Agradecemos Geoff Daniels para assistência técnica. Este trabalho foi financiado por R01 AI067946 para JSO

1. Lamelas Brasão com anticorpo <ol><li> Pré-aquecer (a 37 ° C) de 30 ml de RPMI 10% de meio FCS e 1 ml de BD Cytofix / Cytoperm. </li><li> Prepara-se uma solução de 5 ng / ml de anticorpo purificado em tampão fosfato salino (PBS). Para a activação da linha de células NK92, uso de anti-CD18 e anti-NKp30 é recomendada. <ol><li> Mark um círculo de aproximadamente centavo porte para cada condição em uma lamela # 1.5 usando uma caneta PAP. Para uma experiência de duas cores, deve haver quatro condições: sem mácula, dupla manchadas, e duas individuais condições manchadas. Dispensar a 200 ul de solução de anticorpo em cada região e incubar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Lavar as lamelas imergindo suavemente cada um em 50 ml de PBS num tubo de 50 ml à temperatura ambiente. Lavagem deve ocorrer imediatamente antes da adição de células deve ser tomado cuidado para evitar e secagem anticorpo na lamela. </li></ol></li></ol> 2. Ativar as células NK em Tampadeslizamentos; Fix e permeabilizar <ol><li> Isolar 5 x 10 5 NK92 células por condição. Centrífuga e decantar o sobrenadante. Lavar uma vez com 10 ml de meio pré-aquecida do passo 1.1. Centrífuga e decantar o sobrenadante. <ol><li> Ressuspender as células em meio de pré-aquecida do passo 1.1, a uma concentração de 2,5 x 10 6 / ml. </li><li> Suavemente decantar 200 ul para o centro da região criada na secção 1.2.1. Incubar a 37 ° C durante 20 min a 5% de CO 2. (Nota: este tempo pode ser estendido ou reduzido, dependendo da função biológica de interesse para NK grânulo célula de polarização, 20 min é suficiente.). </li></ol></li><li> Após a incubação de células, lavar cuidadosamente lamelas imergindo cada em 50 ml de PBS à temperatura ambiente, em um tubo de 50 ml. </li><li> Adicionar 1 ml de Triton X-100 a 1 ml de solução de pré-aquecida Fix / Perm do passo 1.1 e vórtice completamente. Fix e permeabilizar através da adição de 200 ul de tampão Fix / Perm (passo 2.3) para as células. Incubar por 10 mem no escuro à temperatura ambiente. </li></ol> 3. Células Stain <ol><li> Preparar tampão de coloração: Solução tampão de fosfato (PBS), 1% de BSA, 0,1% de saponina. <ol><li> Preparar uma solução de anticorpo primário em 200 ul tampão de coloração (veja o passo 3.1). (Nota: o anticorpo deve ser titulada antes de usar). Evite o uso de anticorpo primário que é gerado nas mesmas espécies utilizadas para revestir a lamela (passo 1.2). Além disso, evite ligações Strepatividin com biotina para STED imagem. </li><li> Após a seção 2.3.1, lavar cuidadosamente lamelas em 50 ml de coloração buffer. Umedeça as bordas da região PAP-caneta com cotonete para remover o excesso de buffer. Aplicar a solução anticorpo criado na seção 3.1.1. Incubar 30 min no escuro à temperatura ambiente. (Recomendado: incubar lamelas na caixa de slides com uma toalha de papel úmido para manter a umidade). </li></ol></li><li> Preparar a solução de anticorpo secundário 200 ul coloraçãotampão. Fluoróforos recomendados são Alexa Fluor 488, Pacific Laranja, e V500. Geralmente, uma diluição 1:200 é adequado para STED imagiologia. <ol><li> Delicadamente, lave lamelas em 50 ml de coloração buffer. Umedeça as bordas da região PAP-caneta com cotonete para remover o excesso de buffer. Aplicar a solução de anticorpo secundário. Incubar 30 min no escuro à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Repita a lavagem e coloração para proteínas adicionais de interesse. Se a detecção de F-actina com faloidina, este pode ser incluído com o anticorpo secundário, em geral, a uma diluição de 1:200. </li></ol> 4. Monte Lamelas em Slides <ol><li> Prepare meio de montagem. Nota: Prolong ou prolongar Ouro são preferíveis. Vectashield deve ser evitada, uma vez que não é compatível com STED. 2,2-thiodioethanol