perder o contato com a roda de afiar). </li><li> Uma vez que o bisel é lisa, a ponta da pipeta deve ser afiada (Figura 1). Elevar a pipeta de tal forma que já não é tocar na roda de amolar, girar no sentido horário por 10-50 graus, e coloque a pipeta de volta na roda girando nitidez ~ 10 segundos. Retirar a pipeta da roda de afiar e agora examinar a borda. Esta etapa geralmente precisa ser repetido com vários pequenos ajustes para criar uma borda afiada. Se a pipeta é colocada em sua borda por muito tempo, é mais propensos a desenvolver uma superfície irregular (Figura 1). Depois de completar um lado, você pode prosseguir para aguçar a extremidade oposta, repetindo os passos acima. </li><li> Use um marcador permanente para desenhar uma linha circunferencial cada quatro milímetros de partida onde o cone da pipeta começa. Estes correspondem a demarcações 5uL de volume. </li></ol> 2. Utero em Transplantes <ol><li> Depois de preparar o material injetável (por exemplo, células, vírus, etc) você pode configurar para a injecção. Nós usamos um microinjetor ligado a ar comprimido com as seguintes configurações: (ajustes de pressão: entrada de 60-80 psi, encha 40 psi, injetar 8-12 psi, psi equilíbrio 0, sem soltar, 0 psi, o tempo de injeção de 100 milissegundos). </li><li> Para esterilizar a pipeta de injeção, limpe-o duas vezes com etanol 70% seguido por duas vezes com PBS 1X estéril. Como a ponta da pipeta é muito frágil, não recomendamos autoclavagem as pipetas de injeção. </li><li> Injeções pode ser feito usando lupas 2.5X-3.5X ampliação ou um microscópio de dissecação. Prepare sua área de procedimento com uma manta de aquecimento, iluminação e instrumentos cirúrgicos necessários. </li><li> Anestesiar o rato grávidas (nós utilizamos isoflurano e oxigênio fornecido através de uma unidade de fluxo contínuo anestesia). Posicione o mouse sobre uma almofada de aquecimento na posição supina e apor cada membro com fita adesiva para prender o mouse no lugar. </li><li> Clipe da pele. Então, usando luvas cirúrgicas estéreis, preparação do abdômen, com 10% iodopovidona seguido pelo álcool, e injetar um analgésico tais como buprenorfina. </li><li> Faça uma incisão um centímetro na parte inferior do abdômen (o aspecto mais inferior da incisão deve ser de aproximadamente 1 centímetro superior ao intróito). Inciso da pele e da fáscia. Tenha cuidado para não ferir os órgãos abdominais (intestino e bexiga) que são imediatamente sob a fina camada de fáscia. </li><li> Usando cotonetes, delicadamente esticar a fascia e entregar o útero grávido através da incisão. Contar o número total de fetos pelo primeiro identificar os ovários direito e esquerdo para se certificar de que você visualize todo o útero. Coloque o útero de volta na cavidade abdominal antes de prosseguir para que os fetos permanecem quente, enquanto você se prepara para as injeções. </li><li> Elaborar o volume apropriado de material para o número de fetos planeia administrar a injecção. Enquanto enche a agulha com a sua amostra, é importante para manter a ponta da pipeta submersa para evitar a aspiração a sua amostra no tubo microinjetor. Como as células são geralmente em um pequeno volume, que geralmente colocam em uma pequena de microcentrífuga (ex: 0,5 ml) de tubo ou diretamente em um pedaço de Parafilm para ser capaz de preencher a agulha sem quebrar a ponta da pipeta. </li><li> Pressione cuidadosamente cada feto e identificar a parte do feto que você plano para injetar (fígado, por exemplo, a cavidade peritoneal, perna, etc). Com o polegar eo indicador, é necessário estabilizar o feto dentro da cavidade amniótica para que ela não gira enquanto você estiver realizando a injeção. É importante para manter o feto com firmeza suficiente para estabilizá-lo ainda suavemente o suficiente para evitar danificá-lo. </li><li> Insira cuidadosamente a pipeta através do útero, âmnio e da pele fetal, e para o órgão-alvo. Se a pipeta é afiada, ele deve passar facilmente através destes tecidos. Se a ponta da pipeta é maçante, você wi<html> ll tenting aviso do útero e da membrana amniótica. Injetar o volume desejado em cada feto. É imperativo que os seus movimentos ser estável durante o tempo de inserção, de injeção e retirada da pipeta. </li><li> Uma vez que o volume desejado é injetado, retirar a pipeta com cuidado. Se feito corretamente, material não deve vazar para fora da cavidade amniótica ou útero. Se um grande buraco é criado no âmnio, o que pode-se reconhecer por vazamento de líquido amniótico, em seguida, a sobrevivência está comprometida. Finalmente, para os estudos que envolvem a colheita pós-natal, todos os fetos devem receber injeções tecnicamente perfeito, pois não existe maneira de discernir fetos injetado e uninjected após o nascimento. </li><li> Se você estiver executando injeções no fígado fetal, você pode ocasionalmente ver o sangue na ponta da pipeta, após sua retirada, isto confirma que está na posição correta e não deve afetar a sobrevivência. Se executar injeção