Agradecemos ao Dr. Nael Alami e Dr. Chul Kim Nam por seus comentários sobre este manuscrito.

1. Preparação para Imunofluorescência: <ol><li> Para criar uma superfície de dissecação, despeje Sylgard 184 Base de Dados de elastômero de silicone em uma pequena placa de cultura de tecidos. Certifique-se de não encher o prato completamente para que a área de dissecção é menor do que o aro. </li><li> Guarnição pinos de dissecação para um comprimento de cerca de 3,5 mm para maior facilidade de manipulação, e certifique-se de ter pelo menos 6 pinos por larva. </li><li> Você vai precisar de uma pinça sem corte que permitirá que você alcance os pinos para a dissecção. </li></ol> 2. Dissecção das larvas: <ol><li> Selecione vagando larvas de terceiro estádio que estão rastejando ao redor dos lados do frasco e não começaram a pupate. </li><li> Coloque uma larva na superfície dissecção sob microscópio estereoscópico. Pavio fora úmido em excesso com um Kimwipe. </li><li> Organizar cada larva de modo que o lado dorsal é voltada para cima. Você será capaz de ver dois traquéia, linhas brancas ao longo do lado dorsal das larvas. Tente centro desses no meio, tanto quanto possível, porque esta marca a linha média dorsal. </li><li> Pin lugar # 1 logo acima da boca ganchos (Figura 1). </li><li> Coloque o pino # 2 na cauda um pouco acima dos espiráculos entre as traquéias. </li><li> Adicionar uma pequena quantidade de PBS para as larvas para evitar a secagem da cutícula. </li><li> Repita os passos acima, com todas as larvas, certificando-se que os genótipos são separados espacialmente, colocando um pino entre cada genótipo. </li><li> Faça um pequeno corte transversal direito acima pin # 2 em ambas as traquéias (Figura 1). </li><li> Insira o seu tesoura no primeiro corte e corte ao longo da linha média dorsal entre as traquéias todo o caminho até o pino passado # 1. </li><li> Você terá de fazer outros cortes pequenos na parte inferior e superior de cada lado da cutícula, de modo que os lados esquerdo e direito irá abrir o que lhe permite fixá-los para baixo, sem puxar a cutícula. </li><li> Coloque o pino # &#39;s 3, 4, 5 e 6 em cada canto. </li><li> Fixar a amostra com PFA 4% para 20-25 minutos em temperatura ambiente </li><li> Decantar a PFA e enxaguar com PBS 3-4 vezes, decantação de cada vez. </li></ol> 3. Remoção de tecido: <ol><li> Comece por retirar tecidos na extremidade posterior, porque normalmente você deseja proteger a área onde o cérebro está localizado. </li><li> Enquanto estiver usando uma steromicroscope e com as larvas em uma gota de PBS, primeiro pegue a extremidade posterior de um dos traquéia e puxe-o que pode remover alguns dos de gordura corporal com ele. Repita o procedimento para a traquéia segundo. </li><li> Pegar alguns do corpo posterior gordura ou intestino e retirá-los da prep. Uma vez que a maior parte do tecido posterior tenha sido removido, o foco na remoção dos tecidos pequenos ao redor do cérebro. Se você está interessado somente nos músculos, ou morfologia do MNJ você pode remover o cérebro também. </li><li> Remoção do cérebro permite uma melhor visualização do músculo 31, que é um marcador útil para orientação segmento abdominal. </li></ol> 4. Imunofluorescência para Zonas de atividade: <ol><li> Adicionar agente de bloqueio (5% soro de cabra normal em PBS) para o preps dissecados no prato dissecção. Bloco para uma hora em temperatura ambiente. Se você gostaria de fazer apenas uma solução para o bloqueio e anticorpos diluições, incluem 0,1% tritonX-100 ao seu agente de bloqueio para permeabilização do tecido. </li><li> Aplicar o anticorpo primário diluído em bloqueio reagente com 0,1% tritonX-100. O anticorpo zona ativa é atingível através do desenvolvimento Estudos Hibridoma Bank (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/). Use um anticorpo de referência (por exemplo, horseradish peroxidase-Cy3 conjugado) para rotular a membrana MNJ e axônios. </li><li> Incubar os anticorpos primários, a 4 ° C durante a noite. De modo que a secura do frigorífico não irá evaporar a solução de anticorpos, criar uma câmara de umidade, colocando um pouco de água no fundo de uma caixa utilizada pipeta ponta. Cobrir