deve ser evitada se for utilizado faloidina. Mowiol é aceitável. </li><li> Coloque cerca de 10-20 mL de meio de montagem em um slide. Lamela Invert (célula de cabeça para baixo) e montar lamela suavemente, tomando cuidado paraevitar a introdução de bolhas de ar. Incubar as lâminas durante 24 horas (lamela up) antes da imagem. </li><li> Selar bordas da lamela com unha polonês. </li></ol> 5. Instalação Experimental <ol><li> Iniciado lasers e software necessários. Iniciado STED a laser esgotamento a 100% de potência. Alinhar STED laser, que no caso de sistemas comerciais é geralmente um procedimento automatizado. </li><li> Concentre-se a amostra, começando com controle manchado único, no microscópio usando oculares. </li></ol> 6. Otimização das configurações <ol><li> Faça a leitura do primeiro canal e otimizar a potência do laser, a posição de feixe de excitação e variedade detector. Se possível, evitar um ganho de&gt; 100. Capturar a imagem em confocal para otimizar as configurações. Linha e / ou quadro de média irá aumentar a resolução. Verifique se há saturação pixel. Nota: Alguns saturação é aceitável em confocal como aplicação de STED irá reduzir a intensidade de emissão. Para STED, um tamanho ideal pixel será inferior a 30 nm comocada vez melhor resolução será obtida com tamanhos de pixel menores. O tamanho da região de interesse a ser trabalhada ditará o limite inferior do tamanho do pixel. Tamanhos de pixel menores podem aumentar a fotodegradação. <ol><li> Aplicar imagem de captura STED feixe de exaustão e, começando com 50% de esgotamento de energia laser. Se uma melhoria na resolução é visto, mais potência do laser depleção pode ser aplicado. Nesta fase, pode ser necessário ajustar a potência de excitação de laser, linha média, e / ou de ganho. </li><li> Aplicar gating tempo para reduzir o fundo (no mínimo 0,3 ns). Ajuste as configurações até que uma melhoria na resolução sobre confocal pode ser visto. A resolução pode ser aproximada por estimativa completa metade de largura máxima (FWHM). Isto representa a distância na metade de máxima intensidade de um pico de Gauss criado pelo desenho de um perfil de linha ao longo da estrutura de interesse, e é um método amplamente utilizado para estimar resolução. </li><li> Uma vez que o primeiro canal é satisfatória, iniciar uma segunda sequência para siciais de digitalização. Em geral, é melhor para digitalizar o fluoróforo de comprimento de onda mais longo em primeiro lugar. Repita o passo 6.1 em segundo canal. </li></ol></li><li> Confirme falta de sobreposição espectral pela imagem controles manchadas único com as duas seqüências de digitalização. Sobreposição espectral suave pode ser corrigido utilizando recursos de mixagem un espectrais no software, no entanto, deve ser evitado sempre que possível. </li></ol> 7. Aquisição de Imagem <ol><li> Adquirir imagens. No caso da imagiologia quantitativa, recomenda-se obter, pelo menos, 20 imagens / condição. O número exato, no entanto, deve ser definida de acordo com a questão experimental em conjunto com uma abordagem estatística, tais como o cálculo do tamanho da amostra. Salve experimento. </li></ol> 8. Deconvolution <ol><li> Abra o arquivo com o software de deconvolução ou processador de lote. Verifique os parâmetros de cada canal usando software. Confirme excitação e emissão espectros de cada canal, a emissão de esgotamento STED, e direção de imagemção (para cima ou para baixo, se a imagem é 3-dimensional), em particular. </li><li> Deconvolve usando o assistente de deconvolução. As configurações padrão são geralmente adequada, no entanto relação sinal-ruído (SNTR) irá variar de fluoróforo para fluoróforo e terá de ser determinado para cada canal e cada experimento individualmente. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. Custo publicação parcial deste artigo foi custeada pela Leica Microsystems, Inc.