intra-peritoneal, o objectivo ligeiramente abaixo do fígado fetal. Para injeções intramusculares, você pode posicionar o feto para identificar o quadril e fêmur e injetar no músculo glúteo. Finalmente, para injeções intraventricular, é fácil ver as suturas coronal para dirigir a pipeta para o destino apropriado. Para estas injecções, pipetas calibre um pouco maior são obrigados a penetrar o crânio, sem quebrar a pipeta. </li><li> Em seguida, coloque cuidadosamente o útero de volta para a cavidade abdominal. Certifique-se que não está torcido sobre si mesmo ou ao redor de seu suprimento vascular. Entregar 1mL de 1X PBS estéril na cavidade peritoneal da mãe para substituir todo o líquido que foi perdido durante o procedimento. Fechar a incisão em 2 camadas com uma sutura absorvível trançado 5-0 (ex: Vicryl). Primeiro fechar a fáscia sem ferir o intestino ou bexiga subjacente, e em seguida, fechar a pele. </li><li> Neste momento, pós-procedimento medicamentos podem ser administrados para analgesia. Retorno cada fêmea injetado para sua própria gaiola individual e colocar a gaiola em um cobertor de aquecimento. Monitorar o mouse até que ele é reto. Coloque cama na gaiola e coloque o mouse em uma área tranquila da instalação do mouse onde não deve ser perturbado (ou seja, sem a limpeza da gaiola) até vários dias após o parto. Minimizando qualquer estresse adicional para o animal irá diminuir as chances de parto prematuro. </li><li> Depois de ter concluído as injeções, limpar a sua pipeta estéril por duas vezes com 1X PBS e uma vez com EtOH 70%. </li><li> Fêmeas injetadas devem ser observados diariamente para garantir que elas estão se recuperando do procedimento sem dificuldade. A incisão deve ser monitorada para o inchaço, inflamação sinais, a separação da ferida, e outros de infecção. Pós-operatório de analgésicos pode ser administrada, conforme necessário. </li></ol> 3. Resultados representativos: Sobrevivência dos fetos injetado para entrega do termo é o principal fator limitante para alcançar o sucesso com esta técnica. Dependendo do material e injetado a cepa de rato a ser utilizado, as taxas de sobrevivência pode variar. Em geral, as injeções de células hematopoiéticas em camundongos selvagens no E14 deve resultar em pelo menos 50% nascidos vivos filhotes. Maiores taxas de sobrevivência são possíveis, dependendo tanto os aspectos técnicos da injeção, bem como as características dos ratos sendo injetado. Minimização do trauma no útero e as membranas amnióticas é o aspecto técnico mais importante deste protocolo. Sharp, pipetas de pequeno calibre irá resultar em trauma uterino mínimos durante a injeção. Nós não recomendamos o uso de agulhas de injeção padrão, como o calibre das agulhas pré-fabricadas é muito grande e que resultaria em um grande buraco no útero. Pipetas de injeção mão crafted vidro são os únicos agulhas de pequeno calibre que podem ser utilizados no injeções intra-útero. Cuidadosa e meticulosa técnica cirúrgica, incluindo a manipulação delicada do útero e uma anestesia curta é também crucial para melhores resultados. Características específicas dos ratos destinatário, como a herança genética, idade gestacional, e tamanho da ninhada também pode afetar a sobrevivência. Certas cepas de camundongos são mais suscetíveis ao trabalho de parto prematuro e perda de gravidez dependendo da sua formação genética. 15 animais transgênicos com defeitos musculares ou neurodegenerativas podem ter uma diminuição da capacidade de entregar os fetos na vagina depois de submetidos a uma laparotomia mediana. 8 Essas fêmeas grávidas pode pedir a entrega por cesariana. Temos também descobriram que a idade gestacional no momento da injeção pode impactar sua viabilidade. Fetos que têm menos de 12 dias embrionárias têm menores taxas de sobrevivência do que os fetos mais velhos. Finalmente, descobrimos que tamanho das ninhadas grandes (&gt; 10 fetos) tendem a ter maiores taxas de morte fetal após a injeção. Atenção para os aspectos técnicos desta técnica e as características específicas dos ratos sendo injetado pode maximizar a sobrevivência dos fetos injetado. ve_content &quot;&gt; Quando esses métodos são executados corretamente, pode-se esperar que todos os fetos são expostos ao material injetado. Similar à configuração pós-natal, no entanto, a entrega bem sucedida de células ou vírus no útero nem sempre resulta em enxerto de doadores de células ou de genes expressão, respectivamente. enxerto de células-tronco, por exemplo, é dependente de vários factores, tais como a dose e origem das células transplantadas. Da mesma forma, o sucesso de transdução viral é, em parte, determinada pelo tipo do vetor viral utilizado. é preciso entender os inúmeros fatores que a sobrevivência das crias impacto, o enxerto celular e transdução viral para alcançar o sucesso com este protocolo. <img src="/files/ftp_upload/2303/2303fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Diagrama mostrando boa nitidez das pipetas de injeção (Passo 1.4)