a tampa translúcida com folha de alumínio para reduzir fluorescentes de branqueamento. Coloque o slide dissecção na câmara de umidade e colocar a caixa inteira no 4 ° C incubadora durante a noite. </li><li> Na manhã seguinte, lave com PBST (PBS com 0,2% Triton-X-100) 5-10 vezes por 5-10 minutos cada. </li><li> Incube com o anticorpo secundário (por exemplo, Invitrogen Goat Alexa anti-Mouse-488) diluído em bloqueio reagente com 0,1% tritonX-100 à temperatura ambiente por 2-4 horas na câmara de umidade coberto. Incluem uma mancha nuclear (por exemplo, DAPI) no secundário, se você gostaria de identificar a localização do núcleo nos músculos ou cérebro. </li><li> Lavar com PBST (PBS com 0,02% Triton-X-100) 5-10 vezes por 5-10 minutos cada. </li></ol> 5. Amostras de montar o Larval em Slides: <ol><li> Decantar e pavio fora a lavagem PBST passado. </li><li> Pipetar 1mL de glicerol cerca de 80% para cobrir as peles preso larval. </li><li> Remove 5 dos 6 pinos em todas as larvas. </li><li> Quando você está pronto para colocar o genótipo primeiro em um slide remova o pino durar todas as larvas desse genótipope. </li><li> Prepare um &quot;lavar&quot; slide colocando duas gotas de seu meio de montagem sobre uma lâmina limpa. Este passo é importante lavar a solução de água fora das larvas para a montagem e clara imagem. </li><li> Agarre uma larva pela cauda com o fórceps sem corte, arraste a larva em torno do glicerol e, em seguida, ao longo das bordas seca do seu prato dissecção, para remover a maioria dos glicerol. Coloque as larvas na gota primeiro meio de montagem. </li><li> Repita a etapa 6 para todas as larvas do mesmo genótipo. </li><li> Uma vez que todas as larvas estão em queda primeiro meio de fixação, agarre a primeira larva pelo rabo e puxá-lo através da gota e, em seguida, ao longo das bordas do prato seco para remover a maioria do meio. Em seguida, coloque as larvas na gota segundo meio de montagem. </li><li> Repita o passo 8 para todas as larvas com o mesmo genótipo. </li><li> Prepare o seu slide final, rotulando-o e colocando uma pequena forma de &quot;T&quot; de meio de montagem no slide. </li><li> Como no passo 5.8, agarrar a larva pela cauda; puxar a pele através da gota média segundo a montagem e, em seguida, ao longo dos lados da seca &quot;Wash&quot; slide. Depois que a maioria do meio veio fora, coloque o pelt larval no slide final no meio de montagem. </li><li> Repita o procedimento para todas as peles larval. </li><li> Certifique-se de que todas as peles larval são organizados como desejado certificando-se que o lado cutícula é baixo e os músculos expostos é voltada para cima. </li><li> Coloque uma lamínula sobre o slide para cobrir as larvas dissecadas, com a borda de partida na linha superior do &quot;T&quot; </li><li> Coloque um pequeno peso (por exemplo, bateria de 9 volts) na lamínula, certificando-se que o meio de montagem espalha completamente sob a lamínula. </li><li> Para reduzir quenching fluorescentes possível, coloque o slide em uma gaveta ou um espaço escuro até o meio de montagem curou. </li><li> Limpar o meio de montagem que transbordam das bordas da lamínula. Limpe meio secos excesso de montagem na lamínula ou slide com etanol 70%. </li><li> Para criar um selo final, selar com unha polonês. </li></ol> 6. Resultados representativos: Um slide de exemplo de larvas dissecadas e imunocoradas é mostrado na Figura 2. Quando a dissecção larvas, manchas, e de montagem são feitos corretamente, o usuário pode identificar o músculo larvas de interesse (Figura 3) em segmentos A2 A6. Hoang et al. Fornece uma descrição detalhada da posição muscular, bem como caracterização de específicas boutons sináptica (Hoang e Chiba, 2001). Usando um objetivo de alta potência que o usuário possa se concentrar em uma única sinapse e tomar z-stack da imagem. Um representante da imagem de projeção máxima de uma porção de sinapse 07/06 é mostrada (Figura 4). Em seguida, usando software de imagem, as zonas de ativos podem ser quantitativamente avaliados por características que são específicas para o seu fenótipo mutante. Exemplos de recursos que poderá ser alterada em um fenótipo específico mutante incluir