Name: dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster
Uploaded: 2014-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
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Gostaríamos de agradecer a Donald Pronto e Kevin Moisés para ensinar JPK o procedimento de dissecção disco imaginal original. Agradecemos também a Bonnie Weasner para o disco genital na Figura 1B eo disco olho na Figura 2A, Brandon Weasner para a Figura 3, a Bloomington Drosophila da Centro de manchas de moscas e de Estudos do Desenvolvimento Hybridoma Banco de anticorpos. CMS tem sido apoiado por uma bolsa da National Institutes of Health (NIH) GCMS Formação Grant (T32-GM007757), o Frank W. Putnam Research Fellowship, ea Research Fellowship Robert Briggs. JPK é suportado por uma concessão do National Eye Institute (R01 EY014863)

1 Preparação de Larvas <ol><li> Preencha de 35 mm placa de Petri com tampão dissecção. </li><li> Coloque larvas em placa de Petri e permitir-lhes nadar por alguns minutos (etapa de auto-limpeza). </li><li> Transferência das larvas para um tanque de tampão numa placa de dissecação dissecção à base de silicone. Esta associação deve situar-se a aresta da placa. A placa de dissecação consiste de uma solução de silicone, que foi vazada e endurecida dentro de uma placa de Petri de vidro. </li><li> Usando uma pipeta de pasteur-, colocar um conjunto maior de tampão de dissecção no meio da placa de dissecação. </li><li> Usando # 5 fórceps, transferir uma única larva limpo da pequena piscina para a maior piscina de tampão dissecção. </li></ol> 2. Grosso Dissecção de larvas <ol><li> Enquanto a larva ainda está dentro do grande grupo de tampão de dissecção apertar a larva com a pinça. Um par de pinças devem ser utilizados para agarrar os ganchos na boca, enquanto o outro par de pinças é usado para manter o animal ainda (pegue a larva suavemente a 1/3 do comprimento do corpo). </li><li> Prender firmemente o par de fórceps contendo a cutícula perto dos ganchos na boca enquanto rapidamente puxando o resto do corpo de distância com o segundo par de fórceps. </li><li> Quando a larva começa a rasgar você vai sentir uma ligeira liberação de tensão. Solte a larva do fórceps e permitir a &quot;coragem&quot; da larva para derramar. Isto permite que os discos imaginais de permanecer na sua conformação normal e os impede de se deformarem. </li><li> Com um par de pinças de compreender os ganchos na boca de novo para manter a extremidade da frente da larva no lugar. Usando o outro par de fórceps remover a dois terços inferior das larvas, incluindo os intestinos internos. Nota: um complexo contendo os ganchos na boca, os discos de olho-antenal, hemisférios cerebrais, gânglio ventral, as glândulas salivares, alguns discos de perna, ea cutícula sobrejacente permanecerá. </li><li> Com um par de fórceps remover suavemente a cutícula sobrejacente, glândulas salivares, os discos de perna eoutros tecidos. Nota: único tecido que deve permanecer é os ganchos na boca, olho-antenais discos, os hemisférios cerebrais, e gânglio ventral (Figura 3). </li><li> Repita os passos de 2,1-2,5 com larvas adicional para 15-20 min. Nota: Os discos imaginais que permanecem no buffer de dissecção por longos períodos de tempo tendem a se degradar e, finalmente, será exibido com menos de espécimes ideais para ser fotografado. Assim, depois de um máximo de 20 min todos os tecidos dissecados deve ser transferido para o fixador de PLP (ver abaixo). </li></ol> 3 Fixação e coloração de tecidos com anticorpos <ol><li> Usando um Pipetman P-200, transferir os tecidos dissecados para um vidro de relógio contendo frio paraformaldeído-lisina-periodato (PLP) fixador. Limite de volume de tampão de dissecção transferidos para 50 mL para minimizar a diluição do PLP. Certifique-se de cortar a ponta com uma lâmina de barbear para que a abertura da ponta é grande o suficiente para acomodar os tecidos dissecados. Utilizando um par de pinças ouuma agulha de tungsténio assegurar que os tecidos são dissecados completamente submerso na ordem para a fixação adequada para ocorrer. Incubar tecidos dissecados em fixador PLP frio durante 45 min. Esta incubação pode ter lugar à temperatura ambiente sem agitação. </li><li> Usando um Pipetman P-200, transferir os tecidos dissecados para tampão de lavagem (RT), utilizando um outro ponta amarela corte durante 45 minutos. Limite de Volume de PLP transferidos para 50 mL para minimizar a diluição do tampão de lavagem. Nota: todos os tecidos dissecados deve ser completamente submerso. </li><li> Transferir 20-30 conjuntos de tecido dissecado de 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Nota: se um maior número de complexos de discos oculares-antenais são combinados dentro do tubo, existe uma possibilidade de que o tecido na parte inferior do tubo