<ol>
	<li>Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+in+utero+transplantation+of+paternal+bone+marrow.">Treatment of X-linked severe combined immunodeficiency by in utero transplantation of paternal bone marrow.</a> N Engl J Med. 335, 1806-1810 (1996).</li><li>Wengler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-utero+transplantation+of+parental+CD34+haematopoietic+progenitor+cells+in+a+patient+with+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+(SCIDXI).">In-utero transplantation of parental CD34 haematopoietic progenitor cells in a patient with X-linked severe combined immunodeficiency (SCIDXI).</a> Lancet. 348, 1484-1487 (1996).</li><li>Flake, A. W., Zanjani, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+utero+hematopoietic+stem+cell+transplantation:+ontogenic+opportunities+and+biologic+barriers.">in utero hematopoietic stem cell transplantation: ontogenic opportunities and biologic barriers.</a> Blood. 94, 2179-2191 (1999).</li><li>Merianos, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+alloantibodies+induce+a+postnatal+immune+response+that+limits+engraftment+following+in+utero+hematopoietic+cell+transplantation+in+mice.">Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice.</a> J Clin Invest. 119, 2590-2600 (2009).</li><li>Peranteau, W. H., Endo, M., Adibe, O. O., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+immune+barrier+after+in+utero+hematopoietic-cell+transplantation.">Evidence for an immune barrier after in utero hematopoietic-cell transplantation.</a> Blood. 109, 1331-1333 (2007).</li><li>Kim, H. B., Shaaban, A. F., Yang, E. Y., Liechty, K. W., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchimerism+and+tolerance+after+in+utero+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Microchimerism and tolerance after in utero bone marrow transplantation in mice.</a> J Surg Res. 77, 1-5 (1998).</li><li>Durkin, E. T., Jones, K. A., Rajesh, D., Shaaban, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+chimerism+threshold+predicts+sustained+engraftment+and+NK-cell+tolerance+in+prenatal+allogeneic+chimeras.">Early chimerism threshold predicts sustained engraftment and NK-cell tolerance in prenatal allogeneic chimeras.</a> Blood. 112, 5245-5253 (2008).</li><li>Mackenzie, T. C., Shaaban, A. F., Radu, A., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+of+bone+marrow+and+fetal+liver+cells+after+in+utero+transplantation+in+MDX+mice.">Engraftment of bone marrow and fetal liver cells after in utero transplantation in MDX mice.</a> J Pediatr Surg. 37, 1058-1064 (2002).</li><li>Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+chimerism+following+in+utero+hematopoietic+stem+cell+transplantation+in+murine+models+of+hemoglobinopathy.">Mixed chimerism following in utero hematopoietic stem cell transplantation in murine models of hemoglobinopathy.</a> Exp Hematol. 31, 176-184 (2003).</li><li>Bouchard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+transgene+expression+in+cardiac+and+skeletal+muscle+following+fetal+administration+of+adenoviral+or+adeno-associated+viral+vectors+in+mice.">Long-term transgene expression in cardiac and skeletal muscle following fetal administration of adenoviral or adeno-associated viral vectors in mice.</a> J Gene Med. 5, 941-950 (2003).</li><li>Meza, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+pyruvate+kinase+deficiency+in+mice+by+gene+therapy+using+the+human+isoenzyme.">Rescue of pyruvate kinase deficiency in mice by gene therapy using the human isoenzyme.</a> Mol Ther. 17, 2000-2009 (2009).</li><li>MacKenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+liver+and+muscle+after+in+utero+injection+of+lentiviral+vectors+with+different+pseudotypes.">Efficient transduction of liver and muscle after in utero injection of lentiviral vectors with different pseudotypes.</a> Mol Ther. 6, 349-358 (2002).</li><li>MacKenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+satellite+cells+after+prenatal+intramuscular+administration+of+lentiviral+vectors.">Transduction of satellite cells after prenatal intramuscular administration of lentiviral vectors.</a> J Gene Med. 7, 50-58 (2005).</li><li>Sabatino, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+expression+of+hF.IX+After+tolerance+induction+by+in+utero+or+neonatal+administration+of+AAV-1-F.IX+in+hemophilia+B+mice.">Persistent expression of hF.IX After tolerance induction by in utero or neonatal administration of AAV-1-F.IX in hemophilia B mice.</a> Mol Ther. 15, 1677-1685 (2007).</li><li>Mellor, A. L., Munn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+at+the+maternal-fetal+interface:+lessons+for+T+cell+tolerance+and+suppression.">Immunology at the maternal-fetal interface: lessons for T cell tolerance and suppression.</a> Annu Rev Immunol. 18, 367-391 (2000).</li><li>Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actively+acquired+tolerance+of+foreign+cells.">Actively acquired tolerance of foreign cells.</a> Nature. 172, 603-606 (1953).</li><li>Endo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+to+ocular+stem+cells+by+early+gestational+intraamniotic+injection+of+lentiviral+vector.">Gene transfer to ocular stem cells by early gestational intraamniotic injection of lentiviral vector.</a> Mol Ther. 15, 579-587 (2007).</li><li>Waddington, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+transgene+expression+by+administration+of+a+lentivirus-based+vector+to+the+fetal+circulation+of+immuno-competent+mice.">Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice.</a> Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).</li><li>Schachtner, S., Buck, C., Bergelson, J., Baldwin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+regulated+expression+patterns+following+in+utero+adenovirus-mediated+gene+transfer.">Temporally regulated expression patterns following in utero adenovirus-mediated gene transfer.</a> Gene Ther. 6, 1249-1257 (1999).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Mais de 50 anos, Billingham, Brent e Medawar utilizado no útero transplante em camundongos para induzir tolerância imunológica a proteínas estranhas. 16 Desde esse tempo, diversas variações desta técnica têm sido usadas para tratar de questões na área de imunologia e biologia de células-tronco. O protocolo detalhado aqui é um dos métodos mais acessíveis para IUT. O fígado fetal oferece um alvo fácil visualização e fornece acesso para a circulação sist?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kimble</td>
<td>71900-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments Company</td>
<td>Model P-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige</td>
<td>IM-300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette sharpener</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments Company</td>
<td>Model BV-10</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a mouse model of in utero transplantation