o número total, intensidade Fluorescência e espaçamento entre zonas ativo. Armadilhas em potencial: Avaliação de imunofluorescência da junção neuromuscular larval é um sistema valioso que pode fornecer informações valiosas sobre a biologia sináptica, embora haja perigos potenciais que podem limitar a utilidade deste sistema. Por exemplo, freqüentemente é desejável para a imagem do padrão de coloração de dois ou mais anticorpos primários na mesma amostra. A escolha dos anticorpos primários adequados, fluoróforos apropriado e adequado controles negativos é essencial para o sucesso. Se dois antígenos de imagem na sua experiência, a certeza de que os anticorpos primários são de espécies diferentes de modo que cada proteína de interesse pode ser identificado exclusivamente com um anticorpo fluorescente etiquetado secundário. A forma recomendada para reduzir a fundo é a utilização de um agente de bloqueio contendo o soro normal da espécie de que os anticorpos secundários foram derivados (por exemplo, usar soro normal de cabra como um agente de bloqueio quando se utiliza de cabra anti-coelho ou rato anticorpos anti-secundário). Após o planejamento dos anticorpos primário e secundário que você irá usar em sua experiência, você também deve considerar a inclusão de controles na sua coloração sets para garantir que o sinal fluorescente que você está vendo é real e não apenas de fundo. Se possível, inclua amostras de controlo negativas que não contêm a proteína de interesse. Isso é facilmente feito em estudos de superexpressão transgene exógenos, incluindo um animal do tipo selvagem, mas em alguns casos pode ser feito usando um mutante homozigoto de sua proteína de interesse. Outro controle essencial negativo, útil para medir os níveis de fundo de seu sinal fluorescente, é a utilização do anticorpo secundário sem incluir o primário. Quando o seu preps imagem resultante, é importante entender que todos os sinais fluorescentes que você está vendo pode não ser real, e pode ser de fundo de your anticorpos secundários ou de fundo de tecido endógeno. Você pode precisar para normalizar suas imagens a considerar fluorescência de fundo quando se examina as mudanças entre a intensidade de fluorescência. Escolha de fluoróforo também deve ser feita com cuidado. Consideração da excitação e espectros de emissão para cada fluoróforo ea capacidade de detectar exclusivamente cada sinal é essencial para evitar sangrar canal através do. Se há alguma incerteza, uma maneira simples de determinar se a extensão da hemorragia é através immunostain com um anticorpo marcado com fluoróforo de cada vez e verifique a imagem com cada canal que você irá utilizar em sua experiência final. Isso deve revelar se sangrar através está ocorrendo com seu conjunto de microscópio filtro. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Fluxograma de cortar cutícula e colocação de pinos 1-6. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/2676/2676fig1_large.jpg">Clique aqui para ver uma imagem maior</a> <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Colocação de larvas no slide final. Certifique-se que o preps larvas são expostas lado do músculo para cima e para baixo do lado cutícula. Deixe pelo menos uma largura do corpo larval entre cada amostra. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Quando imagem, localize os músculos e segmentos de interesse. Comum junções neuromusculares caracterizadas músculos inervam 07/06, músculo 13, 12 músculos, ou músculo 4. No lado oposto da linha média ventral, há um espelho estrutura muscular imagem do mostrado hemi-segmento. Use Muscle 31 como um marcador para identificar qual o segmento que você está imaginando. A imagem da mesma sinapses e segmentos para o resto de suas amostras, coletando muitas imagens sináptica por genótipo que pode ser usado para a quantificação. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. A imagem de projeção representante máximo de uma porção do músculo MNJ inervam 07/06 é mostrado. NC82 coloração (Bruchpilot) é mostrada em verde. HRP pré-sináptica da mancha é mostrado em vermelho. Observe o punctae zona ativa que pode ser ainda quantificada pelo software de imagem.