não serão correctamente exposto para os anticorpos. Para melhores resultados, no máximo, 20-30 complexos disco olho-antenas devem estar presentes em um único tubo. O tecido dissecado vai assentar no fundo do tubo de microcentrífuga. Etapas Portanto, em subseqüentes usi, uma pipeta para retirar e substituir o tampão de lavagem, a solução de bloqueio, e os anticorpos. </li><li> Remover o tampão de lavagem e substituir com 100 ul de solução de bloqueio: 10% de soro normal de cabra em tampão de lavagem. Incubar à temperatura ambiente com rotação suave sobre um tampo de mesa rotador durante 10 min. </li><li> Retirar solução de bloqueio e substituir com 100 ul de anticorpos primários que tenha sido apropriadamente diluído em 10% de soro de cabra normal. Incubar à temperatura ambiente com rotação suave durante 16 horas. </li><li> Remover os anticorpos primários e substituir com 750 ul de tampão de lavagem. Colocar os tubos em um nutator e permitir a nutate à TA durante 10 min. Nota: O anticorpo primário pode ser guardado (armazenar a 4 ° C) e depois reutilizado. Reutilizar anticorpos várias vezes pode ajudar na redução da ligação não específica. </li><li> Permitir cabeças para assentar no fundo do tubo, em seguida, remover o tampão de lavagem e adicionar 100 uL de anticorpos secundários que tenham sido apropriadamente diluído em 10% de soro normal. Incubar à temperatura ambiente com rotação suave para 2̵1, 4 h. </li><li> Retirar as soluções de anticorpo secundário a partir de tecido e substituir com 500 ul de tampão de lavagem. Permitir que o tecido se depositem no fundo do tubo. </li><li> Usando um P-200 e uma ponta amarela corte, transferir todos os tecidos dissecados para uma piscina de tampão de lavagem que tenha sido colocado no prato de dissecação. Enquanto prosseguir com o próximo passo da dissecção fina, o tecido vai incubar em tampão de lavagem. Isto ajuda a remover o excesso de anticorpos secundários. </li></ol> 4. Belas Dissecção da Complexos Disco Eye-antenal e montagem em lâminas <ol><li> Use um par de pinças para apertar a cutícula pelos ganchos na boca com o lado ventral do complexo virada para baixo. Com um segundo par de fórceps remover os dois lobos cerebrais, fechando a segunda pinça no espaço entre os discos do cérebro e do olho (Figura 3, a seta vermelha) e puxando rapidamente o cérebro longe dos ganchos na boca. </li><li> Embora continuando a agarrar os ganchos na boca, belisqueo tecido tão perto quanto possível a ligação entre a secção da antena do disco olho-antenais e os ganchos na boca (Figura 3, seta azul). Nota: os complexos de discos olho-antenas deve ser livre de todo o tecido (Figura 1A). Continuar até que todo o tecido desejado desejado que pode ser colocado em lâminas foi dissecado. Este protocolo pode ser adaptado para isolar asa, haltere, perna e discos imaginais genital (Figura 1B-E). </li><li> Adicionar dois pequenos pedaços de papel de seda (tamanho das lamelas) de aproximadamente 3. Além do prato de dissecação. Coloque uma lâmina de vidro sobre o prato - os dois pedaços de papel de tecido deve ser de acordo com as extremidades da corrediça. Isso impedirá que o slide de degola para a base de silicone do prato de dissecação. </li><li> Usando um P-20 com uma ponta sem cortes, adicionar 9 ul de um agente anti-branqueamento para o meio da lamela de microscópio de vidro. Isto impede que o branqueamento do tecido quando visualizado com fluorescenteluz. </li><li> Usando a mesma ponta sem cortes, reunir todos os discos olho-antenal e adicioná-los à gota de reagente anti-branqueamento. Minimizar a quantidade de tampão de lavagem que é transportado. Tentar limitar a quantidade de solução de lavagem de 10 ul ou menos. </li><li> Use uma pinça para separar e espalhar-se os discos de olho-antenal dentro da gota de reagente anti-branqueamento. Permitir que os discos a incubar em reagente anti-branqueamento por vários minutos. Nota: Os discos ficará clara como o tecido absorve o reagente anti-branqueamento. </li><li> Usando um pincel fino delicadamente abaixar uma lamela sobre a amostra. Isto evita a formação de bolhas de ar. </li><li> Loja desliza a -20 ° C até que esteja pronto para ver os discos imaginais olho-antenais ou outros que utilizam luz ou microscopia fluorescente. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Embora este procedimento concentrou-se principalmente sobre o isolamento e tratamento subsequente dos discos de olho-antenais e que é passível de ser utilizado para isolar e analisar a asa, haltere, perna e discos genital (Figura 4). A única modificação necessária do protocolo para isolar estes discos (em oposição ao disco olho-antenal) é o método de dissecação grosseira (seção 2 do protocolo). A primeira perna (T1) par torácica é encontrada na anterior da larva e pode ser recuperado, se...