O transplante de células-tronco e vírus no útero tem um tremendo potencial para o tratamento de doenças congênitas no feto humano. Por exemplo, no útero transplante (IUT) de células-tronco hematopoiéticas tem sido usada com sucesso para tratar pacientes com imunodeficiência combinada grave 1,2. Em outras condições, no entanto, IUT foi tentada sem sucesso. 3 Tendo em conta estes resultados mistos, a disponibilidade de um modelo não-humano eficiente para estudar as seqüelas biológicas do transplante de células-tronco e terapia genética é crítico para avançar nesse campo. Nós e outros autores utilizaram o modelo do rato de IUT para estudar os fatores que afetam o enxerto de sucesso no útero transplantado células-tronco hematopoéticas em ambos os camundongos selvagens 4-7 e aqueles com doenças genéticas. 8,9 O ambiente fetal também oferece vantagens consideráveis ​​para o sucesso da terapia genética no útero. Por exemplo, a entrega de 10 adenoviral, adeno-associado viral 10, retroviral 11, e lentivirais 12,13 para o feto, resultou na transdução de múltiplos órgãos distantes do local da injeção de longo prazo da expressão gênica. In utero terapia genética pode ser considerada como uma estratégia possível tratamento para distúrbios de um único gene como a distrofia muscular ea fibrose cística. Outra vantagem potencial do IUT é a capacidade de induzir tolerância imunológica a um antígeno específico. Como pode ser visto em camundongos com hemofilia, a introdução do Fator IX no início de resultados de desenvolvimento da tolerância a essa proteína. 14 Além de seu uso em terapias investigando o potencial humano, o modelo do rato de IUT pode ser uma ferramenta poderosa para estudar questões básicas em biologia celular e de desenvolvimento tronco. Por exemplo, pode-se oferecer várias pequenas moléculas para induzir ou inibir a expressão de genes específicos em estágios definidos gestacional e manipular as vias de desenvolvimento. O impacto dessas alterações pode ser avaliada em vários pontos temporais após o transplante inicial. Além disso, pode-se transplante pluripotentes ou linhagem específica de células progenitoras no ambiente fetal para estudar a diferenciação de células-tronco em um ambiente de acolhimento não irradiados e imperturbável. O modelo do rato de IUT já proporcionou inúmeros conhecimentos nas áreas de imunologia, biologia celular e de desenvolvimento e tronco. Neste protocolo baseado em vídeo, descrevemos uma abordagem passo-a-passo para realização de IUT em fetos de rato e delinear as etapas críticas e armadilhas potencial desta técnica.

Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model of in Utero Transplantation at JoVE.com

A Mouse Model of in Utero Transplantation

O modelo do rato de<em&gt; In utero</em&gt; O transplante é uma ferramenta versátil que pode ser usado para estudar as possíveis aplicações clínicas do transplante de células-tronco e terapia genética no feto. Neste protocolo, apresentamos uma abordagem geral para realizar esta técnica

Um modelo do rato de No Utero Transplante

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

a-mouse-model-of-in-utero-transplantation

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of in Utero Transplantation

19.3K visualizações.  University of California. O modelo do rato de In utero O transplante é uma ferramenta versátil que pode ser usado para estudar as possíveis aplicações clínicas do transplante de células-tronco e terapia genética no feto. Neste protocolo, apresentamos uma abordagem geral para realizar esta técnica

Vídeo: A Mouse Model of in Utero Transplantation

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed results. However, the cellular and molecular mechanisms of the neotissue development, valve thickening, and stenosis development are not researched extensively. To answer the above questions, we developed a murine heterotopic heart valve transplantation model. A heart valve was harvested from a valve donor mouse and transplanted to a heart donor mouse. The heart with a new valve was transplanted heterotopically to a recipient mouse. The transplanted heart showed its own heartbeat, independent of the recipient&#8217;s heartbeat. The blood flow was quantified using a high frequency ultrasound system with a pulsed wave Doppler. The flow through the implanted pulmonary valve showed forward flow with minimal regurgitation and the peak flow was close to 100 mm/sec. This murine model of heart valve transplantation is highly versatile, so it can be modified and adapted to provide different hemodynamic environments and/or can be used with various transgenic mice to study neotissue development in a tissue engineered heart valve.