A melhoria na resolução sobre confocal estará um pouco dependente de factores que não podem ser controladas. Esses fatores incluem aberrações menores de espessura lamínula e inconsistências nos meios de montagem. É importante para manter a temperatura e umidade na sala de imagem o mais consistente possível, ea trave STED devem ser realinhados aproximadamente a cada 60 min. Como mencionado em procedimentos, uso de Vectashield meio de montagem deve ser evitado, pois isso não é compatível com STED. Além de que, deve-se sempre usar # 1.5 lamínulas, e se possível, use aqueles que foram verificados para uma espessura específica. Uma modificação do método descrito aqui é a imagem canais adicionais na confocal, utilizando fluoróforos que emitem a um comprimento de onda maior do que o feixe STED. Desta forma, uma imagem pode até quatro canais (dois no confocal, dois em STED). Se esta abordagem, no entanto, os canais com fluoróforos emitting acima do laser de depleção STED terá de ser trabalhada primeiro, como a aplicação do feixe de STED irão esgotar fotões nestes canais. Uma vantagem desta técnica é a aplicação de gating tempo, o que também vai melhorar a resolução em confocal por eliminação de emissão de fotões com vidas curtas 34. Em particular, o uso de gating tempo, o momento de detectores de emissões para corresponder com excitação pulsada STED, vai diminuir a fluorescência de fundo da reflexão off vidro lamela quando imagiologia próximo a ele. Mesmo em um experimento não é adequado para STED, se estiver usando uma fonte de excitação pulsada, gating tempo pode ser uma ferramenta útil para melhorar a resolução em confocal. Há diversas modificações que podem ser utilizadas para melhorar a resolução em STED. Uma é o de diminuir o tamanho do orifício da unidade 1 Airy padrão, embora este também irá diminuir a quantidade de luz que atinge a amostra. Isso pode ser compensado pelo aumento da laspoder er ou ganho. Outra é aumentar a média de linha, o que irá aumentar a quantidade de informação recolhida para cada fóton, melhorando a resolução. Mais uma vez, no entanto, isto pode ser a um custo de fotobranqueamento da amostra, para que um equilíbrio terá de ser atingido entre a resolução e de branqueamento. Da mesma forma, a utilização de proteínas fluorescentes como GFP exigirá optimização cuidadosa para evitar o branqueamento. Isto pode ser conseguido através da redução de potência do laser STED se necessário. Pontos de tempo mais longos, também permitirá uma maior recuperação de fótons e reduzir branqueamento. Correção para fotodegradação devem ser contabilizados na análise ao vivo STED. Claro, a imagiologia em 3 dimensões num STED também é possível, e também vai dar uma melhoria em relação de imagem confocal convencional. Isto é particularmente verdadeiro se for feito em combinação com desconvolução, embora se deva tomar cuidado para corrigir o desvio que ocorre durante a imagiologia em múltiplos planos do eixo z. Se estiver usando software Huygenspara deconvolve, essa correção é obtida usando o recurso de &quot;estabilizar imagem&quot;. Usando esta abordagem, a resolução do eixo z será melhorada. Esta é uma grande melhoria em relação imagem confocal convencional, que tem baixa resolução axial, e até mesmo em apenas STED si, que também tem relativamente baixa resolução eixo z. Ao adquirir várias pilhas em STED, cuidados devem ser tomados para evitar o branqueamento da amostra, e se necessário pode reduzir linha de média intensidade ou potência do laser, a fim de fazê-lo. Novamente, deve-se notar que se a imagiologia outros fluoróforos que não são adequados para STED, a aplicação do feixe de esgotamento na primeira exploração sequencial iria evitar a emissão de estes canais. Portanto, uma abordagem STED / confocal mista (quando se utiliza confocal em canais que emitem a um comprimento de onda superior a 592 nm) que, infelizmente, não ser adequado para 3D. Para resumir, nós escolhemos STED como uma abordagem, devido à sua relativa facilidade de aplicaçãocação e melhoria na resolução sobre imagem confocal padrão. Para geração de imagens da sinapse imunológica, que tem provado uma técnica eficaz e valiosa que nos permite ver detalhes na arquitetura, não é possível F-actina em resolução superior a 200 nm. Enquanto muitos destes detalhes parecem subtil, que pode ter um efeito profundo sobre a função das células NK. Assim, estamos aplicando a mais recente tecnologia de imagem nanoscopic para derivar a informação que é fundamental para a manutenção da saúde humana.