Por mais de um século, a mosca da fruta, Drosophila melanogaster, tem sido um sistema premier para estudar o desenvolvimento, comportamento e fisiologia. Desenvolvimento na mosca pode ser dividido em duas grandes etapas: embrionárias e pós-embrionárias com muito de este último ter lugar dentro de monocamada epitélios chamados discos imaginais 1-3. Desenhos de discos imaginais foram publicados pela primeira vez em 1864 por August Weismann como parte de sua ampla monografia sobre o desenvolvimento do inseto 1. Estes discos começam a se desenvolver durante a embriogênese, são modelados durante os estágios larvais, sobreviver à histólise maciça dos pupa primeiros, e, finalmente, dar origem a uma elevada percentagem de estruturas adultas que são encontrados dentro da mosca adulta 1-14. Durante o desenvolvimento larval cada disco faz várias decisões críticas sobre o destino, forma e tamanho. Dentro do primeiro e segundo estágios larvais, os discos têm a tarefa de adotar um destino primário, establishing limites dos compartimentos, adotando a forma correta e gerar o número necessário de células 15-16. Durante o terceiro estágio larval e início do estágio de pré-pupa, os discos imaginais continuam a se dividir e são modelados como células adotar seus destinos terminal 16. Durante o início da história da biologia do desenvolvimento Drosophila, discos imaginais foram estudados quase exclusivamente no contexto do desenvolvimento normal e nos casos limitados em que a perda ou mutante ganho de função era viável. A utilização de Raios-X para induzir a recombinação mitótico permitido para mutações letais para ser analisada em clones de células no interior dos tecidos de larvas e de adultos. Este método tem sido melhorada através da introdução de métodos transgênicos para analisar a perda e ganho de função de mutações em ambos os tecidos larvais e adultas. O número de anticorpos, repórteres de transcrição e de proteínas armadilhas para descrever a paisagem molecular de tipo selvagem e mutantes de tecidos é também constantly crescente. Usando esses marcadores moleculares para analisar a perda e ganho de função clones de células mutante tornou cada vez mais viável para obter uma compreensão em tempo real de como as células mutantes se desviar de seus primos de tipo selvagem durante o desenvolvimento. Para aproveitar de forma adequada essas ferramentas e reagentes é fundamental ter preparações de alta qualidade de discos imaginais que podem ser vistos, fotografados e analisados. O objetivo deste manuscrito é proporcionar um protocolo optimizado para o isolamento e a preparação do complexo de disco olho-antenal (Figura 1A). Também pode ser utilizado com êxito para isolar uma grande variedade de discos adicionais, tais como aqueles que dão origem às asas, pernas halteres, T1-T3 e os órgãos genitais (Figura 1B-E). Este procedimento, com pequenas modificações, foi usado para isolar discos imaginais de Drosophila por quase 80 anos. Como descrito acima, uma vez que a maioria dos genes são expressos durante multiple fases de desenvolvimento e de uma grande variedade de tecidos, ela é muitas vezes impossível para estudar os efeitos que os mutantes nulos tem em todo o olho, o animal morre muito antes do estágio de larva de terceiro instar. Quatro métodos de ter feito o estudo dos tecidos mais desenvolvidos, como a retina significativamente mais tratável. A primeira é o método flipase (FLP) / flipase Recombinação alvo (FRT) de geração de clones de células mutantes dentro de uma outra forma de tecido tipo selvagem 17-19. Neste exemplo, o tecido mutante é identificado pela ausência de um marcador visual tal como uma Proteína Fluorescente Verde (GFP) e pode ser comparado com o tecido circundante do tipo selvagem, em que está presente a GFP (Figura 2D). A segunda é o método &quot;flp-out&quot; em que um transgene é expresso numa população de células 20. Neste exemplo, os clones de células são identificadas pela presença de GFP e em comparação com o tecido circundante do tipo selvagem que não possui o repórter GFP (Figura2E). A terceira é a Análise mosaico com uma técnica de marcador de células reprimível (MARCM), que combina elementos do clone mutante FLP / FRT e sistemas de