In order to understand the cellular and molecular mechanisms underlying neotissue formation and stenosis development in tissue engineered heart valves, a murine model of heterotopic heart valve transplantation was developed. A pulmonary heart valve was transplanted to recipient using the heterotopic heart transplantation technique.

O transplante de válvula pulmonar Usando um modelo do rato de Heterotópica Transplante de Coração

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

Medicina

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each year. While several animal models exist for this procedure and mice are the species that is most commonly used. The reasons for using mice are the relative cost of using this species, the existence of many genetically defined strains that allow for the study of immune responses, and the existence of an extensive array of reagents that can be used to further define responses in this species. This model has been used to define factors in the cornea that are responsible for the relative immune privilege status of this tissue that enables corneal allografts to survive acute rejection in the absence of immunosuppressive therapy. It has also been used to define those factors that are most important in rejection of such allografts. Consequently, much of what we know concerning mechanisms of both corneal allograft acceptance and rejection are due to studies using a murine model of corneal transplantation. In addition to describing a model for acute corneal allograft rejection, we also present for the first time a model of late-term corneal allograft rejection.

Mice have been used as a model for studying many forms of transplantation, including corneal transplantation. We describe in this report a murine model for both acute and late-term corneal transplantation.

Murino transplante de córnea: Um modelo para estudar a forma mais comum de Transplante de Órgãos Sólidos

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.

We describe an ovarian fad pad transplantation assay suitable for studies of normal and transformed epithelia of the female reproductive tract. The mouse fat pad allows transplantation of large tissue fragments, is easily accessible for surgery and imaging, and provides the most favorable native environment for tissues of M&#252;llerian origin.

Transplantação no Pad Mouse ovário Fat

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic ...

Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the aorta in mice using the sleeve method was short and easy averaging 20 min, permitting studies of iso/allo grafts. The following article describes the aortic transplantation procedure used in our laboratory. The mice were anesthetized with a mixture of 1.5% volume isoflurane and 100% oxygen through a face mask. At this point, the segment of the aorta between the renal arteries and its bifurcation was separated from the vena cava, freely prepared and clampedat the proximal and distal segments with a single silk suture. Prior to the removal of the aorta, a saline solution containing heparin was injected into the inferior vena cava. Then the aorta was cut between the clamps and a saline heparin solution was used to flush the lumen. The sleeve technique with monofilament sutures was used in order to transplant the abdominal aorta in the orthotopic position.

We present an orthotopic aortic transplantation model using the sleeve technique in mice. It is a very rapid anastomosis method, which can be employed in studies of vascular disease.

Usando a técnica de manga em um modelo do rato da transplantação da aorta - um vídeo instrutivo

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the ...

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the availability of the widest range of molecular probes and reagents to perform in vivo as well as in vitro studies. Based on our experience with various murine transplantation models, we developed a heterotopic pancreas transplantation model in mice with the intent to analyze mechanisms underlying severe ischemia reperfusion injury-associated early graft damage. In contrast to previously described techniques using suture techniques, herein we describe a new procedure using a non-suture cuff technique. 
In recent years, we have performed more than 300 pancreas transplantations in mice with an overall success rate of &gt;90%, a success rate never described before in mouse pancreas transplantation. The backbone of this non-suture cuff technique for graft revascularization consists of two major steps: (I) pulling the recipient vessel over a polyethylene/polyamide cuff and fixing it with a circumferential ligature, and (II) placing the donor vessel over the everted recipient vessel and fixing it with a second circumferential ligature. The resultant continuity of the endothelial layer results in less thrombogenic lesions with high patency rates and, finally, high success rates.
In this model, arterial anastomosis is achieved by pulling the abdominal aorta of the donor graft over the everted common carotid artery of the recipient animal. Venous drainage of the graft is achieved by pulling the portal vein of the graft over the everted external jugular vein of the recipient. This manuscript provides details and crucial steps of the organ recovery and organ implantation procedures, which will allow researchers with microsurgical skills to perform the transplantation successfully in their laboratories.