A sinapse imunológica é um meio complexo de proteínas de sinalização e de elementos do citoesqueleto. A sinapse citolítica foi originalmente descrito como tendo um &quot;bulls-eye&quot; como a estrutura com um anel de actina e moléculas de adesão em torno de um domínio central secretor 1-4. No entanto, agora sabemos que ele é composto de domínios microscópicos de sinalização ativa que requerem contínua reorganização do citoesqueleto dinâmico para a função 5-11. Grande parte da informação que temos agora sobre a sinapse foi derivado de microscopia e imunologistas foram os primeiros a adotar a tecnologia de imagem de última geração. Uma novela tal tecnologia é a microscopia de super-resolução. A microscopia de luz convencional é espacialmente limitado pela difracção de barreira de luz, que define o limite inferior de resolução de todos microscopia de fluorescência, incluindo confocal, a cerca de 200 nm. Nos últimos anos, várias técnicas têm sido developed que permitem resolução abaixo da barreira de difração. Estes incluem emissão microscopia estimulação exaustão (STED), microscopia de iluminação estruturada (SIM), microscopia estocasticamente resolvido (STORM) e microscopia de luz fotoactivável (PALM). Estas técnicas foram analisados ​​em detalhe em outro lugar 12-15, mas são descritos abaixo. Subdiffraction resolução limitada é gerada de maneira única em cada sistema. A selecção de uma técnica de super-resolução, por conseguinte, deverá ser ditada pela experiência e sistema experimental de interesse. STED super-resolução é conseguido usando uma alta intensidade torroidal esgotamento trave que seletivamente &quot;silêncios&quot; de fluorescência em torno de cada fluoróforo de juros após excitação, resultando em microscopia de fluorescência limitada subdiffraction 16-18. Uma das vantagens de STED é que a aquisição da imagem é rápida e exige relativamente pouco pós-processamento. Enquanto selecção corante é ditada pela especificaçãotral posição do feixe de esgotamento, o qual no sistema comercialmente disponível está situado em 592 nm, vários corantes disponíveis comercialmente estão disponíveis que fazer combinações de dois fluoróforos possível. Além disso, repórteres fluorescentes vulgarmente utilizados, tais como a GFP pode ser trabalhada, fazendo experiências com células vivas possível 19,20. Nós já usou STED para identificar e quantificar as regiões do hipodensidade F-actina que são utilizados por células NK para degranulação 21,22. Propomos que STED é uma boa escolha para a imagem da sinapse imunológica devido à sua disponibilidade relativamente flexível de fluoróforos e melhora superior na resolução no eixo xy. Além disso, no sistema STED disponível comercialmente utilizada para estas experiências, o uso de um scanner de ressonância de alta velocidade (12.000 Hz) permite a rápida aquisição de imagens com o mínimo de danos às amostras. Flexibilidade limitada na selecção de corante é considerado uma desvantagem dos STED 12,Contudo cor dupla STED é relativamente simples com vários fluoróforos disponíveis comercialmente. A integração de STED com um microscópio confocal de varredura a laser também permite a imagem confocal adicional em combinação com STED, por isso, enquanto STED é limitada a dois canais, estruturas adicionais podem ser visualizados em confocal com resolução de cerca de 200 nm (E. Mace, observações não publicadas ). Enquanto que descrevem a utilização de STED para imagiologia de células imunitárias, esta tecnologia é aplicada a uma variedade de tipos de células, incluindo células neuronais, e para visualização de uma variedade de estruturas celulares 23-26. SIM usa uma abordagem diferente para gerar imagens limitam-subdiffraction. Ao visualizar conhecidos padrões de excitação periódica, a informação pode, então, ser obtida sobre a estrutura desconhecida a ser estudada após transformação matemática 27. Isso gera um aumento na resolução de ~ 100 nm lateralmente 28,29. A vantagem de SIM é que is compatível com todos os corantes confocal padrão e sondas, no entanto, a desvantagem é que é muito mais lento a aquisição de imagens e estas requerem longos pós-processamento 12. Isso também limita o seu uso para imagens de células vivas. Finalmente, as imagens de super-resolução pode ser gerado por foto-estocástico comutação de fluoróforos. Esta abordagem é explorada em microscopia de localização ativado por foto (PALM) e microscopia óptica reconstrução estocástica (STORM). Ao digitalizar vários quadros de câmeras e localização de moléculas ativadas aleatoriamente que estão em &quot;ON&quot; e &quot;off&quot; ao longo do tempo, imagens com resolução de 20-30 nm são gerados a partir de quadros acumulados 30-32. O