Descrevemos nosso protocolo para isolar células-tronco mesenquimais do tecido do cordão umbilical humano e um método robusto para diferenciá-las em linhagem muscular esquelética. Esta técnica nos permite isolar células-tronco mesenquimais que possuem alta viabilidade e calor, com pouca ou nenhuma contaminação de células de origem endotelial e induzir a diferenciação miogênica de forma eficiente nessas doenças. A torção do cabo e a consistência mucoide dificultam o manuseio do cabo.
Mostramos como processar o cordão, não raspar a geleia do Wharton, e excluir células endoteliais da população. Depois de coletar o tecido do cordão umbilical no momento da entrega, transfira a peça de tecido do cordão um tubo de coleta para um prato tratado de cultura de tecido de 10 centímetros quadrados e lave o tecido cuidadosamente com PBS fresco. Para cuidar da torção do cordão e da superfície mucoide, fixar o tecido com um par de fórceps em uma mão.
Usando um bisturi, corte o tecido do cordão verticalmente ao longo de seu acesso longitudinal para obter duas peças cilíndricas. Neste ponto, observe as artérias e veias umbilicais. Usando um bisturi, remova os vasos sanguíneos raspando-os em uma direção da superfície e enxágue o tecido do cordão umbilical na PBS para remover todo o sangue residual associado ao tecido.
Pique cada metade do tecido do cordão em fragmentos de 0,5 centímetros cúbicos. Coloque os fragmentos com a superfície luminal voltada para baixo sobre o prato e incubar o prato brevemente por 10 minutos. No final da incubação, adicione 20 mililitros de médio contendo modificação MEM Alpha suavemente ao longo das laterais do prato contendo o tecido do cordão umbilical.
Certifique-se de que as explantas não sejam desalojadas de sua orientação e adicione o excesso de meio para explicar uma fração que as explantas teciduais absorverão durante a incubação. Em seguida, coloque o prato na incubadora por três dias. Após o término da incubação, adicione meio fresco à cultura e garanta que as culturas estejam protegidas contra choques e movimento das explantas enquanto manuseam os pratos.
Após uma semana, usando fórceps estéreis, remova os fragmentos de tecido individualmente e descarte-os usando sacos de risco biológico apropriados para descarte. Mantenha o meio existente e adicione 10 mililitros de meio de crescimento fresco. Substitua o meio de crescimento a cada quatro dias até que colônias individuais atinjam uma confluência de 70% Após a coloração das células descritas no manuscrito, analise as células rotuladas por citometria de fluxo e determine a porcentagem de células positivas CD105 CD90 e CD105 CD73 positivo.
Analise as células negativas CD105 e CD34 CD45 em separado. Cubra a placa de cultura tecidual com colágeno de 0,01% e 20 microgramas por mililitro laminina na PBS e coloque-a no roqueiro por um mínimo de quatro horas em temperatura ambiente. Após a incubação, remova o colágeno e lave a placa com PBS, em seguida, abome os UMSCs a 10.000 células por centímetro quadrado de densidade no meio de crescimento.
Uma vez que as células atinjam 70% de confluência, aspire o meio de crescimento e enxágue a placa de cultura duas vezes com PBS. Para determinar a cinética da progressão miogênica, adicione m1 médio a cada dois dias às culturas e analise uMSCs para a expressão de pax7, MyoD, miogenina e miosina cadeia pesada em dois dias, quatro a cinco dias, seis a sete dias, e dez a quatorze dias, respectivamente. os uMSCs exibem a expressão de CD105 e CD90, e não expressam marcadores hematopoiéticos CD34 e CD45.
Os uMSCs também foram positivos para a expressão do marcador uMSCs CD73, indicando que os uMSCs expressaram vários marcadores-chave. uMSCs mostraram expressão de pax7 nos dois primeiros dias da adição de M1, seguido pela expressão MyoD nos primeiros quatro dias da adição de M1. As células expressam proteína de miogenina aos seis dias de diferenciação, seguida pela expressão da cadeia pesada de miosina entre 10 dias e 14 dias da indução da diferenciação.
970 genes foram regulados em resposta à indução da diferenciação miogênica em comparação com os uMSCs indiferenciados. Mais genes miogênicos foram regulados em uMSCs derivados do tecido do cordão umbilical em comparação com uMSCs derivados do sangue do cordão umbilical. Tanto o tecido do cordão umbilical quanto o sangue do cordão umbilical apresentaram regulação de genes relacionados às proteínas citoesquelletal, associados à ligação de actina e à montagem de sarcomere, transportadores associados à função contratil, manutenção da massa muscular, sinalização de cálcio e função enzimática.
Recolher o tecido em condição asséptica e manter a cultura estéril. O cabo deve ser varrido externamente com 70% de etanol e processado o mais rápido possível. Muitas terapias regenerativas requerem um grande número de células de passagens precoces.
Também pode ser usado como modelo para imitar todo o ambiente seco e refletir o metabolismo pós-natal.