Among abdominal solid organ transplantation, pancreatic grafts are prone to develop severe ischemia reperfusion injury-associated graft damage, leading eventually to early graft loss. This protocol describes a model of murine pancreas transplantation using a non-suture cuff technique, ideally suited for analyzing these early, deleterious damages.

Modelo do rato para transplante de pâncreas, usando uma técnica modificada do manguito

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions between cellular and non-cellular blood components during thrombus formation, reliable studies of the physiology and pathophysiology of thrombosis can only be performed in vivo. Therefore, this article presents an ear model in hairless mice and focuses on the in vivo analysis of microcirculation, thrombus formation, and thrombus evolution. By using intravital fluorescence microscopy and the intravenous (iv) application of the respective fluorescent dyes, a repetitive analysis of microcirculation in the auricle can easily be performed, without the need for surgical preparation. Furthermore, this model can be adapted for in vivo studies of different issues, including wound healing, reperfusion injury, or angiogenesis. In summary, the ear of hairless mice is an ideal model for the in vivo study of skin microcirculation in physiological or pathophysiological conditions and for the evaluation of its reaction to different systemic or topical treatments.

The ear model of the hairless SKH1-Hrhr mouse enables intravital fluorescence microscopy of microcirculation and phototoxic thrombus induction without prior surgical preparation in the examined microvascular bed. Therefore, the ear of the hairless mouse is an excellent in vivo model to study the complex interactions during microvascular thrombus formation, thrombus evolution, and thrombolysis.

Intravital Microscopia e trombo Indução no lóbulo da orelha de um rato calvo

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

Cardiopulmonary Bypass in a Mouse Model: A Novel Approach

As prolonged cardiopulmonary bypass becomes more essential during cardiac interventions, an increasing clinical demand arises for procedure optimization and for minimizing organ damage resulting from prolonged extracorporal circulation. The goal of this paper was to demonstrate a fully functional and clinically relevant model of cardiopulmonary bypass in a mouse. We report on the device design, perfusion circuit optimization, and microsurgical techniques. This model is an acute model, which is not compatible with survival due to the need for multiple blood drawings. Because of the range of tools available for mice (e.g., markers, knockouts, etc.), this model will facilitate investigation into the molecular mechanisms of organ damage and the effect of cardiopulmonary bypass in relation to other comorbidities.

This paper describes how to perform cardiopulmonary bypass in mice. This novel model will facilitate the investigation of the molecular mechanisms involved in organ damage.

Bypass cardiopulmonar em um modelo do rato: uma nova abordagem

As prolonged cardiopulmonary bypass becomes more essential during cardiac interventions, an increasing clinical demand arises for procedure optimization ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

Intraportal transplante de ilhotas pancreáticas no modelo de Mouse

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Veno-Venous Extracorporeal Membrane Oxygenation in a Mouse

The use of extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) has increased substantially in recent years. ECMO has become a reliable and effective therapy for acute as well as end-stage lung diseases. With the increase in clinical demand and prolonged use of ECMO, procedural optimization and prevention of multi-organ damage are of critical importance. The aim of this protocol is to present a detailed technique of veno-venous ECMO in a non-intubated, spontaneously breathing mouse. This protocol demonstrates the technical design of the ECMO and surgical steps. This murine ECMO model will facilitate the study of pathophysiology related to ECMO (e.g., inflammation,bleeding and thromboembolic events). Due to the abundance of genetically modified mice, the molecular mechanisms involved in ECMO-related complications can also be dissected.

Here we present a protocol describing the technique of veno-venous extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) in a non-intubated, spontaneously breathing mouse. This murine model of ECMO can be effectively implemented in experimental studies of acute and end-stage lung diseases.

Oxigenação de membrana extracorpórea veno-venosa em um rato

The use of extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) has increased substantially in recent years. ECMO has become a reliable and effective therapy for ...