Este protocolo é significativo, pois permite que você faça imunohistoquímica no notum de Drosophila pupa, mesmo depois de terem sido previamente feridos, e imagens vivas, sem interromper a arquitetura do tecido. Esta técnica permite aproveitar.a ampla gama de manchas de anticorpos já disponíveis.para colorir células, estruturas e proteínas.no epitélio de notum. Usamos essa técnica para imunoquímica e coloração de DNA.
No entanto, essa dissecção poderia ser usada como ponto de partida para outras técnicas, como a hibridização in situ. Este protocolo pode ser difícil, pois a pupa é pequena e delicada, por isso requer uma mão firme para realizar a dissecção. E fica mais fácil com a experiência, então pratique em pupa sem importância antes de importantes.
Comece removendo cuidadosamente de três a quatro pupas no estágio P5, usando um escopo de dissecção, e colete-as no slide do microscópio ao lado da fita. Em seguida, coloque a pupa com pelo menos uma largura de pupa separada, na fita, com seus lados ventral para baixo. Agora, coloque uma gota de cola adesiva em um filme parrafina, ou em uma tampa de tubo de centrífuga.
Em seguida, mergulhe a ponta de pipeta de 0,1 a 10 microliter na gota de cola adesiva, e bata a ponta da pipeta duas vezes em um deslizamento de tampa, um centímetro por um centímetro de distância de um canto, criando uma linha de cola adesiva, aproximadamente metade do comprimento da pupa. Em seguida, predefinir uma pipeta P2 em dois microliters, e uma pipeta P200 a 200 microliters volume, e encaixá-los com pontas. Agora, insira fórceps perto do lado da cabeça, e remova suavemente o máximo possível do estojo do aluno, trabalhando do anterior ao posterior.
Em seguida, segure as pernas em desenvolvimento da pupa, com um par de fórceps contundentes, e puxe cuidadosamente a pupa de seu estojo. Coloque a pupa no canto da tampa. Segure a pupa no abdômen posterior, ou na asa em desenvolvimento, com fórceps contundentes.
Levante e coloque o lado ventral da pupa para baixo, na linha de cola adesiva. Encha rapidamente a pipeta P2, com dois microliters de PBS de força única, contendo 0,1 mililitro de cálcio, e segurando-a no ar, expelir apenas o suficiente para formar uma pequena bolha na ponta. Toque na pequena bolha da solução, para um lado da pupa na base do tórax, em seguida, repita o procedimento do outro lado.
Em seguida, encha a pipeta P200, com 200 microliters de PBS de força única, com 0,1 milimolar de cálcio, em seguida, coloque a ponta da pipeta sobre o tórax, e expulse o conteúdo para submergir completamente a pupa, e o restante da cola adesiva se solidificará imediatamente. Agora, remova aproximadamente 100 microliters da solução PBS, de modo que a pupa mal está submersa, antes de prosseguir imediatamente para o próximo passo. Para dissecar o notum, segure um par de tesouras de micro dissecção, preparando um lado da alça contra o dedo indicador da mão dominante e o dedo médio, de modo que o polegar da mão dominante aplique a força de corte.
Em seguida, estabilize o pescoço da tesoura contra o dedo médio da mão não dominante, enquanto prepara o deslizamento da tampa, com o dedo anelar da mão não dominante. Agora, corte no meio do abdômen dorsal para criar um pequeno buraco de aproximadamente 0,2 a 0,5 milímetros. Para isolar o tecido dorsal, faça pequenos cortes de 0,5 a 0,75 milímetros através do integumento, do posterior ao anterior, e no final, estes cercarão o tecido dorsal.
Além disso, repita posteriormente os cortes anteriores do outro lado da pupae. Gire a etapa de dissecção, para permitir um corte limpo na cabeça, se necessário. Determine se o notum foi isolado, vendo se ele é facilmente movido.
Adicione aproximadamente 200 microliters de PBS de força única ao centro do deslizamento da tampa, e faça um canal conectando-o à gotícula de dissecção original, arrastando suavemente a ponta pipeta através do vidro de cobertura, da nova gota à original. Usando um par de fórceps contundentes, empurre suavemente ou arraste o notum isolado para o centro da tampa e gire, de modo que o lado interno fique de frente para cima. Segure o notum para baixo com fórceps contundentes, pressionando a seção abdominal ou da cabeça.