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	<li>Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+maturation+and+structural+plasticity+at+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions.</a> Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).</li><li>Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+active+zone+assembly+by+Drosophila+Bruchpilot.">Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot.</a> J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).</li><li>Hoang, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Analysis+of+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Synapses.">Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses.</a> Developmental Biology. 229, 55-70 (2001).</li><li>Keshishian, H., Kim, Y. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+development+and+function:+retrograde+BMP+signaling+in+the+Drosophila+nervous+system.">Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system.</a> Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).</li><li>Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot+Promotes+Active+Zone+Assembly,+Ca2++Channel+Clustering,+and+Vesicle+Release.">Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release.</a> Science. 312, 1051-1054 (2006).</li><li>Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+neuromuscular+junction:+Molecular+components+and+mechanisms+underlying+synaptic+plasticity.">Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity.</a> Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).</li><li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li><li>Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+ALS:+human+ALS-associated+mutation+in+VAP33A+suggests+a+dominant+negative+mechanism.">A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism.</a> PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).</li><li>Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., D&#252;rrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -. C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot,+a+Protein+with+Homology+to+ELKS/CAST,+Is+Required+for+Structural+Integrity+and+Function+of+Synaptic+Active+Zones+in+Drosophila.">Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila.</a> Neuron. 49, 833-844 (2006).</li><li>Zweier, C., Jong, E. K. d. e., Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNTNAP2+and+NRXN1+are+mutated+in+autosomal-recessive+Pitt-Hopkins-like+mental+retardation+and+determine+the+level+of+a+common+synaptic+protein+in+Drosophila.">CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila.</a> Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Para os neurônios, a área terminal sináptico é de fundamental importância, e é a ponte para a comunicação adequada entre o pós e pré-sináptica células. Uma forma poderosa para investigar a saúde do neurônio em modelos de doença é analisar proteínas do terminal sináptico por imunofluorescência. O método de imunofluorescência apresentado aqui permite que o pesquisador examine muitas larvas simultaneamente, limitar as diferenças ambientais entre os grupos. O sistema nervoso central de Drosophila</...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Base de Dados de elastômero de silicone </td><td> Dow Corning </td><td> 68037-59-2 </td><td> Após a mistura permitir bolhas a subir lentamente para fora, colocando em rotator lenta ou permita a sentar-se por 30 minutos ou mais. </td></tr><tr><td> Aço Inoxidável PINs Minutien </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 26002-10 </td><td> Guarnição para aprox. 3-4mm de comprimento, com tesouras regulares </td></tr><tr><td> Pinça laminectomia (Blunt-Usado para agarrar pinos) </td><td> Multa ferramentas da Ciência </td><td> 11223-20 </td><td> Use como uma pinça para agarrar blunt pinos </td></tr><tr><td> Pinça dissecção </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> 501985 </td><td></td></tr><tr><td> SuperFine Tesoura Vannas, 8cm longo </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> Rato de anticorpos anti-Brp </td><td> DSHB </td><td> NC82 </td><td> Use diluição 1:50 </td></tr><tr><td> Cy3 Goat Affinipure Peroxidase Anti-rábano </td><td> Immunoresearch Jackson </td><td> 123-165-021 </td><td> Use a diluição de 1:200 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A11001 </td><td> Use aprox. Diluição de 1:200 </td></tr></tbody></table>