trade-off para esta resolução é o tempo necessário para adquirir imagens. Aqui nós mostramos, em detalhes, o protocolo para a preparação e imagem amostras de cores duplas em STED. Neste sistema, a excitação é com um pulsada, sintonizável, laser de luz branca. Devido à naturezado feixe de excitação por impulsos, gating tempo de detecção é tornada possível e resolução mais aumentos. Além disso, o sistema é equipado com gadolínio híbrido (HYD) detectores, que são mais sensíveis do que os tubos fotomultiplicadores convencionais, permitindo assim menores requisitos de potência de laser. O feixe de esgotamento para STED é aplicado de forma contínua e é ajustado para 592 nm, o que vai ditar a escolha de tintas disponíveis para duas cores STED. Combinações de corantes mais usados ​​geralmente incluem um excitável por 488 nm (como Alexa Fluor 488, Oregon Verde, DyLights verdes, ou Chromeo 488) e um excitável por 458 nm (como Pacific laranja ou Horizon V500). Assim, enquanto que a detecção dos dois corantes estará numa gama semelhante (e ambos são acessíveis pelo laser de exaustão), a excitação vai ocorrer com diferentes comprimentos de onda. Com um laser de luz ajustáveis ​​e ajustáveis ​​detectores de brancos, maximizando sinal, eliminando sobreposição espectral é feito bastante fácil. Como tal, temos tido um bom sucesso com combinatíons de corantes disponíveis comercialmente, como a Pacific Laranja e Alexa Fluor 488 (usado aqui). O protocolo é adaptado para e descreve a avaliação de células NK humanas, como que representa o foco histórico do nosso laboratório. Estamos a utilizar especificamente a linha de células NK92, neste exemplo, como é que um foi aplicado regularmente no nosso trabalho experimental 21,33.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:602px;" width="602">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:230px;">#1.5 cover slips</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">BD Cytofix/Cytoperm</td>
			<td style="width:222px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:150px;">554722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:222px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Cotton tipped applicator</td>
			<td style="width:222px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">S450941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Falcon centrifuge tubes (50 ml)</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Fetal calf serum (FCS) (500 mL)</td>
			<td style="width:222px;">Atlantic Biologicals</td>
			<td style="width:150px;">S11050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Goat anti-rabbit Pacific Orange</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">P31584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Laboratory tissue wipers</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Nail polish</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">100491-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">NK-92 cells</td>
			<td style="width:222px;">ATCC</td>
			<td style="width:150px;">CRL-2407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Phalloidin Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Prolong anti-fade reagent</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-CD18</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">301202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-NKp30</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">325202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-perforin</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">308102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">RPMI 1640 medium (500 mL)</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Saponin from Quillaja bark</td>
			<td style="width:222px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Super PAP pen</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">008899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:222px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:150px;">22142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Material Name</td>
			<td style="height:27px;">Company</td>
			<td style="height:27px;">Catalogue Number</td>
			<td style="height:27px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Huygens deconvolution software</td>
			<td style="height:27px;">SVI</td>
			<td style="height:27px;">Contact company</td>
			<td style="height:27px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Leica SP8 TCS STED microscope</td>
			<td style="height:27px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="height:27px;">Contact company</td>
			<td style="height:27px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (sted) nanoscopy