expressão flp-out 21. Com este método de um transgene podem ser expressas dentro de uma população de células que são simultaneamente mutante para um locus genético individual. Como os clones flp-out, MARCM clones são identificados pela presença de GFP e comparado com o tecido circundante do tipo selvagem que não possui o marcador GFP (Figura 2F). E, por fim, as construções de genes e de ARNi pode ser expresso em tecidos imaginais sob o controlo de construções de promotor GAL4-específicos. Estes quatro métodos têm aumentado o interesse em estudar discos imaginais desde clones ou padrões mutantes ou sobre-expressão pode ser directamente comparada com o tecido adjacente de tipo selvagem. O método descrito neste procedimento foi desenvolvido para que os pesquisadores que estudam o desenvolvimento pós-embrionário de tecidos adultos em Drosophila,particularmente aquelas derivadas a partir do disco de olho-antenais e será capaz de se obterem tecidos de alta qualidade para a análise. Embora os pesquisadores individuais fizeram pequenas modificações, o cerne deste processo (que descrevemos aqui) se manteve praticamente inalterado. Desde a obtenção de tecido de alta qualidade é fundamental para o estudo dos discos imaginais Esperamos que este protocolo escrito e vídeo que acompanha irá servir como um recurso valioso de ensino.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5 KG</td><td>Used to create base for dissection plate</td></tr><tr><td>Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm</td><td>Dow Corning</td><td>3160-152CO</td><td>Use the cover for dissection plate</td></tr><tr><td>#5 Dissecting Forceps</td><td>Ted Pella</td><td>525</td><td>Forceps must be kept very sharp</td></tr><tr><td>9 well watch glass</td><td>Vairous Vendors</td><td></td><td>Used for fixation of imaginal disc complexes</td></tr><tr><td>50 ml Erlenmeyer Flask</td><td>Various Vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small Stir Bar</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Small enough to fit into Erlenmeyer Flask</td></tr><tr><td>50 ml Conical Tubes</td><td>Various Vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microfuge Tubes</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Clear or Dark depending upon application</td></tr><tr><td>Microfuge Rack</td><td>Various Vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchtop Rotator</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>100 &amp;#956;l volume should not splatter at low setting</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Macron Chemicals</td><td>2-26555-1</td><td>Serves as fixative</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-3139</td><td>Used to make dissection and wash buffers</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>71636</td><td>Used to make dissection and wash buffers</td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Acros Organics</td><td>125221000</td><td>Used in the fixative solution</td></tr><tr><td>Sodium Periodate</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-1878</td><td>Used in the fixative solution</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Chemicals</td><td>MTX1568-1</td><td>Used to perforate imaginal discs</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>EM Science</td><td>SX0593-3</td><td>Used to dissolve paraformaldehyde</td></tr><tr><td>100% Normal Goat Serum</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005-000-121</td><td>Serves as a blocking solution</td></tr><tr><td>Primary Antibodies</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer</td></tr><tr><td>Secondary Antibodies</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Molecular Probes</td><td>H-1000</td><td>Prevents bleaching of samples</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fischer Scientific</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>Glass Cover Slips 18 x 18 mm</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe Tissue</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Prevents Glass slides from adhering to silicone base</td></tr><tr><td>Panit Brush 000</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Use to gently lower coverslip on to samples</td></tr></tbody></table>

dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster

Uma parcela significativa do desenvolvimento pós-embrionário na mosca da fruta, Drosophila melanogaster, ocorre dentro de um conjunto de estruturas de saco-como chamados discos imaginais. Estes discos de dar origem a uma elevada percentagem de estruturas de adulto que são encontrados dentro da mosca adulta. Aqui nós descrevemos um protocolo que foi otimizado para recuperar estes discos e prepará-los para a análise com anticorpos, repórteres de transcrição e armadilhas de proteína. Este procedimento é o mais adequado para os tecidos finos como discos imaginais, mas pode ser facilmente modificado para utilização com tecidos mais espessos, tais como o cérebro adulto e ovário de larvas. O protocolo escrito e vídeo que acompanha irá orientar o leitor / espectador através da dissecção de larvas de terceiro estádio, a fixação de tecidos e tratamento de discos imaginais com anticorpos. O protocolo pode ser utilizado para dissecar discos imaginais de jovens larvas de primeiro e segundo instar, bem. A vantagem deste protocolo é de que é relativamente curta e tem seren optimizado para a preservação de alta qualidade do tecido dissecado. Outra vantagem é que o processo de fixação, que é empregue funciona bem com o número esmagadora de anticorpos que reconhecem as proteínas de Drosophila. Em nossa experiência, há um número muito pequeno de anticorpos sensíveis que não funcionam bem com este procedimento. Nessas situações, o remédio parece ser a utilização de um cocktail de fixação alternativo, continuando a seguir as orientações que temos estabelecidos para as etapas de dissecação e incubações de anticorpos.

O método que é descrito acima, de forma fiável produz material de alta qualidade para a análise com sondas in situ, nos repórteres de transcrição, armadilhas de proteínas e anticorpos. Na Figura 1 exibir discos olho-de antena, genitais, asa, haltere e pernas que são rotineiramente recuperados com este método. Estes discos foram tratados com um fluoróforo faloidina-conjugado, que se liga à actina F e, por conseguinte, define cada célula. Se o tecido tiver sido fixado correctamente, ...

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Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Dissecção e Imunocoloração do Imaginário discos de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

dissection-immunostaining-imaginal-discs-from-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

26.6K visualizações.  Indiana University. The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Vídeo: Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissecção do CNS Larval em Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biologia

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

Dissecação de discos imaginais de 3 larvas Drosophila Instar

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Neurociência

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Biologia do Desenvolvimento

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Imagens ao vivo da migração das células da glia no Disco Drosophila Eye Imaginal

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Dissecção e imunohistoquímica de larvas, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries made using this system have taken advantage of the spatiotemporal nature of photoreceptor differentiation in the developing eye imaginal disc. To use this system it is first necessary for the researcher to learn to identify and dissect the eye disc. We describe a novel RFP reporter to aid in the identification of the eye disc and the visualization of specific cell types in the developing eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc from third instar larvae and describe how the eye-RFP reporter can aid in this dissection. This eye-RFP reporter is only expressed in the eye and can be visualized using fluorescence microscopy either in live tissue or after fixation without the need for signal amplification. We also show how this reporter can be used to identify specific cells types within the eye disc. This protocol and the use of the eye-RFP reporter will aid researchers using the Drosophila eye to address fundamentally important biological questions.

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

We describe a novel red fluorescent protein (RFP) reporter that is expressed specifically in the Drosophila eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc and how this reporter can be used to aid in the dissection and identification of specific cell types in the developing eye.

A Novel Reporter RFP para ajudar na visualização do Disco Imaginal Eye em Drosophila</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the developmental mechanisms that generate neural diversity and drive circuit assembly. Given its complex three-dimensional organization, analysis of the optic lobe requires that one understand how its adult neuropils and larval progenitors are positioned relative to each other and the central brain. Here, we describe a protocol for the dissection, immunostaining and mounting of larval and adult brains for optic lobe imaging. Special emphasis is placed on the relationship between mounting orientation and the spatial organization of the optic lobe. We describe three mounting strategies in the larva (anterior, posterior and lateral) and three in the adult (anterior, posterior and horizontal), each of which provide an ideal imaging angle for a distinct optic lobe structure.

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

This protocol describes three steps to prepare larval and adult Drosophila optic lobes for imaging: 1) brain dissections, 2) immunohistochemistry and 3) mounting. Emphasis is placed on step 3, as distinct mounting orientations are required to visualize specific optic lobe structures.&#160;

Dissecção, imuno-histoquímica e montagem de cérebros de larvas e adultos de Drosophila para visualização do lobo óptico

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila Imunohistoquímica Abdomen Pupal

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Dissecção e montagem de<em&gt; Drosophila</em&gt; pupais Discos Eye

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...

Dissecção e Imunocoloração do Imaginário discos de

Resumo

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