dissection and imaging of active zones in the drosophila neuromuscular junction

As larvas Drosophila junção neuromuscular (MNJ) é um excelente modelo para o estudo da estrutura e função sináptica. Drosophila é bem conhecida pela facilidade de poderosas manipulações genéticas e do sistema nervoso das larvas tem-se revelado particularmente útil no estudo não só a função normal, mas também perturbações que acompanham algumas doenças neurológicas (Lloyd e Taylor, 2010). Muitos dos principais moléculas synaptic encontrados em Drosophila também são encontrados em mamíferos e como a maioria das sinapses excitatórias do SNC em mamíferos, o MNJ Drosophila é glutamatérgica e demonstra dependente de atividade de remodelação (Koh et al., 2000). Além disso, os neurônios Drosophila pode ser identificados individualmente, porque os seus padrões de inervação são estereotipados e repetitivos tornando possível estudo identificou terminais sinápticos, como aquelas entre neurônios motores e as fibras do corpo na parede muscular que eles inervam (Keshishian e Kim, 2004). A existência de componentes sinapse evolutivamente conservadas junto com a facilidade de manipulação genética e física tornar o modelo Drosophila ideal para investigar os mecanismos subjacentes função sináptica (Budnik, 1996). As zonas de ativos nos terminais sinápticos são de particular interesse porque estes são os locais de liberação do neurotransmissor. NC82 é um anticorpo monoclonal que reconhece a proteína Drosophila Bruchpilot (BRP), um membro da família CAST1/ERC que é um componente importante da zona ativa (Wagh et al., 2006). Brp foi mostrado diretamente moldam a zona ativa T-bar e é responsável por efetivamente agrupamento Ca 2 + canais abaixo da densidade de T-bar (Fouquet et al., 2009). Mutantes de Brp reduziram Ca 2 + densidade de canais, a liberação da vesícula deprimido evocada, e plasticidade de curto prazo alterados (Kittel et al., 2006). Alterações às zonas ativas têm sido observadas em modelos de doenças Drosophila. Por exemplo, imunofluorescência usando o anticorpo NC82 mostrou que a densidade zona ativa foi diminuída em modelos de esclerose lateral amiotrófica e síndrome de Pitt-Hopkins (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009).. Assim, a avaliação das zonas de ativo, ou de outras proteínas sinápticas, em modelos de larvas de Drosophila da doença pode fornecer uma pista valiosa inicial para a presença de um defeito sináptico. Preparar toda montagem dissecados larvas Drosophila para análise de imunofluorescência do MNJ requer alguma habilidade, mas pode ser realizado pela maioria dos cientistas com um pouco de prática. Apresentada é um método que fornece para as larvas múltiplos a ser dissecados e imunocoradas no prato dissecção mesmo, limitando as diferenças ambientais entre cada genótipo e fornecer animais suficiente para a confiança na reprodutibilidade e análise estatística.

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Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

A junção neuromuscular (MNJ) de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; É um sistema modelo importante para o estudo da função sináptica normal, assim como perturbações de função sináptica encontrada em certas doenças neurológicas. Nós apresentamos um protocolo para a dissecção da<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval sistema motor e imunomarcação de proteínas zona ativa dentro do MNJ.

Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

dissection-imaging-active-zones-drosophila-neuromuscular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

15.3K visualizações.  St. Jude Children’s Research Hospital. A junção neuromuscular (MNJ) de Drosophila melanogaster É um sistema modelo importante para o estudo da função sináptica normal, assim como perturbações de função sináptica encontrada em certas doenças neurológicas. Nós apresentamos um protocolo para a dissecção da Drosophila Larval sistema motor e imunomarcação de proteínas zona ativa dentro do MNJ.

Vídeo: Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Único Drosophila Dissection omatídeo e Imagem

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Neurociência

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Sequencial de foto-branqueamento de delinear células de Schwann individuais na junção neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Dissecção do Músculo Transversus Abdominis para Análise de Junção Neuromuscular de Montagem Integral

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

Detecção de<em&gt; In Situ</em&gt; Complexos proteína-proteína no<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Junção Neuromuscular Usando Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Por Quantificação Matérias: Caracterização de fenótipos na<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Junção Neuromuscular

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Medir a funcionalidade da junção Neuromuscular

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

Dois Algoritmos para métodos de alta capacidade e Multi-paramétrico Quantificação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Junção Neuromuscular Morfologia

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Macropatch focal gravações das correntes sinápticas da junção Neuromuscular Larval da drosófila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

Dissecção e Imunohistoquímica da Perna Adulta Drosophila para detectar alterações na junção neuromuscular para um neurônio motor identificado

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...