Células assassinas naturais formam fortemente regulamentados, sinapses imunológicas afinado (SI), a fim de lisar células infectadas por vírus ou tumorais. Reorganização da actina dinâmica é crítico para a função das células NK e a formação do IS. Imagiologia de actina F na sinapse, tradicionalmente utilizada microscopia confocal, no entanto, o limite de difracção da luz limita resolução de microscopia de fluorescência, incluindo confocal, de aproximadamente 200 nm. Os recentes avanços na tecnologia de imagem permitiram o desenvolvimento de subdiffraction limitada super-resolução de imagem. Para visualizar arquitetura F-actina no IS que recapitular o NK citotóxicas célula sinapse aderindo células NK para ativar receptor em vidro. Em seguida, as proteínas de interesse imagem usando duas cores esgotamento emissão estimulada de microscopia (STED). Isto resulta em &lt;80 nm resolução na sinapse. Aqui nós descrevemos as etapas de preparação da amostra e da aquisição de imagens usando dupla colou STED Nanoscopia visualizar F-actina no NK IS. Também ilustram otimização de aquisição de amostra usando o software Leica SP8 e STED fechado a tempo. Finalmente, nós utilizamos software de Huygens para deconvolução de pós-processamento de imagens.

Claramente, o objetivo principal de super-resolução de imagem será uma melhoria em relação a microscopia confocal convencional. No entanto, existem algumas armadilhas comuns que podem levar à resolução de qualidade inferior. Estes exigem que cada experimento ser otimizados individualmente. Na nossa experiência representativa, estamos a imagiologia da rede de F-actina em células NK activadas por anticorpo ligado ao vidro. As causas mais comuns de (e correcções para) uma falta de resolução melhorada de STED sobre confocal são como se segue: <ol><li> Sub-amostragem (Figura 1a). Isto pode conduzir a granulação e a perda de informação de pixel, como demonstrado pela falta de resolução de filamentos F-actina. O aumento da linha média ou quadro muitas vezes pode corrigir isso. </li><li> O branqueamento e / ou sobre-amostragem (Figura 1b). Isto pode ser causado por longo tempo de permanência de pixel, como uma consequência da linha média excessiva. Alternativamente, pode ser um resultado de um excesso de varrimento da imagem antes da aquisição, incluindo o uso excessivo deo laser de depleção. Isso geralmente resulta em imagens nebulosas ou difusos. Isso pode ser corrigido fazendo a varredura do campo de interesse apenas minimamente antes de adquirir ou, se possível, aumentando a velocidade de varredura a laser. Se o problema persistir, o poder do laser de depleção pode ser reduzido. </li></ol> Ao atingir o equilíbrio correto de tempo de permanência de pixels, potência do laser de excitação, e potência do laser de depleção, uma imagem com melhor resolução e informações suficientes podem ser gerados (Figura 1c). A resolução pode ser ainda melhorada pela utilização de desconvolução (Figura 1d). Quando a aquisição é otimizado, desconvolução irá melhorar a resolução de forma qualitativa e quantitativa e sub-100 nm resolução deve ser rotineiramente atingível. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1.jpg" /> Figura 1. Otimização de aquisição e armadilhas comuns de imagem STED. NK92 células foram ativadas no anti-CD18 e-NKp30 vidro revestido por 20 min, em seguida, fixa, permeabilizadas e coradas para F-actina com Faloidina Alexa Fluor 488. A) Um exemplo de perda de informações de imagem devido a sub-amostragem. b) Um exemplo de perda de resolução devido ao branqueamento / sobre-amostragem c) as condições d optimized) condições otimizadas levam a maior melhoria na resolução com deconvolução. Barra de escala = 5 um.