Usando um par de fórceps afiados e expulsões suaves de PBS de força única, de uma pipeta de 200 microliter, remova qualquer corpo de gordura restante, faixas musculares ou lifting de hemo, para expor o epitélio monocamado totalmente. Uma vez que o tecido esteja limpo, use uma pipeta de 200 microliter para remover o máximo possível da solução PBS, monitorando com o escopo de dissecção, para evitar aspirar o notum. Após a remoção máxima do líquido, use um tecido absorvente, para limpar cuidadosamente o resto da cola adesiva, carcaça da pupila e outros detritos no deslizamento da tampa.
Agora, adicione 150 a 200 microliters de 4% PFA, e fixe por 20 minutos em temperatura ambiente. E dependendo da velocidade de dissecção, mais uma a três pupas podem ser dissecadas, durante a fixação da primeira pupa em deslizamentos de cobertura separados. Remova o PFA e substitua-o por PBS de força única, para lavar o notum uma vez por 30 segundos.
Se continuar com a coloração de anticorpos, realize três lavagens de cinco minutos, em PBS de força única ou PBST, para permeabilizar o tecido se o antígeno estiver intracelular. A amostra pode ser armazenada em PBS de força única, com azida de sódio de 0,02% durante a noite em uma câmara umidificada. Após a coloração, prepare um novo deslizamento de cobertura referido como um topper, com suportes.
Crie uma lacuna de aproximadamente 200 micrômetros, usando espaçadores feitos de 22 por 22 deslizamentos de cobertura, aproximadamente um centímetro de distância, no meio do topper. Para aderir, pinte a costura do espaçador mais distante do centro, com uma fina camada de esmalte, e depois deixe secar. Remova o máximo possível da solução aquosa da amostra e aplique imediatamente duas gotas de meio de montagem anti-fade à amostra.
Se necessário, use fórceps afiados limpos para posicionar o notum no centro de gotícula média de montagem anti-fade. Coloque o deslizamento da tampa com o notum, sobre um suporte de espuma de aproximadamente 10 por 40 milímetros para elevar a amostra para que ela não adere à superfície de trabalho. Sob um escopo de dissecção, abaixe lentamente o topper sobre a amostra.
Uma vez que o meio de montagem anti-fade se encontre com o topper, solte suavemente e permita que a ação capilar puxe o topper para baixo. Coloque outro pedaço de espuma no topper e use um slide de microscópio padrão como peso, para persuadir suavemente o meio de montagem anti-fade entre o deslizamento da tampa da amostra, o topper e os espaçadores. Após 5-10 minutos, use um tecido absorvente para afastar qualquer excesso de excesso de montagem anti-fade, tocando suavemente as bordas do deslizamento de cobertura.
Aplique suavemente esmalte em cada canto da tampa para aderir a eles juntos. Para evitar que o deslizamento da tampa se desperte e danifique o tecido dorsal, evite revestir as bordas primeiro, e uma vez que o esmalte nos cantos se seca, pinte todas as bordas da tampa para selar. Este protocolo permite a imagem das amostras fixas, utilizando anticorpos e manchas celulares.
Este protocolo pode ser usado em amostras que foram previamente feridas e imagens vivas. Uma comparação de imagens ao vivo e fixas mostra que o protocolo preserva a arquitetura tecidual e a morfologia. O protocolo permite diferentes visões de um notum dissecado.
A visão apical é ideal para visualizar bordas e núcleos de células epiteliais, abaixo da cutícula. A visão basal revela melhor as estruturas basais na margem da ferida. Certifique-se de não dobrar ou deformar o notum durante a dissecação.
Corte uma peça plana evitando as bordas laterais. Não corte muito perto dos lados ventral, caso contrário ele se deformará durante a montagem. Após dissecar um notum pupilo, muitas outras técnicas poderiam ser aplicadas, como microscopia eletrônica e seção transversal.
Essas técnicas poderiam permitir que estruturas previamente imagens fossem investigadas em imensos detalhes.