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Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Aqui, ilustramos o protocolo para a imagiologia por duas cores STED Nanoscopia citotóxica sinapse imune das células NK retomados em vidro. Usando este método, obtemos resolução nm sub-100 de proteínas de sinapses e do citoesqueleto.

Visualização do imunológica Synapse por Dual Color Time-fechado Emissão Estimulada Exaustão (STED) Nanoscopia

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

visualization-immunological-synapse-dual-color-time-gated-stimulated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

77.9K visualizações.  Texas Children's Hospital and Baylor College of Medicine.  Aqui, ilustramos o protocolo para a imagiologia por duas cores STED Nanoscopia citotóxica sinapse imune das células NK retomados em vidro. Usando este método, obtemos resolução nm sub-100 de proteínas de sinapses e do citoesqueleto. 

Vídeo: Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

Esgotamento das populações de células específicas de Esgotamento Complemento

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Imunologia e Infecção

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the flexibility of a VA approach in the analysis of biological datasets. Examples of these datasets in immunology include flow cytometry, Luminex data, and genotyping (e.g., single nucleotide polymorphism) data. Contrary to the traditional information visualization approach, VA restores the analysis power in the hands of analyst by allowing the analyst to engage in real-time data exploration process. We selected the VA software called Tableau after evaluating several VA tools. Two types of analysis tasks analysis within and between datasets were demonstrated in the video presentation using an approach called paired analysis. Paired analysis, as defined in VA, is an analysis approach in which a VA tool expert works side-by-side with a domain expert during the analysis. The domain expert is the one who understands the significance of the data, and asks the questions that the collected data might address. The tool expert then creates visualizations to help find patterns in the data that might answer these questions. The short lag-time between the hypothesis generation and the rapid visual display of the data is the main advantage of a VA approach.

Visual analytics (VA) is a new approach of analyzing data interactively. In this video, we discuss the data overload problem brought on by high-throughput biological experiments, and propose VA as a solution to such problem. The video demonstrates analysis within and between immunological datasets using a VA tool called Tableau.

Facilitar a Análise de Dados com Visual imunológicos Técnicas Analíticas

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

Depleção e reconstituição de macrófagos em Ratos

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Macrófago Colesterol Exaustão e seu efeito sobre a fagocitose de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Super-Resolution Imaging da Célula Natural Killer imunológica Synapse em um vidro com suporte Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Um modelo de celular endotelial Planar for Imaging imunológica Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Análise qualitativa e quantitativa de sinapse imunológica no sistema humano usando a imagem latente de citometria de fluxo

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure that optimizes B-cell receptor (BCR) signaling and BCR-mediated antigen acquisition. Both the remodeling of the actin cytoskeleton and the reorientation of the microtubule network towards the antigen contact site are essential for immune synapse formation. Remodeling of the actin cytoskeleton into a dense peripheral ring of F-actin is accompanied by polarization of the microtubule-organizing center towards the immune synapse. Microtubule plus-end binding proteins, as well as cortical plus-end capture proteins mediate physical interactions between the actin and microtubule cytoskeletons, which allow them to be reorganized in a coordinated manner. Elucidating the mechanisms that control this cytoskeletal reorganization, as well as understanding how these cytoskeletal structures shape immune synapse formation and BCR signaling, can provide new insights into B cell activation. This has been aided by the development of super-resolution microscopy approaches that reveal new details of cytoskeletal network organization. We describe here a method for using stimulated emission depletion (STED) microscopy to simultaneously image actin structures, microtubules, and transfected GFP-tagged microtubule plus-end binding proteins in B cells. To model the early events in immune synapse formation, we allow B cells to spread on coverslips coated with anti-immunoglobulin (anti-Ig) antibodies, which initiate BCR signaling and cytoskeleton remodeling. We provide step-by-step protocols for expressing GFP fusion proteins in A20 B-lymphoma cells, for anti-Ig-induced cell spreading, and for subsequent cell fixation, Immunostaining, image acquisition, and image deconvolution steps. The high-resolution images obtained using these procedures allow one to simultaneously visualize actin structures, microtubules, and the microtubule plus-end binding proteins that may link these two cytoskeletal networks.

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

We present a protocol for using STED microscopy to simultaneously image actin structures, microtubules, and microtubule plus-end binding proteins in B cells that have spread on coverslips coated with antibodies to the B-cell receptor, a model for the initial phase of immune synapse formation.

Visualizando a actina e microtúbulos citoesqueleto na célula B sinapse imune usando microscopia de depleção (STED) emissão estimulada

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both signaling&#160;and antigen uptake are coordinated. IS formation involves dynamic actin remodeling accompanied by the polarized recruitment to the synaptic membrane of the centrosome and associated intracellular organelles such as lysosomes and the Golgi apparatus. Initial stages of actin remodeling allow B cells to increase their cell surface and maximize the quantity of antigen-BCR complexes gathered at the synapse. Under certain conditions, when B cells recognize antigens associated to rigid surfaces, this process is coupled to the local recruitment and secretion of lysosomes, which can facilitate antigen extraction. Uptaken antigens&#160;are internalized into specialized endo-lysosome compartments for processing into peptides, which are loaded onto major histocompatibility complex II (MHC-II) molecules for further presentation to T helper cells. Therefore, studying organelle dynamics associated with the formation of an IS is crucial to understanding how B cells are activated. In the present article we will discuss both imaging and a biochemical technique used to study changes in intracellular organelle positioning and cytoskeleton rearrangements that are associated with the formation of an IS in B cells.

Herein we describe two approaches to characterize cell polarization events in B lymphocytes during the formation of an IS. The first, involves quantification of organelle recruitment and cytoskeleton rearrangements at the synaptic membrane. The second is a biochemical approach, to characterize changes in composition of the centrosome, which undergoes polarization to the immune synapse.

Estudando a dinâmica organelle em células B durante a formação de sinapse imune

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic fever and autoimmune diseases. Since thousands of antibodies with different epitopes are circulating in blood, no universal method, except for the dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF), was reported to target specific harmful antibodies. The development of DCAF molecules makes significant contribution to the progress of targeted therapy, which were demonstrated to eliminate the antibody dependent enhancement (ADE) effect in a Dengue virus (DENV) infection model and to boost the acetylcholine receptor activity in a myasthenia gravis model. Here, we describe a protocol for the synthesis of a DCAF molecule (DCAF1), which can selectively block 4G2 antibody to attenuate ADE effect during Dengue virus infection, and illustrate the binding of DCAF1 to 4G2 antibody by an ELISA assay. In our method, DCAF1 is synthesized by the conjugation of a hydrazine derivative of a Fc-III peptide and a recombinant expressed long &#945;-helix with antigenic sequence through native chemical ligation (NCL). This protocol has been successfully applied to DCAF1 as well as other DCAF molecules for targeting their cognate antibodies.

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) is novel for the elimination of harmful antibodies. Here, we describe a detailed protocol for the synthesis of DCAF1 molecule, which can selectively block 4G2 antibody to eliminate antibody dependent enhancement effect during Dengue virus infection.

Bloqueio de anticorpos direcionados por um conjugado duplo-funcional de peptídeo antigênico e mimetismo FC-III (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...